Name: Genetische screening voor identificatie van multicopy suppressors in Schizosaccharomyces pombe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: Leer een multicopy suppressor screen uitvoeren in Schizosaccharomyces pombe om genetische interacties te identificeren. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van genfunctie en biologische processen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door een onderzoekssubsidie van het Department of Biotechnology, Government of India (Grant No. BT/PR12568/BRB/10/1369/2015) naar Nimisha Sharma. De auteurs bedanken Prof. Charles Hoffman (Boston College, USA) voor de schenking van de S. pombe cDNA bibliotheek en Prof. Susan Forsburg voor de gist plasmiden.

1. Transformatie van de cDNA-bibliotheek in de query S. pombe mutant strain om te screenen op multicopy suppressors
OPMERKING: De standaard lithium-acetaatmethode27 werd gevolgd om de S. pombe cDNA-bibliotheek om te zetten in de query S. pombe ell1Δ-stam met een paar wijzigingen:
<ol><li>Kweek de S. pombe ell1Δ-stam bij 32 °C op een YE-medium (tabel 1) plaat aangevuld met 225 μg/ml adenine, leucine en uracil. Ent een lus vol entmateriaal van ell1Δ-stam van de bovenstaande plaat in 15-20 ml YE-medium aangevuld met 225 μg / ml elk van adenine, leucine en uracil. Incubeer het 's nachts bij 32 °C met schudden (200-250 tpm).</li>
	<li>Verdun de volgende dag de nachtcultuur in 100 ml vers YE-medium met de gewenste supplementen tot een OD600 nm (optische dichtheid bij 600 nm) van 0,3 en incubeer het bij 32 ° C met schudden bij 200-250 tpm totdat de OD600 nm de mid-logfase bereikt.</li>
	<li>Verdeel de 100 ml cultuur in twee centrifugebuizen van 50 ml, gevolgd door centrifugatie bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten bij 4.000 × g.</li>
	<li>Gooi het supernatant weg en was de celkorrel met 1 ml steriel water, d.w.z. resuspenseer de cellen in 1 ml steriel water en centrifugeer op 4.000 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Gooi het supernatant weg en was elke celpellet met 1 ml 1x LiAc-TE (100 mM lithiumacetaat, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) oplossing zoals beschreven in stap 1.4.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer elke celpellet in 250 μL 1x LiAc-TE. Gebruik deze S. pombe competente cellen (500 μL) voor transformatie met het DNA van belang. Breng 125 μL van de competente cellen over in vier verschillende steriele microcentrifugebuizen voor volgende transformatiestappen.</li>
	<li>Kook drager-DNA van zalmtestes of haringsperma gedurende 1 min en plaats het onmiddellijk op ijs. Voeg voor elke transformatie 10 μL 10 mg/ml gedenatureerd, enkelstrengs drager-DNA toe aan de microcentrifugebuis die 125 μL van de competente cellen bevat, gevolgd door voorzichtig mengen met behulp van een micropipettepunt. Voeg vervolgens 50 μg van de S. pombe cDNA-bibliotheek toe aan de competente cellen-drager DNA-mengselbevattende microcentrifugebuis.</li>
	<li>Incubeer de microcentrifugebuizen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en voeg vervolgens 260 μL polyethyleenglycol-lithiumacetaatoplossing (40% [w/v] PEG 4.000, 100 mM lithiumacetaat, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) toe aan de buizen en meng voorzichtig met behulp van een micropipettetip.</li>
	<li>Incubeer de microcentrifugebuizen met het transformatiemengsel bij 32 °C gedurende 2 uur zonder te schudden. Voeg 43 μL voorgewarmd dimethylsulfoxide (DMSO) toe aan de microcentrifugebuis en meng voorzichtig. Stel de buizen vervolgens gedurende 5 minuten bloot aan een hitteschok bij 42 °C.</li>
	<li>Pelleteer de cellen op 4.000 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en verwijder de resterende PEG- LiAc-TE-oplossing met behulp van een micropipettetip.</li>
	<li>Resuspensieer de cellen in 100 μL steriel water en plaat op één EMM2 (tabel 1) plaat (150 mm) met de vereiste supplementen en 0,2 μg/ml 4-NQO.</li>
	<li>Incubeer de platen bij 32 °C gedurende 5-6 dagen om kolonies op de platen te laten verschijnen. Streep de verkregen kolonies op dezelfde mediumplaat in aanwezigheid van 0,2 μg/ml 4-NQO en gebruik voor verdere screening.</li>
	<li>Gebruik voor één bibliotheektransformatie-experiment 500 μL competente cellen (125 μL competente cellen x 4 microcentrifugebuizen) voor transformatie zoals beschreven in stappen 1,8 tot 1.14 hierboven.</li>
	<li>Als controle, plaat 1/10e van het transformatiemengsel op één EMM2-plaat (150 mm) met de vereiste supplementen, maar zonder 4-NQO, om het totale aantal bibliotheekklonen te berekenen dat is verkregen na transformatie van de bibliotheek, en scherm voor isolatie van de suppressorklonen.</li>
</ol>2. Test en valideer de redding/onderdrukking van het fenotype geassocieerd met de querymutantenstam door de vermeende suppressor
OPMERKING: Stressvlektests werden uitgevoerd zoals hieronder beschreven om de redding /onderdrukking van de ell1-deletie-geassocieerde 4-NQO-stressgevoeligheid door de vermeende suppressor (s) te testen en te valideren.
<ol><li>Voeg 100-200 μL steriel water toe in elk van de verschillende putten van een steriele 96-well microtiter plaat.</li>
	<li>Kies een kleine hoeveelheid entmateriaal uit elk van de verschillende kolonies verkregen na cDNA-bibliotheektransformatie op de plaat met 4-NQO met behulp van een steriele tandenstoker of een 20-200 μL micropipettepunt. Voeg het entmateriaal uit elk van de verschillende kolonies toe in afzonderlijke onafhankelijke putten van de microtiterplaat met 100-200 μL steriel water. Meng.</li>
	<li>Spot 3 μL van de celsuspensie van elke put op EMM2-agarplaten die adenine (225 μg / ml) en uracil (225 μg / ml) bevatten, maar geen leucine bevatten (de selecteerbare auxotrofe marker die aanwezig is op de plasmidevector die wordt gebruikt voor de constructie van de bibliotheek die in dit werk wordt gebruikt). Voeg indien nodig de juiste concentraties van 4-NQO toe aan de platen.</li>
	<li>Incubeer de platen bij 32 °C gedurende 3-4 dagen om de cellen te laten groeien. Identificeer de kolonies die groei vertonen in de aanwezigheid van verschillende concentraties 4-NQO als vermeende onderdrukkers.</li>
	<li>Om de suppressors verder te valideren, kweekt u de geselecteerde suppressors samen met de juiste controlestammen 's nachts bij 32 °C met schudden (200-250 rpm) in EMM2-medium dat 225 μg / ml elk van adenine en uracil bevat, maar geen leucine bevat.</li>
	<li>Verdun de cellen de volgende dag tot een OD600 nm van 0,3 in vers EMM2-medium en laat ze groeien bij 32 °C met schudden tot halverwege de logfase (ongeveer OD600 nm van 0,6-0,8).</li>
	<li>Zoek geschikte seriële verdunningen (1:10 of 1:5) van culturen op EMM2-platen met de vereiste supplementen die 0,4 μM 4-NQO of 0,01% MMS bevatten. Voor controle, spot de stammen op een EMM2-plaat met de vereiste supplementen, maar zonder DNA-beschadigend middel.</li>
	<li>Incubeer de platen bij 32 °C gedurende 3-5 dagen om de groei te controleren. OPMERKING: Geschikte testen op basis van het fenotype geassocieerd met de query mutantenstam moeten worden gebruikt om de redding of onderdrukking van het fenotype te testen. Als bijvoorbeeld onderdrukkers van een koudgevoelig fenotype van een querymutantenstam moeten worden geïdentificeerd, zou de test voor het testen en valideren van de suppressorklonen het kweken van transformatoren bij lage temperatuur omvatten.</li>
	<li>Spot de mutante stammen die zijn getransformeerd met een gen van belang over de volledige lengte (Spell1 in dit geval) of lege vector als respectievelijk positieve en negatieve controles, samen met de bibliotheektransformaties.</li>
</ol>3. Isolatie van het plasmide van de S. pombe suppressor klonen
OPMERKING: Plasmide-isolatie van S. pombe werd uitgevoerd volgens het protocol beschreven in Splijtingsgist: een laboratoriumhandleiding28 met enkele wijzigingen.
<ol><li>Ent een enkele gistkolonie in EMM2-medium met 225 μg / ml adenine en uracil en laat de cellen 's nachts groeien bij 32 ° C met schudden bij 200-250 tpm. Oogst de volgende dag 5 O.D.-cellen (d.w.z. 10 ml cultuur van O.D. 0,5) door centrifugeren gedurende 2 minuten bij 4.000 × g bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 0,2 ml lysisbuffer (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris HCl (pH 8,0) en 1 mM Na2EDTA).</li>
	<li>Voeg 0,2 ml fenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) en 0,3 g met zuur gewassen glasparels toe aan de microcentrifugebuis. Vortex de microcentrifugebuis gedurende 2 min bij 4 °C en incubeer op ijs gedurende 1 min. Herhaal deze stap 6x.</li>
	<li>Centrifugeer de buis op 10.000 × g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Breng de bovenste waterige laag over in een verse microcentrifugebuis en voeg 200 μL fenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) toe.</li>
	<li>Centrifugeer de buis op 10.000 × g gedurende 10 minuten. Breng de bovenste waterige laag over in een verse buis en voeg twee volumes 100% ethanol (~ 400 μL) en 1/10 volume natriumacetaat (3 M, pH 5,8) (~ 20 μL) toe aan de buis. Incubeer de microcentrifugebuis -70 °C gedurende 1 uur.</li>
	<li>Zet het DNA neer door centrifugeren bij 10.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant. Was de DNA-pellet met 70% ethanol (~500 μL) en houd deze op kamertemperatuur om aan de lucht te drogen.</li>
	<li>Resuspendeer het DNA in 20 μL steriel water. Gebruik 2-5 μL plasmide-DNA voor de transformatie van competente E. coli-cellen . OPMERKING: Plasmide kan ook worden geïsoleerd uit gistcellen met behulp van een van de in de handel verkrijgbare gistplasmide-isolatiekits.</li>
</ol>4. Identificatie van het gen gecodeerd door de suppressor kloon
<ol><li>Transformeer de geïsoleerde gistplasmiden in E. coli Top10 stam [F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG] met behulp van het standaardprotocol29 en verspreid de cellen op LB (Luria Broth) platen met de benodigde antibiotica.</li>
	<li>Isoleer de plasmide(n) uit E. coli-transformatoren met behulp van het standaard alkalische lysisprotocol29 en volg de juiste combinaties van restrictie-enzymen om te controleren op het vrijkomen van het insert-DNA-fragment door restrictieve vertering. OPMERKING: Suppressorplasmide 84 werd verteerd met BamHI-restrictie-enzym en Suppressorplasmide 104 werd verteerd met PstI/ BamHI-restrictie-enzymen.</li>
	<li>Vervorm de plasmiden met insertafgifte na restrictievertering in de ell1Δ-stam om te controleren op hun vermogen om het genotoxische stressgevoelige fenotype van de ell1Δ-stam te redden.</li>
	<li>Selecteer de plasmideklonen die de onderdrukking van de genotoxische stressgevoeligheid laten zien en rangschik het insert-DNA-fragment dat aanwezig is in deze plasmideklonen met behulp van vectorspecifieke voorwaartse en omgekeerde primers. OPMERKING: In deze studie werd de adh1 promotor-specifieke universele forward primer (5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3') gebruikt30.</li>
	<li>Om het gen te identificeren dat verantwoordelijk is voor de onderdrukking, lijnt u de sequentie uit die is verkregen met behulp van NCBI-nucleotideblast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch) of Pombase-sequentie-uitlijningstool (https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core). Selecteer de sequentie die de maximale uitlijning weergeeft en identificeer deze als het gen voor het multicopy suppressorplasmide.</li>
</ol>

<ol><li>Zuk, O., Hechter, E., Sunyaev, S. R., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+of+missing+heritability%3A+Genetic+interactions+create+phantom+heritability%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The mystery of missing heritability: Genetic interactions create phantom heritability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1193-1198 (2012).</li>
<li>Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. -L. V., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+sources+of+missing+heritability+in+a+yeast+cross%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Finding the sources of missing heritability in a yeast cross.</a> Nature. 494 (7436), 234-237 (2013).</li>
<li>Bloom, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interactions+contribute+less+than+additive+effects+to+quantitative+trait+variation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genetic interactions contribute less than additive effects to quantitative trait variation in yeast.</a> Nature Communications. 6 (1), 8712(2015).</li>
<li>Tong, A. H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+mapping+of+the+yeast+genetic+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global mapping of the yeast genetic interaction network.</a> Science. 303 (5659), New York, N.Y. 808-813 (2004).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327 (5964), New York, N.Y. 425-431 (2010).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+genetic+interaction+network+maps+a+wiring+diagram+of+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A global genetic interaction network maps a wiring diagram of cellular function.</a> Science. 353 (6306), New York, N.Y. (2016).</li>
<li>Mullen, J. R., Kaliraman, V., Ibrahim, S. S., Brill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+three+novel+protein+complexes+in+the+absence+of+the+Sgs1+DNA+helicase+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Requirement for three novel protein complexes in the absence of the Sgs1 DNA helicase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 157 (1), 103-118 (2001).</li>
<li>Kaplan, Y., Kupiec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+yeast+cell+cycle%2Fsplicing+factor+Cdc40+in+the+G1%2FS+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">A role for the yeast cell cycle/splicing factor Cdc40 in the G1/S transition.</a> Current Genetics. 51 (2), 123-140 (2007).</li>
<li>Carlsson, M., Hu, G. -Z., Ronne, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+dosage+effects+in+yeast+support+broader+roles+for+the+LOG1%2C+HAM1+and+DUT1+genes+in+detoxification+of+nucleotide+analogues%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Gene dosage effects in yeast support broader roles for the LOG1, HAM1 and DUT1 genes in detoxification of nucleotide analogues.</a> PLOS One. 13 (5), 0196840(2018).</li>
<li>Sopko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+pathways+and+phenotypes+by+systematic+gene+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression.</a> Molecular Cell. 21 (3), 319-330 (2006).</li>
<li>Duffy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+screens+identify+conserved+dosage+chromosome+instability+genes+in+yeast+and+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Overexpression screens identify conserved dosage chromosome instability genes in yeast and human cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 9967-9976 (2016).</li>
<li>Appling, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+approaches+to+the+study+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Genetic approaches to the study of protein-protein interactions.</a> Methods (San Diego, Calif). 19 (2), 338-349 (1999).</li>
<li>Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: yeast.</a> Nature Reviews. Genetics. 2 (9), 659-668 (2001).</li>
<li>Kitazono, A. A., Tobe, B. T. D., Kalton, H., Diamant, N., Kron, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker-fusion+PCR+for+one-step+mutagenesis+of+essential+genes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast+%28Chichester%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Marker-fusion PCR for one-step mutagenesis of essential genes in yeast.</a> Yeast (Chichester, England). 19 (2), 141-149 (2002).</li>
<li>Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+genetic+interactions+and+networks+with+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exploring genetic interactions and networks with yeast.</a> Nature Reviews. Genetics. 8 (6), 437-449 (2007).</li>
<li>Prelich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+mechanisms%3A+themes+from+variations%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Suppression mechanisms: themes from variations.</a> Trends in Genetics. 15 (7), 261-266 (1999).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicopy+suppressors+for+novel+antibacterial+compounds+reveal+targets+and+drug+efflux+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Multicopy suppressors for novel antibacterial compounds reveal targets and drug efflux susceptibility.</a> Chemistry & Biology. 11 (10), 1423-1430 (2004).</li>
<li>Apfel, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+deformylase+as+an+antibacterial+drug+target%3A+Target+validation+and+resistance+development%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Peptide deformylase as an antibacterial drug target: Target validation and resistance development.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1058-1064 (2001).</li>
<li>Tsukahara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medicinal+genetics+approach+towards+identifying+the+molecular+target+of+a+novel+inhibitor+of+fungal+cell+wall+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Medicinal genetics approach towards identifying the molecular target of a novel inhibitor of fungal cell wall assembly.</a> Molecular Microbiology. 48 (4), 1029-1042 (2003).</li>
<li>Calabrese, D., Bille, J., Sanglard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multidrug+efflux+transporter+gene+of+the+major+facilitator+superfamily+from+Candida+albicans+%28FLU1%29+conferring+resistance+to+fluconazole%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel multidrug efflux transporter gene of the major facilitator superfamily from Candida albicans (FLU1) conferring resistance to fluconazole.</a> Microbiology. 146 (11), 2743-2754 (2000).</li>
<li>Cotrim, P. C., Garrity, L. K., Beverley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+genes+mediating+resistance+to+inhibitors+of+nucleoside+and+ergosterol+metabolism+in+leishmania+by+overexpression%2Fselection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of genes mediating resistance to inhibitors of nucleoside and ergosterol metabolism in leishmania by overexpression/selection.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (53), 37723-37730 (1999).</li>
<li>Nodake, Y., Yamasaki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+properties+of+a+macromolecular+conjugate+of+lysozyme+prepared+by+modification+with+a+monomethoxypolyethylene+glycol+derivative%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%2C+Biotechnology%2C+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Some properties of a macromolecular conjugate of lysozyme prepared by modification with a monomethoxypolyethylene glycol derivative.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 64 (4), 767-774 (2000).</li>
<li>Sunnerhagen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospects+for+functional+genomics+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Prospects for functional genomics in Schizosaccharomyces pombe.</a> Current Genetics. 42 (2), 73-84 (2002).</li>
<li>Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ancient+yeast+for+young+geneticists%3A+A+primer+on+the+Schizosaccharomyces+pombe+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system.</a> Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).</li>
<li>Sharma, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+RNA+polymerase+II-mediated+transcriptional+elongation%3A+Implications+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Regulation of RNA polymerase II-mediated transcriptional elongation: Implications in human disease.</a> IUBMB Life. 68 (9), 709-716 (2016).</li>
<li>Sweta, K., Dabas, P., Jain, K., Sharma, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino-terminal+domain+of+ELL+transcription+elongation+factor+is+essential+for+ELL+function+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The amino-terminal domain of ELL transcription elongation factor is essential for ELL function in Schizosaccharomyces pombe.</a> Microbiology. 163 (11), Reading, England. 1641-1653 (2017).</li>
<li>Murray, J. M., Watson, A. T., Carr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Schizosaccharomyces+pombe%3A+Lithium+acetate%2Fdimethyl+sulfoxide+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transformation of Schizosaccharomyces pombe: Lithium acetate/dimethyl sulfoxide procedure.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (4), 090969(2016).</li>
<li>Hagan, I., Carr, A. M., Grallert, A., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHagan%2C+I+%22Fission+yeast%3A+a+laboratory+manual%22">Fission yeast: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2016).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+transformation+of+competent+E.+coli+using+calcium+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation and transformation of competent E. coli using calcium chloride.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), 3932(2006).</li>
<li>Janoo, R. T., Neely, L. A., Braun, B. R., Whitehall, S. K., Hoffman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulators+of+the+Schizosaccharomyces+pombefbp1+gene+include+two+redundant+Tup1p-like+corepressors+and+the+CCAAT+binding+factor+activation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulators of the Schizosaccharomyces pombefbp1 gene include two redundant Tup1p-like corepressors and the CCAAT binding factor activation complex.</a> Genetics. 157 (3), 1205-1215 (2001).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+plasmid+DNA+by+alkaline+lysis+with+SDS%3A+Maxipreparation%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of plasmid DNA by alkaline lysis with SDS: Maxipreparation.</a> CSH Protocols. 2006 (1), 4090(2006).</li>
<li>Choi, E., Lee, K., Song, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+rax2p+in+the+polarized+growth+of+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">Function of rax2p in the polarized growth of fission yeast.</a> Molecules and Cells. 22 (2), 146-153 (2006).</li>
<li>Eisenreichova, A., Różycki, B., Boura, E., Humpolickova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osh6+revisited%3A+Control+of+PS+transport+by+the+concerted+actions+of+PI4P+and+Sac1+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Osh6 revisited: Control of PS transport by the concerted actions of PI4P and Sac1 phosphatase.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 747601(2021).</li>
<li>Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast as a model organism.</a> Science. 277 (5330), New York, N.Y. 1259-1260 (1997).</li>
<li>Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeasts+Saccharomyces+cerevisiae+and+Schizosaccharomyces+pombe%3A+models+for+cell+biology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Gravitational+and+Space+Biology+Bulletin%3A+Publication+of+the+American+Society+for+Gravitational+and+Space+Biology%22%5BJournal%5D)">The yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe: models for cell biology research.</a> Gravitational and Space Biology Bulletin: Publication of the American Society for Gravitational and Space Biology. 18 (2), 3-9 (2005).</li>
<li>Botstein, D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast%3A+an+experimental+organism+for+21st+Century+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Yeast: an experimental organism for 21st Century biology.</a> Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).</li>
<li>Jones, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+library+for+comprehensive+overexpression+screens+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature Methods. 5 (3), 239-241 (2008).</li>
<li>Kitada, K., Johnson, A. L., Johnston, L. H., Sugino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicopy+suppressor+gene+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+G1+cell+cycle+mutant+gene+dbf4+encodes+a+protein+kinase+and+is+identified+as+CDC5%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">A multicopy suppressor gene of the Saccharomyces cerevisiae G1 cell cycle mutant gene dbf4 encodes a protein kinase and is identified as CDC5.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (7), 4445-4457 (1993).</li>
<li>Melnykov, A. V., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMelnykov%2C+AV+%22MCH4+is+a+multicopy+suppressor+of+glycine+toxicity+in+Saccharomyces+cerevisiae%22">MCH4 is a multicopy suppressor of glycine toxicity in Saccharomyces cerevisiae</a>. , 653444(2019).</li>
<li>Kosodo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicopy+suppressors+of+the+sly1+temperature-sensitive+mutation+in+the+ER-Golgi+vesicular+transport+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Multicopy suppressors of the sly1 temperature-sensitive mutation in the ER-Golgi vesicular transport in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 18 (11), 1003-1014 (2001).</li>
<li>Nakamura, T., Takahashi, S., Takagi, H., Shima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicopy+suppression+of+oxidant-sensitive+eos1+mutation+by+IZH2+in+Saccharomyces+cerevisiae+and+the+involvement+of+Eos1+in+zinc+homeostasis%3A+Eos1+involvement+in+zinc+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Multicopy suppression of oxidant-sensitive eos1 mutation by IZH2 in Saccharomyces cerevisiae and the involvement of Eos1 in zinc homeostasis: Eos1 involvement in zinc homeostasis.</a> FEMS Yeast Research. 10 (3), 259-269 (2010).</li>
<li>Hernández-López, M. J., García-Marqués, S., Randez-Gil, F., Prieto, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicopy+suppression+screening+of+Saccharomyces+cerevisiae+identifies+the+ubiquitination+machinery+as+a+main+target+for+improving+growth+at+low+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multicopy suppression screening of Saccharomyces cerevisiae identifies the ubiquitination machinery as a main target for improving growth at low temperatures.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (21), 7517-7525 (2011).</li>
<li>Sweta, K., Sharma, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interaction+between+ELL+transcription+elongation+factor+and+Epe1+reveals+the+role+of+Epe1+in+the+regulation+of+transcription+outside+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Functional interaction between ELL transcription elongation factor and Epe1 reveals the role of Epe1 in the regulation of transcription outside heterochromatin.</a> Molecular Microbiology. 116 (1), 80-96 (2021).</li>
<li>Kim, D. -U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+a+genome-wide+set+of+gene+deletions+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 617-623 (2010).</li>
<li>Adames, N. R., Gallegos, J. E., Peccoud, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+genetic+interaction+screens+in+the+age+of+CRISPR%2FCas%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Yeast genetic interaction screens in the age of CRISPR/Cas.</a> Current Genetics. 65 (2), 307-327 (2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Gisten zijn op grote schaal gebruikt om de fundamentele biologische processen en routes te onderzoeken die evolutionair geconserveerd zijn in eukaryote organismen. De beschikbaarheid van genetische en genomische hulpmiddelen samen met hun vatbaarheid voor verschillende biochemische, genetische en moleculaire procedures maken gisten een uitstekend modelorganisme voor genetisch onderzoek 34,35,36. In de loop der jaren zijn verschi...

Netwerken van genetische interacties bieden functionele informatie over genen en bakenen routes en biologische processen af waar deze genen in vivo bij betrokken kunnen zijn. Daarnaast kunnen ze ook inzicht geven in hoe verschillende genen op elkaar inwerken, wat resulteert in een specifiek fenotype 1,2,3. In de loop der jaren zijn verschillende genetische schermen ontworpen door onderzoekers om fundamentele biologische vragen te beantwoorden en menselijke ziekten te bestuderen. Screenings voor de identificatie van genetische interacties kunnen op meerdere manieren worden uitgevoerd. Genetische interacties geïdentificeerd in verschillende genetische schermen kunnen verschillende mechanistische relaties tussen genen vertegenwoordigen. Bovendien hebben studies aangetoond dat een gemeenschappelijke reeks genetische interacties wordt gedeeld door genen die coderen voor eiwitten die tot dezelfde route of complex behoren 4,5. Genetische interactienetwerken kunnen dus worden gebruikt om de functionele organisatie in een cel vast te stellen, waarbij genen die de meest vergelijkbare profielen delen tot hetzelfde complex of dezelfde route behoren, die genen die iets minder vergelijkbare profielen delen tot hetzelfde biologische proces behoren en die genen overlappende maar meer diverse profielen weerspiegelen leden die tot hetzelfde cellulaire compartiment behoren6.
Genetische interactieschermen op basis van doseringsonderdrukking ('high-copy or multicopy suppression') zijn een van de meest gebruikte benaderingen. Deze schermen kunnen worden uitgevoerd door een querymutantenstam te transformeren met een genomische of cDNA-bibliotheek met een hoog kopieernummer, gevolgd door geschikte assays / selectietechnieken om onderdrukkende of verbeterende genetische interacties te identificeren 7,8,9. Om een uitgebreide genoombrede dekking te garanderen, zijn deze schermen ook uitgevoerd door een specifiek gen van belang te overexpresseren in een verzameling genoombrede functieverliesmutanten of door een hoog-kopie-nummer plasmide-gecodeerde genomische of cDNA-bibliotheek te overexpresseren in een functieverlies-querymutant 9,10,11,12,13,14,15 . De multikopiestrategie kan ook werken met behulp van een dominante / overexpressiebenadering met behulp van een regelbare promotor.
De belangrijkste voordelen van het gebruik van suppressor-gebaseerde schermen zijn dat onderdrukking van een reeds bestaand fenotype in een mutante stam door een ander gen een genetische relatie tussen deze twee genproducten tot stand brengt die mogelijk niet is aangetoond met behulp van andere benaderingen. Ten tweede is waargenomen dat de aanwezigheid van een reeds bestaande mutatie een bepaalde route sensibiliseert, waardoor extra componenten van die route kunnen worden geïdentificeerd door de isolatie van suppressors, die mogelijk niet zijn geïdentificeerd door meer directe genetische selecties. Bovendien kan dit scherm worden gebruikt om onderdrukkers te identificeren die verschillende mechanismen van onderdrukking hebben16. Suppressorinteracties komen meestal voor tussen genen die functioneel verwant zijn en kunnen worden gebruikt om hiërarchieën in paden op te helderen. Het exacte onderliggende mechanisme van onderdrukking kan verschillen op basis van verschillende factoren, waaronder het type querymutant dat in het scherm wordt gebruikt, experimentele omstandigheden en het niveau van genexpressie. Een van de gebruikelijke doseringsonderdrukkingsmechanismen omvat genen die coderen voor producten die samen functioneren in hetzelfde complex of parallel in hetzelfde cellulaire / biologische proces. De resultaten van dergelijke screenings in eenvoudigere modelorganismen zoals gist kunnen worden uitgebreid naar hogere eukaryote organismen, omdat de meeste fundamentele biologische routes en processen gedurende de evolutie worden bewaard.
Deze genetische schermen kunnen ook op verschillende manieren worden aangepast om verschillende biologische vragen te beantwoorden. Orthologe genen van verschillende organismen die het fenotype van de querymutantenstam kunnen onderdrukken, kunnen bijvoorbeeld worden geïdentificeerd. Het is ook gebruikt om potentiële resistentiemechanismen af te bakenen en eiwitdoelen te bepalen van nieuwe antibacteriële 17,18, antischimmel19,20, antiparasitaire21 en antikanker22 verbindingen. Dit scherm is ook gebruikt om onderdrukkers van de activiteit van farmaceutische geneesmiddelen te identificeren waarvan het werkingsmechanisme niet bekend is. Zo kunnen deze multicopy suppressor schermen in principe worden geoptimaliseerd en gebruikt in een verscheidenheid aan toepassingen in verschillende organismen. Hoewel de meeste genetische schermen die door gistonderzoekers worden gebruikt, aanvankelijk zijn ontwikkeld in S. cerevisiae, is S. pombe naar voren gekomen als een complementair modelsysteem voor het uitvoeren van verschillende genetische schermen en testen23. Bovendien vertonen genomische organisatie en biologische processen in S. pombe, zoals het voorkomen van introns in meer genen, complexiteit van de oorsprong van DNA-replicatie, centromeerstructuur, organisatie van de celcyclus en aanwezigheid van de RNAi-machinerie, een grotere gelijkenis tussen S. pombe en hogere eukaryoten23,24, wat het belang onderstreept van het ontwerpen en gebruiken van genetische hulpmiddelen in S. pombe.
Dit artikel beschrijft een protocol voor het identificeren van genetische interactoren op basis van 'doseringsonderdrukking' van een mutant fenotype met functieverlies in S. pombe. De basis van dit protocol is dat het een snelle en efficiënte methode is om een cDNA-bibliotheek te screenen die wild-type genen overexpressie geeft, hetzij op een multicopy plasmide en / of van een sterke promotor. Dit protocol heeft vier hoofdstappen: transformatie van de bibliotheek in een querymutantenstam, selectie van plasmideklonen die het gewenste fenotype van de querymutantenstam onderdrukken, het ophalen van de plasmide(n) uit deze suppressorklonen en identificatie van het gen dat verantwoordelijk is voor de onderdrukking van het fenotype. Zoals geldt voor elke methode op basis van de selectie en identificatie van cDA's uit een bibliotheek, is het succes van het scherm afhankelijk van het gebruik van een bibliotheek van hoge kwaliteit en hoge complexiteit, omdat het scherm alleen die cDNA-klonen kan ophalen die in de bibliotheek aanwezig zijn.
Met behulp van dit protocol hebben we met succes twee nieuwe suppressors van het genotoxische stressgevoelige fenotype van de query S. pombe ell1 null mutant geïdentificeerd. De ELL (Eleven Nineteen Lysine Rich Leukemia) familie van transcriptie-rekfactoren onderdrukken voorbijgaande pauzes van RNA-polymerase II op DNA-sjablonen in in vitro biochemische assays en worden bewaard in verschillende organismen, van splijtingsgist tot mensen25. Eerder werk heeft bewijs geleverd dat een S. pombe ell1 null mutant genotoxische stressgevoeligheid vertoont in de aanwezigheid van 4-nitroquinoline 1-oxide (4-NQO) en methylmethaansulfonaat (MMS)26. Daarom transformeerden we een S. pombe plasmide-gecodeerde multicopy cDNA-bibliotheek in de query S. pombe ell1 null mutant en identificeerden we twee vermeende klonen die het vermogen vertoonden om de genotoxische stressgevoeligheid van de S. pombe ell1 null mutant te onderdrukken in de aanwezigheid van 4-NQO, een verbinding die DNA-laesies induceert. Latere sequencing van de insert aanwezig in de plasmideklonen identificeerde dat de genen die coderen voor rax2+ en osh6+ verantwoordelijk waren voor het onderdrukken van de genotoxische stressgevoeligheid van ell1 null mutant wanneer overexpressie in de ell1 null mutant.

<table><tbody><tr><td>4-NQO</td><td>Sigma</td><td>N8141</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur, glashelder</td><td>Sigma</td><td>1371301000</td><td></td></tr><tr><td>Adenine Sulfate</td><td>Himedia</td><td>GRM033</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Himedia</td><td>GRM026</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004L</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Chloride</td><td>Himedia</td><td>MB054</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>Fermentas</td><td>ER0051</td><td></td></tr><tr><td>Biotine</td><td>Himedia</td><td>RM095</td><td></td></tr><tr><td>Boorzuur</td><td>Himedia</td><td>MB007</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1</td><td>Sigma</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>Citroenzuur</td><td>Himedia</td><td>RM1023</td><td></td></tr><tr><td>Dinatriumwaterstoffosfaat watervrij</td><td>Himedia</td><td>GRM3960</td><td></td></tr><tr><td>enkelstrengs DNA uit zalmtestikels</td><td>Sigma</td><td>D7656</td><td></td></tr><tr><td>EDTA dinatrium</td><td>Sigma</td><td>324503</td><td></td></tr><tr><td>Ferric Chloride Hexahydraat</td><td>Himedia</td><td>RM6353</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Amresco</td><td>188</td><td></td></tr><tr><td>Ionitol</td><td>Himedia</td><td>GRM102</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Qualigen</td><td>Q26897</td><td></td></tr><tr><td>Leucine</td><td>Himedia</td><td>GRM054</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumacetaatzout</td><td>Sigma</td><td>517992</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride Hexahydraat</td><td>Himedia</td><td>MB040</td><td></td></tr><tr><td>Molybdinezuur</td><td>Himedia</td><td>RM690</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinezuur</td><td>Himedia</td><td>CMS177</td><td></td></tr><tr><td>PEG, MW 4000</td><td>Sigma</td><td>81240</td><td></td></tr><tr><td>Pentothinezuur</td><td>Himedia</td><td>TC159</td><td></td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Himedia</td><td>MB082</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Extractie Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumwaterstofftalaat</td><td>Merc</td><td>DDD7D670815</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumjodide</td><td>Himedia</td><td>RM1086</td><td></td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Fermentas</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Himedia</td><td>GRM205</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Himedia</td><td>GRM1183</td><td></td></tr><tr><td>Natriumsulfaat</td><td>Himedia</td><td>RM1037</td><td></td></tr><tr><td>Tris vrije base</td><td>Himedia</td><td>MB209</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Himedia</td><td>GRM264</td><td></td></tr><tr><td>Gistextractpoeder</td><td>Himedia</td><td>RM668</td><td></td></tr><tr><td>Zinksulfaat Heptahydraat</td><td>Merc</td><td>DJ9D692580</td><td></td></tr></tbody></table>

genetische screening voor identificatie van multicopy suppressors in schizosaccharomyces pombe

Genetic Screen for Identification of Multicopy Suppressors in Schizosaccharomyces pombe

Identificatie van genetische interacties is een krachtig hulpmiddel om de functies van gen(en) te ontcijferen door inzicht te geven in hun functionele relaties met andere genen en organisatie in biologische paden en processen. Hoewel de meerderheid van de genetische schermen aanvankelijk werden ontwikkeld in Saccharomyces cerevisiae, is een aanvullend platform voor het uitvoeren van deze genetische schermen geleverd door Schizosaccharomyces pombe. Een van de meest gebruikte benaderingen om genetische interacties te identificeren, is door overexpressie van klonen uit een genoombrede plasmidebibliotheek met een hoog aantal kopieën in een functieverliesmutant, gevolgd door selectie van klonen die het mutante fenotype onderdrukken.
Dit artikel beschrijft een protocol voor het uitvoeren van deze op 'multicopy suppression' gebaseerde genetische screening in S. pombe. Dit scherm heeft geholpen bij het identificeren van multikopie suppressor (s) van het genotoxische stressgevoelige fenotype geassocieerd met de afwezigheid van de Ell1 transcriptie-rekfactor in S. pombe. Het scherm werd geïnitieerd door transformatie van de query ell1 null mutante stam met een hoog-kopie-nummer S. pombe cDNA plasmide bibliotheek en het selecteren van de suppressors op EMM2 platen met 4-nitroquinoline 1-oxide (4-NQO), een genotoxische stress-inducerende verbinding. Vervolgens werd plasmide geïsoleerd uit twee op de shortlist geplaatste suppressorkolonies en verteerd door restrictie-enzymen om het insert-DNA vrij te maken. Plasmiden die een insert-DNA-fragment vrijgeven, werden opnieuw getransformeerd in de ell1-deletiestam om het vermogen van deze suppressorplasmideklonen te bevestigen om de groei van de ell1-deletiemutant te herstellen in aanwezigheid van 4-NQO en andere genotoxische verbindingen. Die plasmiden die een redding van het deletiefenotype vertoonden, werden gesequenced om de gen(en) te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de onderdrukking van het ell1-deletie-geassocieerde genotoxische stressgevoelige fenotype.

Screening op multikopie suppressor(s) van ell1 deletie-geassocieerde genotoxische stressgevoeligheid bij S. pombe We voerden de genetische screening uit met behulp van het hierboven beschreven protocol om multikopie-suppressoren van het functieverliesfenotype van de query ell1-deletiemutantenstam te identificeren. De groeigerelateerde gevoeligheid van de ell1-deletiestam waargenomen in aanwezigheid van het 4-NQO genotoxisch...

Dit werk beschrijft een protocol voor een multicopy suppressor genetische screening in Schizosaccharomyces pombe. Dit scherm maakt gebruik van een genoombrede plasmidebibliotheek om suppressorkloon (en) van een functieverliesfenotype geassocieerd met een querymutantenstam te identificeren. Nieuwe genetische onderdrukkers van de ell1 null-mutant werden geïdentificeerd met behulp van dit scherm.

Genetische screening voor identificatie van multicopy suppressors in Schizosaccharomyces pombe

Identification of genetic interactions is a powerful tool to decipher the functions of gene(s) by providing insights into their functional relationships ...

Suppressorschermen identificeren genetische interacties die licht zouden werpen op de functies van het gen van belang, evenals de paden en biologische processen waarbij ze in vivo betrokken kunnen zijn. Deze techniek kan een genetische relatie tussen twee genproducten identificeren die mogelijk niet zijn aangetoond met behulp van andere benaderingen. De resultaten van dergelijke schermen in gist kunnen worden uitgebreid tot hoge eukaryote organismen, omdat de meeste fundamentele biologische routes en processen gedurende de evolutie worden bewaard.Het succes van het schema hangt af van de beschikbaarheid, van hoge kwaliteit en de hoge efficiëntie van de transformatie in gistcellen. Dus, transformatieprotocol met het plasmide vóór Kweek de Schizosaccharomyces pombe ell1 deletie stam bij 32 graden Celsius op YE medium plaat. Neem een lus vol ell1 mutante stam van de plaat, ent vijf milliliter aangevuld YE-medium en incubeer vervolgens de injectieflacon terwijl je 's nachts schudt bij 32 graden Celsius.Verdun na incubatie de nachtelijke groeicultuur in 100 milliliter vers YE-medium met de gewenste supplementen om 0,3 optische dichtheid op 600 nanometer te bereiken. Incubeer het medium bij 32 graden Celsius terwijl je schudt bij 200 tot 550 RPM totdat de optische dichtheid op 600 nanometer de mid-logfase bereikt. Nadat u de 100 milliliter cultuur in twee centrifugebuizen van 50 milliliter hebt verdeeld, pelleteert u de cellen op 4.000 keer G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Zodra het supernatant is weggegooid, resuspenseert u de celpellet in één milliliter steriel water. Centrifugeer en gooi het supernatant nogmaals weg en resuspendeer vervolgens de celpellet in één milliliter lithiumacetaat TE. Pellet de cel door centrifugeren en resuspendeer elke celpellet in 250 microliter lithiumacetaat TE. Breng vervolgens 125 microliter van de competente cellen over in vier verschillende steriele microcentrifugebuizen voor volgende transformatiestappen. Kook drager-DNA van zalm teelballen of haringsperma gedurende één minuut en plaats de buis onmiddellijk op ijs.Voeg voor elke transformatie 10 microliter enkelstrengs drager-DNA toe aan de microcentrifugebuis met 125 microliter van de competente cellen en meng voorzichtig door pipetteren. Voeg vervolgens 50 microgram van de Schizosaccharomyces pombe cDNA-bibliotheek toe aan de buis met competente cellen en drager-DNA-mengsel. Voeg na het incuberen van de buis bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten 260 microliter polyethyleenglycol-lithiumacetaatoplossing toe en meng door pipetteren.Incubeer de buis met het transformatiemengsel bij 32 graden Celsius gedurende twee uur zonder te schudden. Voeg 43 microliter voorverwarmd dimethylsulfoxide toe aan de buis en meng voorzichtig. Stel de buis nu vijf minuten bloot aan een hitteschok bij 42 graden Celsius.Pelleteer de cellen en gooi het supernatant weg zoals eerder aangetoond en pipetteer vervolgens de resterende polyethyleenglycol lithiumacetaat TE-oplossing. Resuspendeer de cellen in 100 microliter steriel water en plaats ze op één EMM2-plaat met de vereiste supplementen en 0,2 microgram per milliliter 4-NQO. Laat vervolgens kolonies op de platen verschijnen door de platen vijf tot zes dagen bij 32 graden Celsius te broeden.Voor verdere screening streept u de verkregen kolonies op dezelfde mediumplaat in aanwezigheid van 0,2 microgram per milliliter 4-NQO. Gebruik voor één bibliotheektransformatie-experiment 500 microliter competente cellen voor transformatie en plaat 1-bij-10e van het transformatiemengsel op EMM2-plaat met vereiste supplementen zonder 4-NQO om het totale aantal bibliotheekklonen te berekenen dat na transformatie is verkregen en screen voor de suppressorklonen. Voeg 100 tot 200 microliter steriel water toe aan elke put van een steriele 96-well microtiter plaat.Kies met behulp van een steriele tandenstoker of een micropipettepunt van 20 tot 200 microliter een kleine hoeveelheid entmateriaal uit elke kolonie die is verkregen na cDNA-bibliotheektransformatie op de plaat met 4-NQO. Voeg het entmateriaal uit elk van de verschillende kolonies toe aan elke put van de plaat met steriel water en meng grondig. Spot drie microliter van de celsuspensie van elke put op EMM2-agarplaten en voeg de juiste concentraties van 4-NQO toe aan de platen.Na het kweken van de cellen bij 32 graden Celsius gedurende drie tot vier dagen, identificeert u de kolonies die groei vertonen in verschillende concentraties van 4-NQO als vermeende onderdrukkers. Om de suppressors verder te valideren, kweekt u de geselecteerde suppressors en geschikte controlestammen in EMM2-medium met 225 microgram per milliliter adenine en uracil bij 32 graden Celsius 's nachts met schudden. Na het einde van de incubatie verdunt u de cellen tot een optische dichtheid van 0,3 in vers EMM2-medium en laat u ze groeien terwijl u schudt bij 32 graden Celsius tot de mid-logfase.Zoek geschikte seriële verdunningen van culturen op EMM2-platen met de vereiste supplementen die 0,4 micromolaire 4-NQO of 0,01% MMS bevatten. Voor controle, spot de stammen op een EMM2-plaat met de vereiste supplementen, maar zonder DNA-beschadigend middel. Incubeer de platen bij 32 graden Celsius gedurende drie tot vijf dagen om de groei te volgen.Spot de mutante stammen die zijn getransformeerd met het gen van belang over de volledige lengte of lege vector als respectievelijk positieve en negatieve controles, samen met de bibliotheektransformaties. Ent een enkele gistkolonie in EMM2-medium met 225 microgram per milliliter adenine en uracil en laat de cellen 's nachts groeien bij 32 graden Celsius met schudden bij 200 tot 250 RPM. Aan het einde van de incubatie oogst 10 milliliter cultuur van optische dichtheid 0,5 door te centrifugeren op 4.000 keer G gedurende twee minuten bij kamertemperatuur.Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 0,2 milliliter lysisbuffer. Voeg 0,2 milliliter fenol chloroform isoamylalcohol en 0,3 gram zuurgewassen glasparels toe aan de microcentrifugebuis. Meng door de buis twee minuten te vortexen, gevolgd door een minuut op ijs te broeden.Centrifugeer de buis op 10.000 maal G gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Breng de bovenste waterige laag over in een verse microcentrifugebuis en voeg 200 microliter fenol chloroform isoamylalcohol toe. Breng na opnieuw centrifugeren op 10.000 keer G gedurende 10 minuten de bovenste waterige laag over op een verse buis.Voeg vervolgens twee volumes 100% ethanol en 1 bij 10e volume natriumacetaat toe aan de buis en incubeer gedurende een uur bij min 70 graden Celsius. Zet het DNA neer door centrifugeren op 10.000 keer G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius en verwijder het supernatant. Was de DNA-pellet met 70% ethanol en droog aan de lucht op kamertemperatuur.Resuspendeer het DNA in 20 microliter steriel water en gebruik drie tot vijf microliter plasmide-DNA om competente Escherichia coli-cellen te transformeren. Transformeer met behulp van het standaardprotocol de geïsoleerde gistplasmiden in de Escherichia coli TOP10-stam en verspreid de cellen op LB-platen met de vereiste antibiotica. Na het isoleren van het plasmide uit Escherichia coli-transformatoren met behulp van het standaard alkalische lysisprotocol, volgt u de juiste combinaties van restrictie-enzymen om te controleren op de afgifte van het insert-DNA-fragment door restrictieve vertering.Vervorm vervolgens de plasmiden met insertafgifte na restrictievertering in de ell1-deletiestam om te controleren op hun vermogen om het genotoxische stressgevoelige fenotype van de ell1-deletiestam te redden. De ell1-verwijderde Schizosaccharomyces pombe-stam vertoonde gevoeligheid voor 4-NQO in vergelijking met de wild-type stam. Een groot aantal kolonies wordt verkregen op de plaat zonder 4-NQO.Er werden echter minder transformatoren verkregen op de 4-NQO-plaat omdat ze fungeren als bestraffende onderdrukkers van de 4-NQO-gevoeligheid van de ell1-nulmutant. Van de 620 transformatoren lieten er 74 een groei zien op 0,4-micromolair 4-NQO. Er werd waargenomen dat slechts 16 van de 74 groei vertoonden in de aanwezigheid van 0,8-micromolaire 4-NQO.De ell1-deletiestam transformeerde met een lege vector en alle 16 transformatoren vertoonden groei op de plaat zonder 4-NQO. De ell1-deletiemutant die alleen de lege vector bevatte, vertoonde geen groei bij 0,8-micromolair 4-NQO en zes transformanten vertoonden groei bij 0,8-micromolair 4-NQO, wat suggereert dat de bibliotheekklonen die erin aanwezig zijn het genotoxische stressfenotype van de ell1 null-mutant konden onderdrukken. Restrictievertering van suppressorplasmide 84 en 104 gaf een insert vrij van respectievelijk één kilobase en 800 basenparen.Het opnieuw introduceren van de suppressorplasmide-klonen in de ell1 null-mutant resulteerde in de onderdrukking van de 4-NQO-geassocieerde groeigevoeligheid. In aanwezigheid van MMS vertoonden de suppressorplasmiden met ell1-deletiemutant echter meer groei dan die met een lege vector. Deze genetische schermen kunnen potentiële resistentiemechanismen afbakenen en eiwitdoelen van nieuwe antibacteriële, antischimmel-, antiparasitaire of antikankerverbindingen identificeren.Ze kunnen ook het werkingsmechanisme van farmaceutische geneesmiddelen identificeren.

genetic-screen-for-identification-multicopy-suppressors

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We hebben uitgebreide, onpartijdige genoom-brede schermen van gen-drugs-en gen-omgeving interacties te begrijpen. Methoden voor het screenen van deze mutant collecties worden gepresenteerd.

Concurrerende Genomische Schermen van streepjescode Gist Bibliotheken

Hier presenteren we een kosteneffectieve methode voor het definiëren van chemisch-genetische interacties in knopgistende gist. De benadering is gebaseerd op fundamentele technieken in moleculaire biologie van gist en is zeer geschikt voor het mechanistische onderzoek van kleine tot middelgrote collecties chemicaliën en andere media-omgevingen.

Snelle identificatie van chemische Genetische Interacties in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Stressbestendigheid is een van de kenmerken voor een lange levensduur en is bekend genetisch geregeld. Hier, een onbevooroordeelde high-throughput methode ontwikkelden we voor het screenen op mutaties die stress-resistentie in ES-cellen waarmee de muis modellen te ontwikkelen voor een lange levensduur studies.

Forward Genetische Aanpak stress resistentiegenen in Muizen Ontdek - Een High-throughput scherm in ES-cellen

Dit protocol beschrijft een high-throughput methodologie om functioneel scherm op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae.

High-throughput Screening op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae

Wij presenteren een eenvoudige suppressor scherm protocol in kernsplijting gist. Deze methode is efficiënt, mutageen-vrije en selectieve voor mutaties die vaak bij een enkele genomic locus voorkomen.  Het protocol is geschikt voor het isoleren van suppressors die verlichten van gebreken van de groei in vloeibare cultuur die worden veroorzaakt door een mutatie of een drug.

Een Deep-sequencing-bijgewoonde, spontane Suppressor scherm in de kernsplijting gist Schizosaccharomyces pombe

Crispr Cas9-technologie biedt een efficiënte methode om het genoom van zoogdieren in elk celtype nauwkeurig te bewerken en vertegenwoordigt een nieuw middel om genoom-brede genetische schermen uit te voeren. Hier vindt u een gedetailleerd protocol over de stappen die nodig zijn voor het succesvol uitvoeren van gepoolde CRISPR Cas9 schermen.

Gepoolde CRISPR-gebaseerde genetische schermen in zoogdiercellen

Bacteriële pathogenen scheiden eiwitten in de gastheer die gericht zijn op cruciale biologische processen. Het identificeren van de gastheer trajecten doelwit van bacteriële Effector eiwitten is de sleutel tot het aanpakken van moleculaire pathogenese. Hier wordt een methode beschreven met behulp van een gemodificeerde gist suppressor en toxiciteits scherm om gastheer trajecten te verhelderen die zijn gericht op toxische bacteriële Effector eiwitten.

Identificatie van Hosttrajecten die zijn getarget door bacteriële Effector eiwitten met behulp van gist toxiciteit en suppressor schermen

Hier is een protocol om genetische interacties te identificeren door middel van een verhoogde kopie nummer suppressor scherm in Saccharomyces cerevisiae. Deze methode stelt onderzoekers in staat om te identificeren, klonen, en testen suppressors in kortstondige gist mutanten. We testen het effect van de toename van het kopieeraantal van SIR2 op de levensduur in een autofagie null mutant.

Een suppressor scherm voor de karakterisering van genetische links reguleren chronologische levensduur in Saccharomyces cerevisiae

We hebben een soortoverschrijdende vergelijkende oncogenomics-benadering ontwikkeld met behulp van genomische analyses en functionele genomische screenings om therapeutische doelen te identificeren en te vergelijken in tumoren die ontstaan in genetisch gemanipuleerde muismodellen en het overeenkomstige menselijke tumortype.

Genetische profilering en drop-outscreening op genoomschaal om therapeutische doelen te identificeren in muismodellen van kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren

Het licht / donker overgang test is een van de meest gebruikte tests om angst-achtig gedrag te meten bij muizen. Hier presenteren we een film die gedetailleerde procedures over hoe we het gedrag van de test toont.

Licht / donker Overgang test voor Muizen

Leer een multicopy suppressor screen uitvoeren in Schizosaccharomyces pombe om genetische interacties te identificeren. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van genfunctie en biologische processen.

Genetische screening voor identificatie van multicopy suppressors in Schizosaccharomyces pombe

Meer video's verkennen