Een fotodynamische benadering om de functie van intracellulaire vesikelruptuur te bestuderen
17 maart 2023
AlPcS2a-gemedieerde chromofoor-geassisteerde laserinactivatie (CALI) is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van spatiotemporale schade van intracellulaire blaasjes (IV's) in levende cellen.
Endocytose van blaasje in cytoplasie resulteert in de vorming van intracellulaire blaasjes. Permeabilisatie van blaasjes activeert verschillende signaalroutes. Chromofoor-geassisteerde laserinactivatie wordt gebruikt om de gevolgen van intracellulaire vesikelruptuur te bestuderen.
Een ruimtelijke en temporele controle van subcellulaire schade aan intracellulaire blaasjes kan worden bereikt door de staande toestand en lichtverlichting aan te passen. Om te beginnen, handhaaf HeLa-celcultuur in DMEM aangevuld met 10% FBS. Na het wassen van de cellen met PBS, trypsinize de cellen.
Resuspendeer vervolgens de cellen in DMEM aangevuld met 10% FBS. Verdun 300 nanogram Gal3-GFP plasmide in 25 microliter gereduceerd serummedium. Voeg vervolgens 0,6 microliter P3000-reagens toe.
En voorzichtig mengen, gevolgd door vortexing van de oplossing. Verdun 0,45 microliter Lipofectamine 3000-reagens in 25 microliter gereduceerd serummedium en meng voorzichtig. Incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.
Meng vervolgens verdund DNA en verdund Lipofectamine 3000 en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na het mengen van het DNA-lipofectaminemengsel, 300.000 gesuspendeerde HeLa-cellen en 200 microliter DMEM met 10% FBS, zaaien de cellen op het centrale glasgebied van een glazen knopschaal van 35 millimeter. Om celaanhechting mogelijk te maken, incubeer je de cellen bij 37 graden Celsius in de incubator die gedurende ten minste vier uur wordt geleverd met 5% koolstofdioxide.
Verdun AlPcS2a in DMEM aangevuld met 10% FBS om een één micromolaire AlPcS2a-oplossing te maken. Verwarm het AlPcS2a bevattend medium voor in een waterbad van 37 graden Celsius en vervang het kweekmedium door het AlPcS2a-bevattende medium. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in de incubator die 's nachts van 5% koolstofdioxide wordt voorzien.
Was de cellen de volgende dag tweemaal met PBS om extracellulaire AlPcS2a te verwijderen na het vervangen van het medium door vers medium. Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende vier uur om resterende kleurstof langs de endocytische route te laten accumuleren in lysosomen. Om afzonderlijke cellen te manipuleren door lysosomen te beschadigen, plaatst u de kweekschaal op het podium van een confocale microscoop.
Gebruik de lasers van 488 nanometer en 561 nanometer voor respectievelijk spannende GFP en AlPcS2a. Omcirkel een vierkant gebied van vijf bij vijf micrometer op de AlPcS2a-gelabelde blaasjes die zijn geselecteerd om te worden beschadigd. Vervolgens verlicht puls het gebied van belang met een 633 nanometer laser van 0,21 milliwatt, of 70 herhalingen.
Controleer de vorming van Gal3 puncta als een indicator van lysosomale membraanpermeabilisatie. Lysosomale kleuring met AlPcS2a in HeLa-cellen werd uitgevoerd met behulp van in de handel verkrijgbare markers en werd positief gekleurd met groene fluorescerende kleurstof. Lysosomen in TagRFP-Galectin3 tot expressie gebrachte HeLa-cellen werden gekleurd met AlPcS2a.
Gevolgd door focusverlichting met nabij-infrarood licht, geven de resultaten aan dat AlPcS2a-gebaseerde chromofoor-geassisteerde laserinactivatie in staat was om lokale lysosomale breuk binnen het interessegebied te beheersen, waardoor de rest van de lysosomen intact bleef. Deze stap is belangrijk omdat de incubatietijd staande endosomen of lysosomen zal bepalen. Mensen kunnen bijvoorbeeld de grootte bepalen door het vrijkomen van membraan-ondoordringbare kleurstof.
Kan ook pH-gevoelige kleurstoffen zoals FITC dextrans gebruiken om endosomen en lysosomen te verschillen. Deze techniek is nuttig om de stroomafwaartse effecten van intracellulaire vesikelmembraanruptuur te starten. En er zijn stroomafwaartse effecten onder verschillende situaties.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Chromofoor-ondersteunde laserinactivatie (CALI) via AlPcS 2a wordt gebruikt om de spatiotemporele schade aan intracellulaire vesicles in levende cellen te onderzoeken. Deze techniek maakt een nauwkeurige controle over subcellulaire schade mogelijk, waardoor inzicht wordt verkregen in de gevolgen van vesicle-ruptuur.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Celbiologie
- Neurowetenschappen
- Live cell imaging
Achtergrond
- Endocytose leidt tot de vorming van intracellulaire blaasjes.
- Permeabilisering van blaasjes activeert verschillende signaleringspaden.
- CALI is een methode om de effecten van het openspringen van blaasjes te bestuderen.
- Ruimtelijke en temporele controle wordt bereikt door middel van lichtbestraling.
Doel van de studie
- Om de dynamiek van intracellulaire vesikelschade te onderzoeken.
- Om de signaleringspaden te begrijpen die worden geactiveerd door het scheuren van vesikels.
- Om technieken voor het bestuderen van interacties in levende cellen te verfijnen.
Gebruikte methoden
- Kweek van HeLa-cellen in DMEM met 10% FBS.
- Wassen van cellen met PBS voorafgaand aan de experimenten.
- Trypsinisering van cellen voor analyse.
- Toepassing van CALI om gelokaliseerde schade te induceren.
Belangrijkste resultaten
- Effectieve controle over vesikelschade aangetoond.
- Belangrijke signaleringsroutes geïdentificeerd die na ruptuur worden geactiveerd.
- Het gebruik van CALI gevalideerd in studies met levende cellen.
- Inzichten verschaft in de mechanismen van de vesikelfunctie.
Conclusies
- CALI is een waardevol instrument voor het bestuderen van intracellulaire dynamiek.
- De bevindingen verbeteren het begrip van vesikelgerelateerde signalering.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methoden voor diepere inzichten.
Veelgestelde Vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Chromofoor-geassisteerde laserinactivatie (CALI) maakt een precieze, spatiotemporele inductie van intracellulaire blaasjesruptuur mogelijk, wat een gecontroleerd systeem biedt om membraanpermeabilisatiegebeurtenissen te onderzoeken. Deze aanpak ondersteunt mechanische risicoreductie en doelwitvalidatie door selectieve manipulatie en monitoring van de endosomale en lysosomale integriteit in levende cellen mogelijk te maken. De methode vergroot het voorspellende vertrouwen in vroege ontdekkingsfasen door blaasjesruptuur te koppelen aan downstream signalering en moleculaire rekrutering.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe onderzoek naar de integriteit van het vesikelmembraan en de rol daarvan in signaleringspaden mogelijk.
- Ondersteunt de functionele validatie van de rekrutering van glycaanbindende eiwitten, zoals galectine-3, na ruptuur van het vesikel.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door de effecten van gerichte permeabilisatie van organellen te isoleren.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een platform voor de ontwikkeling van kwantitatieve, op beeldvorming gebaseerde assays om vesikelruptuur en moleculaire rekrutering te monitoren.
- Ondersteunt de standaardisatie van assays door gecontroleerde, gelokaliseerde inductie van membraanpermeabilisatie.
- Maakt reproduceerbare evaluatie mogelijk van de effecten van verbindingen op de endosomale en lysosomale stabiliteit.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelevante modellen waarin de integriteit van blaasjes van invloed is op cellulaire signalering en pathologie.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie door studies naar downstream-effecten van blaasjesruptuur mogelijk te maken.
- Faciliteert risicogestuurde beslissingen voor verdere ontwikkeling door mechanistisch inzicht te bieden in cellulaire responsen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze fotodynamische benadering integreert in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door hypothese-gestuurde manipulatie en uitlezing van vesikelrupturevenementen mogelijk te maken.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten over de rol van vesikelpermeabilisatie bij signalering en eiwitwerving.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare imaging-outputs voor assayontwikkeling en evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Biedt meetbare eindpunten, zoals de vorming van galectine-3 puncta en kleurstofvrijgave voor comparatieve analyse.
- Translationeel onderzoek: Verbindt mechanistische bevindingen met ziekte-relevante cellulaire modellen waarbij vesikelruptuur betrokken is.
- Enterprise Reuse: Biedt een herbruikbaar, modulair platform voor het bestuderen van membraandynamiek in diverse celtypen en condities.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar vesikel-gerelateerde signalering.
- Operationele waarde: Standaardiseert de inductie en meting van vesikelruptuur voor reproduceerbare resultaten.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door de functionele gevolgen van membraanpermeabilisatie te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk van targets en pathways die worden beïnvloed door de integriteit van vesikels.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in live-cell imaging en fotodynamische manipulatie.
- Vereist toegang tot confocale microscopie en laserverlichtingsinfrastructuur.
- Vraagt om standaardisatie van imaging- en analyseprotocollen tussen teams.
- Aanpasbaar aan diverse cellijnen en organelmarkers met passende controles.
- Afhankelijk van nauwkeurige kalibratie van laserparameters en kleurstofconcentraties voor reproduceerbaarheid.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Transfection and AlPcS2a Staining
3:00
Sample Imaging and Light Illumination
3:47
Results: AlPcS2a-Mediated Chromophore‐Assisted Laser Inactivation for Studying patiotemporal Damage of Intracellular Vesicles in Live Cells
4:25
Conclusion
