Genetische screening voor identificatie van multicopy suppressors in Schizosaccharomyces pombe

Suppressorschermen identificeren genetische interacties die licht zouden werpen op de functies van het gen van belang, evenals de paden en biologische processen waarbij ze in vivo betrokken kunnen zijn. Deze techniek kan een genetische relatie tussen twee genproducten identificeren die mogelijk niet zijn aangetoond met behulp van andere benaderingen. De resultaten van dergelijke schermen in gist kunnen worden uitgebreid tot hoge eukaryote organismen, omdat de meeste fundamentele biologische routes en processen gedurende de evolutie worden bewaard.

Het succes van het schema hangt af van de beschikbaarheid, van hoge kwaliteit en de hoge efficiëntie van de transformatie in gistcellen. Dus, transformatieprotocol met het plasmide vóór Kweek de Schizosaccharomyces pombe ell1 deletie stam bij 32 graden Celsius op YE medium plaat. Neem een lus vol ell1 mutante stam van de plaat, ent vijf milliliter aangevuld YE-medium en incubeer vervolgens de injectieflacon terwijl je 's nachts schudt bij 32 graden Celsius.

Verdun na incubatie de nachtelijke groeicultuur in 100 milliliter vers YE-medium met de gewenste supplementen om 0,3 optische dichtheid op 600 nanometer te bereiken. Incubeer het medium bij 32 graden Celsius terwijl je schudt bij 200 tot 550 RPM totdat de optische dichtheid op 600 nanometer de mid-logfase bereikt. Nadat u de 100 milliliter cultuur in twee centrifugebuizen van 50 milliliter hebt verdeeld, pelleteert u de cellen op 4.000 keer G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Zodra het supernatant is weggegooid, resuspenseert u de celpellet in één milliliter steriel water. Centrifugeer en gooi het supernatant nogmaals weg en resuspendeer vervolgens de celpellet in één milliliter lithiumacetaat TE. Pellet de cel door centrifugeren en resuspendeer elke celpellet in 250 microliter lithiumacetaat TE. Breng vervolgens 125 microliter van de competente cellen over in vier verschillende steriele microcentrifugebuizen voor volgende transformatiestappen. Kook drager-DNA van zalm teelballen of haringsperma gedurende één minuut en plaats de buis onmiddellijk op ijs.

Voeg voor elke transformatie 10 microliter enkelstrengs drager-DNA toe aan de microcentrifugebuis met 125 microliter van de competente cellen en meng voorzichtig door pipetteren. Voeg vervolgens 50 microgram van de Schizosaccharomyces pombe cDNA-bibliotheek toe aan de buis met competente cellen en drager-DNA-mengsel. Voeg na het incuberen van de buis bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten 260 microliter polyethyleenglycol-lithiumacetaatoplossing toe en meng door pipetteren.

Incubeer de buis met het transformatiemengsel bij 32 graden Celsius gedurende twee uur zonder te schudden. Voeg 43 microliter voorverwarmd dimethylsulfoxide toe aan de buis en meng voorzichtig. Stel de buis nu vijf minuten bloot aan een hitteschok bij 42 graden Celsius.

Pelleteer de cellen en gooi het supernatant weg zoals eerder aangetoond en pipetteer vervolgens de resterende polyethyleenglycol lithiumacetaat TE-oplossing. Resuspendeer de cellen in 100 microliter steriel water en plaats ze op één EMM2-plaat met de vereiste supplementen en 0,2 microgram per milliliter 4-NQO. Laat vervolgens kolonies op de platen verschijnen door de platen vijf tot zes dagen bij 32 graden Celsius te broeden.

Voor verdere screening streept u de verkregen kolonies op dezelfde mediumplaat in aanwezigheid van 0,2 microgram per milliliter 4-NQO. Gebruik voor één bibliotheektransformatie-experiment 500 microliter competente cellen voor transformatie en plaat 1-bij-10e van het transformatiemengsel op EMM2-plaat met vereiste supplementen zonder 4-NQO om het totale aantal bibliotheekklonen te berekenen dat na transformatie is verkregen en screen voor de suppressorklonen. Voeg 100 tot 200 microliter steriel water toe aan elke put van een steriele 96-well microtiter plaat.

Kies met behulp van een steriele tandenstoker of een micropipettepunt van 20 tot 200 microliter een kleine hoeveelheid entmateriaal uit elke kolonie die is verkregen na cDNA-bibliotheektransformatie op de plaat met 4-NQO. Voeg het entmateriaal uit elk van de verschillende kolonies toe aan elke put van de plaat met steriel water en meng grondig. Spot drie microliter van de celsuspensie van elke put op EMM2-agarplaten en voeg de juiste concentraties van 4-NQO toe aan de platen.

Na het kweken van de cellen bij 32 graden Celsius gedurende drie tot vier dagen, identificeert u de kolonies die groei vertonen in verschillende concentraties van 4-NQO als vermeende onderdrukkers. Om de suppressors verder te valideren, kweekt u de geselecteerde suppressors en geschikte controlestammen in EMM2-medium met 225 microgram per milliliter adenine en uracil bij 32 graden Celsius 's nachts met schudden. Na het einde van de incubatie verdunt u de cellen tot een optische dichtheid van 0,3 in vers EMM2-medium en laat u ze groeien terwijl u schudt bij 32 graden Celsius tot de mid-logfase.

Zoek geschikte seriële verdunningen van culturen op EMM2-platen met de vereiste supplementen die 0,4 micromolaire 4-NQO of 0,01% MMS bevatten. Voor controle, spot de stammen op een EMM2-plaat met de vereiste supplementen, maar zonder DNA-beschadigend middel. Incubeer de platen bij 32 graden Celsius gedurende drie tot vijf dagen om de groei te volgen.

Spot de mutante stammen die zijn getransformeerd met het gen van belang over de volledige lengte of lege vector als respectievelijk positieve en negatieve controles, samen met de bibliotheektransformaties. Ent een enkele gistkolonie in EMM2-medium met 225 microgram per milliliter adenine en uracil en laat de cellen 's nachts groeien bij 32 graden Celsius met schudden bij 200 tot 250 RPM. Aan het einde van de incubatie oogst 10 milliliter cultuur van optische dichtheid 0,5 door te centrifugeren op 4.000 keer G gedurende twee minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 0,2 milliliter lysisbuffer. Voeg 0,2 milliliter fenol chloroform isoamylalcohol en 0,3 gram zuurgewassen glasparels toe aan de microcentrifugebuis. Meng door de buis twee minuten te vortexen, gevolgd door een minuut op ijs te broeden.

Centrifugeer de buis op 10.000 maal G gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Breng de bovenste waterige laag over in een verse microcentrifugebuis en voeg 200 microliter fenol chloroform isoamylalcohol toe. Breng na opnieuw centrifugeren op 10.000 keer G gedurende 10 minuten de bovenste waterige laag over op een verse buis.

Voeg vervolgens twee volumes 100% ethanol en 1 bij 10e volume natriumacetaat toe aan de buis en incubeer gedurende een uur bij min 70 graden Celsius. Zet het DNA neer door centrifugeren op 10.000 keer G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius en verwijder het supernatant. Was de DNA-pellet met 70% ethanol en droog aan de lucht op kamertemperatuur.

Resuspendeer het DNA in 20 microliter steriel water en gebruik drie tot vijf microliter plasmide-DNA om competente Escherichia coli-cellen te transformeren. Transformeer met behulp van het standaardprotocol de geïsoleerde gistplasmiden in de Escherichia coli TOP10-stam en verspreid de cellen op LB-platen met de vereiste antibiotica. Na het isoleren van het plasmide uit Escherichia coli-transformatoren met behulp van het standaard alkalische lysisprotocol, volgt u de juiste combinaties van restrictie-enzymen om te controleren op de afgifte van het insert-DNA-fragment door restrictieve vertering.

Vervorm vervolgens de plasmiden met insertafgifte na restrictievertering in de ell1-deletiestam om te controleren op hun vermogen om het genotoxische stressgevoelige fenotype van de ell1-deletiestam te redden. De ell1-verwijderde Schizosaccharomyces pombe-stam vertoonde gevoeligheid voor 4-NQO in vergelijking met de wild-type stam. Een groot aantal kolonies wordt verkregen op de plaat zonder 4-NQO.

Er werden echter minder transformatoren verkregen op de 4-NQO-plaat omdat ze fungeren als bestraffende onderdrukkers van de 4-NQO-gevoeligheid van de ell1-nulmutant. Van de 620 transformatoren lieten er 74 een groei zien op 0,4-micromolair 4-NQO. Er werd waargenomen dat slechts 16 van de 74 groei vertoonden in de aanwezigheid van 0,8-micromolaire 4-NQO.

De ell1-deletiestam transformeerde met een lege vector en alle 16 transformatoren vertoonden groei op de plaat zonder 4-NQO. De ell1-deletiemutant die alleen de lege vector bevatte, vertoonde geen groei bij 0,8-micromolair 4-NQO en zes transformanten vertoonden groei bij 0,8-micromolair 4-NQO, wat suggereert dat de bibliotheekklonen die erin aanwezig zijn het genotoxische stressfenotype van de ell1 null-mutant konden onderdrukken. Restrictievertering van suppressorplasmide 84 en 104 gaf een insert vrij van respectievelijk één kilobase en 800 basenparen.

Het opnieuw introduceren van de suppressorplasmide-klonen in de ell1 null-mutant resulteerde in de onderdrukking van de 4-NQO-geassocieerde groeigevoeligheid. In aanwezigheid van MMS vertoonden de suppressorplasmiden met ell1-deletiemutant echter meer groei dan die met een lege vector. Deze genetische schermen kunnen potentiële resistentiemechanismen afbakenen en eiwitdoelen van nieuwe antibacteriële, antischimmel-, antiparasitaire of antikankerverbindingen identificeren.

Ze kunnen ook het werkingsmechanisme van farmaceutische geneesmiddelen identificeren.