Name: Reconstitutie van membraangebonden minimale actinecorticosterces op ondersteunde lipidebilagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Leer hoe u membraangebonden actomyosine-netwerken assembleert op ondersteunde lipidebilagen met fluorescentiemicroscopie. Deze methode maakt sequentiële toevoeging van eiwitten mogelijk zonder netwerkintegriteit te verstoren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het AXA-onderzoeksfonds en het Warwick-Wellcome Quantitative Biomedicine Programme (Wellcome ISSF, RMRCB0058) voor DVK, NCBS-TIFR voor AB en ST, en de Wellcome-DBT Margdarshi fellowship (IA/M/15/1/502018) voor SM. DVK wil ook de Biophysical Society bedanken voor het mogelijk maken van het virtuele netwerkevenement "Challenges in understanding multi-component cytoskeletal networks from the molecular to the meso-scale", die heeft bijgedragen aan de totstandkoming van deze protocolcollectie.

<ol><li>Köster, D. V., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+and+the+plasma+membrane%3A+Inextricably+intertwined%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cortical actin and the plasma membrane: Inextricably intertwined.</a> Current Opinion in Cell Biology. 38, 81-89 (2016).</li>
<li>Rao, M., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+organization+of+membrane+constituents+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Active organization of membrane constituents in living cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 29, 126-132 (2014).</li>
<li>Honigmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lipid+bound+actin+meshwork+organizes+liquid+phase+separation+in+model+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A lipid bound actin meshwork organizes liquid phase separation in model membranes.</a> eLife. 3, 01671(2014).</li>
<li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stratification+relieves+constraints+from+steric+hindrance+in+the+generation+of+compact+actomyosin+asters+at+the+membrane+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Stratification relieves constraints from steric hindrance in the generation of compact actomyosin asters at the membrane cortex.</a> Science Advances. 6 (11), (2020).</li>
<li>Köster, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+dynamics+drive+local+membrane+component+organization+in+an+in+vitro+active+composite+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Actomyosin dynamics drive local membrane component organization in an in vitro active composite layer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (12), 1645-1654 (2016).</li>
<li>Vogel, S. K., Heinemann, F., Chwastek, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+MACs+%28minimal+actin+cortices%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">The design of MACs (minimal actin cortices).</a> Cytoskeleton. 70 (11), 706-717 (2013).</li>
<li>Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+contractile+actomyosin+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of contractile actomyosin arrays.</a> Methods in Enzymology. 540, 265-282 (2014).</li>
<li>Mosby, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+filament+dynamics+in+actin+networks+revealed+with+interferometric+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Myosin II filament dynamics in actin networks revealed with interferometric scattering microscopy.</a> Biophysical Journal. 118 (8), 1946-1957 (2020).</li>
<li>Seara, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropy+production+rate+is+maximized+in+non-contractile+actomyosin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin.</a> Nature Communications. 9 (1), 4948(2018).</li>
<li>Linsmeier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disordered+actomyosin+networks+are+sufficient+to+produce+cooperative+and+telescopic+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility.</a> Nature Communications. 7, 12615(2016).</li>
<li>Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+motors+fragment+and+compact+membrane-bound+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments.</a> eLife. 2, 00116(2013).</li>
<li>Ditlev, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+composition-dependent+molecular+clutch+between+T+cell+signaling+condensates+and+actin%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A composition-dependent molecular clutch between T cell signaling condensates and actin.</a> eLife. 8, 42695(2019).</li>
<li>Banjade, S., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+transitions+of+multivalent+proteins+can+promote+clustering+of+membrane+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Phase transitions of multivalent proteins can promote clustering of membrane receptors.</a> eLife. 3, 04123(2014).</li>
<li>Heinemann, F., Vogel, S. K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+membrane+diffusion+modulated+by+a+minimal+actin+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Lateral membrane diffusion modulated by a minimal actin cortex.</a> Biophysical Journal. 104 (7), 1465-1475 (2013).</li>
<li>Vogel, S. K., Greiss, F., Khmelinskaia, A., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+lipid+domain+organization+by+a+biomimetic+contractile+actomyosin+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Control of lipid domain organization by a biomimetic contractile actomyosin cortex.</a> eLife. 6, 24350(2017).</li>
<li>Block, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brownian+motion+at+lipid+membranes%3A+A+comparison+of+hydrodynamic+models+describing+and+experiments+quantifying+diffusion+within+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Brownian motion at lipid membranes: A comparison of hydrodynamic models describing and experiments quantifying diffusion within lipid bilayers.</a> Biomolecules. 8 (2), 30(2018).</li>
<li>JoVE, JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Methods+Collection.+In+vitro+reconstitution+of+cytoskeleton+networks+for+biomaterials%2C+biophysics+and+active+matter+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Methods Collection. In vitro reconstitution of cytoskeleton networks for biomaterials, biophysics and active matter research.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Pardee, J. D., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+muscle+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Purification of muscle actin.</a> Methods in Enzymology. 85, 164-181 (1982).</li>
<li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction.+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li>
<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+purification+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Myosin purification and characterization.</a> Methods in Cell Biology. 24, 331-371 (1982).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Separating protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WH2+and+proline-rich+domains+of+WASP-family+proteins+collaborate+to+accelerate+actin+filament+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">WH2 and proline-rich domains of WASP-family proteins collaborate to accelerate actin filament elongation.</a> The EMBO Journal. 37 (1), 102-121 (2018).</li>
<li>Shrivastava, R., Köster, D., Kalme, S., Mayor, S., Neerathilingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailor-made+ezrin+actin+binding+domain+to+probe+its+interaction+with+actin+in-vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tailor-made ezrin actin binding domain to probe its interaction with actin in-vitro.</a> PLoS One. 10 (4), 0123428(2015).</li>
<li>Nye, J. A., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+control+of+histidine-tagged+protein+surface+density+on+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).</li>
<li>Honigmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+STED-FCS+reveals+spatiotemporal+heterogeneity+of+lipid+interaction+in+the+plasma+membrane+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells.</a> Nature Communications. 5, 5412(2014).</li>
<li>Selden, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+programmed+cell+adhesion+with+membrane-anchored+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chemically programmed cell adhesion with membrane-anchored oligonucleotides.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (2), 765-768 (2012).</li>
<li>Seu, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+surface+treatment+on+diffusion+and+domain+formation+in+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).</li>
<li>Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K., DiBenedetto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+equation+to+extract+diffusion+coefficients+from+confocal+FRAP+data%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Simplified equation to extract diffusion coefficients from confocal FRAP data.</a> Traffic. 13 (12), 1589-1600 (2012).</li>
<li>Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+computational+framework+for+D%28t%29+from+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching+data+reveals+various+anomalous+diffusion+types+in+live+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">A novel computational framework for D(t) from Fluorescence Recovery after Photobleaching data reveals various anomalous diffusion types in live cell membranes.</a> Traffic. 20 (11), 867-880 (2019).</li>
<li>Lorén, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+recovery+after+photobleaching+in+material+and+life+sciences%3A+Putting+theory+into+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Fluorescence recovery after photobleaching in material and life sciences: Putting theory into practice.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (3), 323-387 (2015).</li>
<li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motors+robustly+drive+active+gels+to+a+critically+connected+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state.</a> Nature Physics. 9 (7), 1-7 (2013).</li>
<li>Andrecka, J., Spillane, K. M., Ortega-Arroyo, J., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+and+control+of+Supported+lipid+bilayer+formation+with+interferometric+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Direct observation and control of Supported lipid bilayer formation with interferometric scattering microscopy.</a> ACS Nano. 7 (12), 10662-10670 (2013).</li>
<li>Lin, W. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+membrane+formation%2C+characterization%2C+functionalization%2C+and+patterning+for+application+in+biological+science+and+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Supported membrane formation, characterization, functionalization, and patterning for application in biological science and technology.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 2 (4), 235-269 (2010).</li>
<li>Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+solid-supported+lipid+bilayers%3A+An+integrated+view%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view.</a> Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).</li>
<li>Sapuri-Butti, A. R., Butti, R. C., Parikh, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+supported+membranes+on+topographically+patterned+polymeric+elastomers+and+their+applications+to+microcontact+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Characterization of supported membranes on topographically patterned polymeric elastomers and their applications to microcontact printing.</a> Langmuir. 23 (25), 12645-12654 (2007).</li>
<li>Leptihn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+droplet+interface+bilayers+from+the+contact+of+aqueous+droplets+in+oil%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+actomyosin+patterns+drive+cell-like+membrane+shape+changes%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes.</a> iScience. 25 (5), 104236(2022).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+encapsulation+of+reconstituted+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), e63332(2021).</li>
<li>Murrell, M., Chen, S., Sun, Z. G. In vitro reconstitution of actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurrell%2C+M+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22">Journal of Visualized Experiments</a>. , (2022).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dit protocol biedt een veelzijdig platform en een startpunt om experimenten te ontwerpen om de membraan-cortex interface van cellen te bestuderen. Kritieke stappen zijn de voorbereiding van schone glazen dia's, met behulp van verse lipiden voor efficiënte SUV-vorming (beide van invloed op de kwaliteit van SLB's), en het gebruik van vers gerecyclede myosine II-eiwitten voor dynamische actinefilamentreorganisatie. Bij beeldvormingsdynamiek over een lange tijd is het erg belangrijk om een zuurstofvangersysteem op te nemen (bijv. protocatechuïnezuur en protocatechuaat 3 4-dioxygenase 5,31).
Het ontwerp met open kamer maakt de sequentiële toevoeging van componenten aan een bestaand systeem mogelijk zonder lipidenstromen te induceren. Dit kan een belangrijk voordeel zijn ten opzichte van veelgebruikte benaderingen met gesloten kamers of werken met ingekapselde eiwitten binnen liposomen36. Tegengestelde effecten zoals eiwit-geïnduceerde membraanvervorming kunnen niet worden bestudeerd met glas-geadsorbeerde lipide bilayers.
De lipide bilayers kunnen worden gevormd met een breed scala aan lipidesamenstellingen. Het begint met adsorptie van de lipideblaasjes aan het hydrofiele glasoppervlak, gevolgd door spontane blaasjesruptuur als gevolg van oppervlakte-blaasje en directe vesikel-vesikelinteracties of de geadsorbeerde blaasjes die een kritische dekking bereiken waarna een klein deel van de blaasjes scheurt, actieve randen vormt, wat uiteindelijk leidt tot de bilayer-vorming32 . Naast glas kunnen verschillende substraten worden gebruikt om ondersteunde lipide-bilayers te vormen, zoals Mica (bijvoorbeeld voor atoomkrachtmicroscopie), zachte substraten (bijv. Poly-di-methyl-siloxaan), polymeerkussens33,34,35, verspreid tussen gaten van elektronenmicroscopierasters14. Droplet interface bilayers zijn een andere interessante methode om stabiele, vrijstaande lipide bilayers te creëren36. Het opnemen van acto-myosinenetwerken in blaasjes of emulsies is een zeer krachtige methode om dit minimale systeem te bestuderen in een celachtige geometrie37,38, en die elders in detail wordt beschreven39.

Het plasmamembraan van een levende dierlijke cel interageert voortdurend met het aangrenzende actinecytoskelet en samen vormen ze een actief composietmateriaal dat een veelheid aan cellulaire functies vervult 1,2. Om processen op deze lipidemembraan-actine-interface te bestuderen, is de reconstitutie van cytoskeletale netwerken bovenop ondersteunde lipide bilayers (SLBs) zeer nuttig gebleken. Deze minimale systeembenadering maakt de nauwkeurige controle van cytoskeletnetwerkcomponenten en lipidensamenstelling mogelijk. Vergeleken met de vrijstaande lipidemembranen van gigantische unilamellaire blaasjes, maakt de vlakke geometrie van SLB's efficiënt gebruik mogelijk van state-of-the-art microscopietechnieken zoals superresolutie 3,4, totale interne reflectiefluorescentie (TIRF)5,6,7 of interferometrische verstrooiing8 het bestuderen van de ruimtelijke organisatie en dynamiek van cytoskeletale netwerken. TIRF biedt het hoogste contrast voor fluorescerend gelabelde componenten, omdat het signaal van ongebonden gelabelde moleculen in de oplossing die bijdragen aan het achtergrondsignaal minimaal is.
Hier beschrijven we een basisprotocol voor de vorming van actomyosinenetwerken die zijn gekoppeld aan ondersteunde lipidebilagen, die op grote schaal in het veld worden gebruikt om de fysica van actieve, quasi-2D-netwerken 9,10,11 en hun effect op membraanorganisatie 3,5,12,13,14,15,16 te bestuderen (figuur 11 ). Deze aanpak is niet beperkt tot op actine gebaseerde netwerken, maar kan ook gemakkelijk worden aangepast om microtubuli, intermediaire filamenten of samengestelde netwerken van gemengde aard te verkennen en om een verscheidenheid aan interacties tussen lipidemembraaneiwitten en cytoskeletale componenten te bestuderen met behulp van oppervlaktegevoelige microscopiemethoden.
Om dit protocol gefocust te houden, hebben we een gedetailleerde beschrijving van de zuivering en etikettering van actine- en myosine-eiwitten uitgesloten of details over hoe de contractiliteit en organisatie van actomyosinenetwerken kunnen worden afgestemd en gecontroleerd. Men moet verwijzen naar andere protocollen die naast deze zijn gepubliceerd in de JoVE Methods Collection, In Vitro Reconstitution of Cytoskeleton Networks for Biomaterials, Biophysics and Active Matter Research17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig01.jpg"> Figuur 1: Schema van het in vitro actine-membraan actieve composietsysteem. Gemaakt met Biorender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>1,2 dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- (lissamine rhodamine B sulfonyl)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810158</td><td>16:0 RhoPE</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3- [(N-(5-amino-1 carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl] (nickel salt)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790404</td><td>DGS-NTA-Ni2+</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td>DOPC</td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850355</td><td>DPPC</td></tr><tr><td>Amber glass vials</td><td>ThermoFisher</td><td>B7990-2A</td><td></td></tr><tr><td>ATP disodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor cell chamber</td><td>ThermoFisher</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Bath sonicator</td><td>GT Sonic</td><td>1860QTS</td><td></td></tr><tr><td>beta-casein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>12135</td><td></td></tr><tr><td>chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650471</td><td>alternatief verkrijgbaar bij Electron Microscopy Sciences, 50980296</td></tr><tr><td>Cover slips, #1, 25 mm diameter, Gold Seal</td><td>Harvard Apparatus</td><td>64-0705B</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips, #1, 40x22 mm, Gold Seal</td><td>ThermoFisher</td><td>48404-031</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>G12635</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Himedia</td><td>MB130</td><td></td></tr><tr><td>Gas tight glass syringes, with removable needle, blunt, volumes 10 &micro;L, 100 &micro;L, 500 &micro;L</td><td>Hammilton</td><td>1700 series</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Hellma Analytics</td><td>Z805939</td><td>reinigingsoplossing</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Himedia</td><td>RM380</td><td></td></tr><tr><td>KaH2PO4</td><td>ThermoFisher</td><td>G13405</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>ThermoFisher</td><td>G13305</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>ThermoFisher</td><td>G26708</td><td></td></tr><tr><td>Lipid extruder</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>61000-1EA</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>G15535</td><td></td></tr><tr><td>Microtip sonicator</td><td>Sonics</td><td>VC750</td><td>3 mm Tip diameter</td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>ThermoFisher</td><td>G15955</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Himedia</td><td>GRM853</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>ThermoFisher</td><td>G15825</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>ThermoFisher</td><td>G27815</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti Eclipse TIRF microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td>Met een TIRF-eenheid aangesloten via een polarisatiebehoudende optische vezel op een Agilent monolithische lasercombiner MLC400 met meerdere laserlijnen met een 100X, 1.45 NA Nikon Oil Objective met twee 512 x 512-pixel EMCCD-camera's (Photometrics Evolve 512) met een 100X, 1.45 NA Nikon Oil Objective met twee 512 x 512-pixel EMCCD-camera's (Photometrics Evolve 512)</td></tr><tr><td>NOA88</td><td>Norland Products</td><td>8801</td><td></td></tr><tr><td>PTFE Coated Tweezer Style #2A</td><td>Structure Probe</td><td>0S2AT-XD</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>ThermoFisher</td><td>G15925</td><td></td></tr><tr><td>UV-illuminator</td><td>Novascan</td><td>PSD PRO-UV</td><td>heeft vacuüm en O2 toevoer nodig</td></tr></tbody></table>

reconstitutie van membraangebonden minimale actinecorticosterces op ondersteunde lipidebilagen

Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers

Het oppervlak van een levende cel biedt een veelzijdig actief platform voor tal van cellulaire processen, die voortkomen uit het samenspel van het plasmamembraan met de onderliggende actine cortex. In de afgelopen decennia hebben gereconstitueerde, minimale systemen op basis van ondersteunde lipide bilayers in combinatie met actinefilamentnetwerken bewezen zeer instrumenteel te zijn bij het ontrafelen van basismechanismen en gevolgen van membraangebonden actinenetwerken, evenals bij het bestuderen van de functies van individuele membraan-geassocieerde eiwitten. Hier beschrijven we hoe dergelijke actieve composietsystemen in vitro kunnen worden gereconstitueerd die bestaan uit vloeistofondersteunde lipide bilayers gekoppeld via membraan-geassocieerde actine-bindende eiwitten aan dynamische actinefilamenten en myosinemotoren die gemakkelijk kunnen worden waargenomen via totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie. Een open-kamer ontwerp maakt het mogelijk om het systeem stap voor stap samen te stellen en systematisch vele parameters te regelen, zoals linker eiwitconcentratie, actineconcentratie, actinefilamentlengte, actine / myosineverhouding en ATP-niveaus. Ten slotte bespreken we hoe we de kwaliteit van het systeem kunnen controleren, hoe we veelvoorkomende problemen kunnen detecteren en oplossen en enkele beperkingen van dit systeem in vergelijking met het oppervlak van de levende cel.

Voor representatie wordt hier een typisch postbleach profiel van de 1e afbeelding na fotobleaching (afbeelding bij t = 0 s in figuur 3A) en de pasvorm ervan voor de volgende functie28 (zie figuur 6A) getoond:
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63968/63968eq04.jpg" style="margin: auto;">
De waarde van re (23,94 μm) berekend door de fit op deze curve is zeer vergelijkbaar met de re berekend in stap 2.8.4. (23,24 μm). Hier is K een bleekdiepteparameter die direct kan worden geschat op basis van F0 (beschreven in stap 2.8.4.). Evenzo toont figuur 6B het herstelprofiel en de fit ervan voor de volgende functie28:
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63968/63968eq05.jpg" style="margin: auto;">
We vinden de passende waarde van de diffusiecoëfficiënt 1,34 μm2/s, een waarde die nauw overeenkomt met de waarde van 1,39 μm2/s die wordt berekend met de formule in stap 2.8.4. Hier staat MF voor de mobiele fractie van de lipide bilayer die de fractie van de gebleekte populatie vertegenwoordigt die herstelt. De mobiliteit van lipide-verankerde moleculen hangt natuurlijk af van de lipidesamenstelling en de fysieke toestand ervan (vloeistof- of gelfase). Voor onze experimenten met op DOPC gebaseerde lipidembranen moet de mobiliteit > 1 μm2 /s zijn en mag de mobiele fractie niet minder dan 0,9 zijn om een goede lipide-bilaag aan te geven. We raden het gebruik van de handmatige fittingvrije methode aan voor een snelle test van de kwaliteit en mobiliteit van de bilayer. De aanpassingsmethode kan nuttig zijn bij het automatiseren van de analyse voor veel FRAP-curven. Verder, als men een meer geavanceerd FRAP-experiment wil uitvoeren om diffusie in het systeem systematisch te karakteriseren, raden we de lezer aan deze recensie van Lorén et al.30 voor meer informatie over pasmodellen en mogelijke valkuilen in experimenteel ontwerp.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig06.jpg"> Figuur 6: Kwantificering van de diffusiecoëfficiënt van lipide bilayers. (A) Lijnprofiel van de eerste afbeelding na fotobleaching (t = 0 s in figuur 3A) en de fit met vergelijking 4 om de effectieve bleekstraal te berekenen. B) Het herstelprofiel van het gebleekt gebied en de aanpassing ervan aan vergelijking 5 om de diffusiecoëfficiënt en mobiele fractie te berekenen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Een typisch resultaat van de hierboven beschreven experimenten die de dynamische assemblage en organisatie van een acto-myosinenetwerk laten zien, gekoppeld aan een ondersteunde lipide bilayer afgebeeld door TIRF-microscopie, wordt weergegeven in figuur 7 en aanvullende video S1.
Figuur 7 toont een beeldmontage van het linkereiwit, F-actine en myosine-II.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig07.jpg"> Figuur 7: Contractiele actomyosinestromen stimuleren lokale clustering van het membraan-actine linker eiwit HYE. TIRF-snapshots van HYE (YFP-tagged), actinefilamenten (gelabeld met Atto-635 maleimide) en myosine II-filamenten (gelabeld met Atto-565 maleimide) na toevoeging van myosine II aan een SLB die HYE en F-actine bevat. Tijd wordt bovenaan aangegeven: 0 min is onmiddellijk voordat fluorescerende myofilamenten in het TIRF-veld begonnen te verschijnen. HYE en F-actine zijn homogeen verdeeld over de lipide bilaag voorafgaand aan myosinetoevoeging (0 min). Myosine-activiteit induceert contractiele actomyosinestromen, die in de steady state (15 min) in asterachtige structuren terechtkomen, waardoor lokale clustering van de gekoppelde membraancomponent (HYE) wordt aangedreven. De onderste rij is een samenvoeging van actine (geel) en myosine II (magenta) afbeeldingen die de organisatie van actine en myosine op verschillende tijdstippen laten zien. De beelden die werden gebruikt bij het maken van deze montages werden in Fiji gecorrigeerd voor achtergrondsignaal, niet-uniforme intensiteitspatronen en translationele beweging. Schaalbalk = 10 μm. Zie Aanvullende video S1 voor meer informatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Buffernaam</td>
			<td colspan="2">Compositie</td>
		</tr><tr><td>Lipide rehydratatiebuffer</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5% sucrose, pH 7,5</td>
		</tr><tr><td>SLB-formatiebuffer</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 5-6</td>
		</tr><tr><td>SLB Opslagbuffer</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>Eiwitverdunningsbuffer</td>
			<td colspan="2">20 mM HEPES, 100 mM KCl, 1mM TCEP of DTT, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>1X ME of Actin ionenuitwisselingsbuffer</td>
			<td colspan="2">50 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7,2 (bewaren bij 4°C)</td>
		</tr><tr><td>1X KMEH of Actin polymerisatie buffer</td>
			<td colspan="2">50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 50 mM HEPES, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>100 mM ATP voorraad</td>
			<td colspan="2">100 mM ATP dinatriumzout, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 2 mM EGTA, pH 7,5 (bewaren bij -20°C)</td>
		</tr><tr><td>2x Doelbuffer</td>
			<td colspan="2">2x KMEH, 2 mg/ml BSA, 2mM ATP, 5mM TCEP (bewaard bij 4°C)</td>
		</tr><tr><td>G-buffer</td>
			<td colspan="2">2 mM Tris, 0,1 mM CaCl2, 0,2 mM ATP, 0,5 mM TCEP, 0,04 % NaN3, pH 8 (bewaren bij 4°C)</td>
		</tr><tr><td>Myosine II buffer</td>
			<td colspan="2">500 mM KCl, 1 mM EDTA, 10-20 mM Hepes, pH 7,0</td>
		</tr><tr><td>Gelfiltratie chromatografie buffer</td>
			<td colspan="2">50 mM Tris-HCl, 150-300 mM NaCl, 5 mM TCEP, 0,1% Tween-20, pH 7,5</td>
		</tr><tr><td>Afdekken van eiwit Opslagbuffer</td>
			<td colspan="2">10 mM Tris · Cl, 50 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7,5, 20% glycerol</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Lijst van buffersamenstellingen die in dit protocol worden gebruikt.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Veelvoorkomende problemen en hun probleemoplossing</td>
			<td>Probleem</td>
			<td colspan="4">Oorzaak</td>
			<td colspan="4">Mogelijke oplossingen</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>Lipide bilayer vertoont geen diffusie</td>
			<td colspan="4">De meest waarschijnlijke oorzaak voor dit probleem is vuil afdekglas dat kan optreden wanneer de reinigingsoplossing verouderd is of de verwarming niet heeft plaatsgevonden tijdens het ultrasoonapparaat in het bad. Deze dubbellagen hebben een 'vesiculaire' uitstraling doordat de gebarsten blaasjes aan het dekglas kleven maar niet met elkaar versmelten. Het gebruik van MLV's ouder dan 6 weken of SUV's ouder dan 6 dagen, of het toevoegen van lage hoeveelheden SUV's kan ook leiden tot vesiculaire bilayervorming.</td>
			<td colspan="4">Gebruik een verse reinigingsoplossing. Zorg ervoor dat de kachel is ingeschakeld en dat de temperatuur tussen de 45-65 °C ligt. Gebruik verse lipidenmixen. (Het gebruik van een fluorescerende lipidensonde versus een fluorescerende eiwitsonde kan zich soms anders manifesteren. Bijvoorbeeld, als de bilayer subdiffractiedefecten heeft en de oppervlaktepassiveringsstap wordt overgeslagen (of niet werkt), zal de lipidensonde een uniforme intensiteitsverdeling vertonen, maar de fluorescerende eiwitsonde kan heldere fluorescerende vlekken vertonen. )</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>Lipide bilayer heeft heldere vlekken</td>
			<td colspan="4">Lange incubatie van SUV's voor bilayer-vorming kan een lipide bilayer creëren die over het algemeen diffuus is, maar met af en toe heldere vlekken. Deze patches kunnen meerlaagse dubbellagen zijn die grote hoeveelheden fluorescerende sonde kunnen aantrekken.</td>
			<td colspan="4">15-20 minuten incubatie met SUV's is voldoende. Zorg ervoor dat de sonde niet aggregeert: een snelle harde draai van het linkereiwit (300 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C) kan de aggregaten verwijderen</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>Lipide bilayer heeft donkere gaten</td>
			<td colspan="4">Dit gebeurt wanneer de bilayer wordt gemaakt van oude SUV's en gedurende langere uren in beeld wordt gebracht (> 4 uur na de vorming), of de pH van de oplossing drastisch verandert als gevolg van langdurige beeldvorming (bijvoorbeeld in de hoge ATP-toestand en in de aanwezigheid van bepaalde zuurstofvangers), of wanneer het oppervlak overgepassiveerd is met bèta-caseïne (te veel bèta-caseïne toevoegen gedurende meer dan 10-15 minuten en of niet uitwassen).</td>
			<td colspan="4">Gebruik verse lipiden. Verminder de beeldframesnelheid of de effectieve laserverlichtingstijd. Gebruik buffers met een hogere buffercapaciteit.</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>Lipide bilayer vertoont langzame diffusie</td>
			<td colspan="4">Lipide bilayers met een hoog percentage cholesterol, lange verzadigde lipiden of geladen lipiden diffunderen langzamer.</td>
			<td colspan="4">Bereid in dergelijke gevallen uw monster op een hoge temperatuur. Men kan ook een eenvoudige, geteste lipidesamenstelling gebruiken als controle, samen met complexe en niet-geteste lipidesamenstellingen. Zorg ervoor dat het glas schoon is.</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>Actine polymeriseert niet</td>
			<td colspan="4">Doelbuffer is oud, G-actinevoorraad is te oud, oud en nieuw G-actine werden gecopolymeriseerd.</td>
			<td colspan="4">Zorg ervoor dat de Ca2+ vóór polymerisatie wordt vervangen door Mg2+ (met behulp van ME-buffer). Gebruik verse ATP-Mg2+ voorraad. Gebruik vers gerecyclede G-actine. Zorg ervoor dat de concentratie F-actine (in termen van G-actine) toegevoegd aan de bilayer hoger is dan 0,2 μM. Gebruik voor lagere concentraties phalloidine gestabiliseerd F-actine.</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>Actine bindt niet aan de bilayer</td>
			<td colspan="4">Membraan-actine linker wordt niet toegevoegd of toegevoegd in zeer lage concentratie - dit kan worden afgeleid uit de fluorescentie van het linkereiwit. Als de fluorescentie behoorlijk is, heeft de membraan-actine linker actine-bindende capaciteit verloren. Ook als het linkereiwit niet-specifiek gebonden is aan het glasoppervlak (wanneer de dubbellaag slecht is), kan het geen actinefilamenten rekruteren.</td>
			<td colspan="4">Zorg ervoor dat de bilayer diffundeert. Gebruik verse linker eiwitten</td>
		</tr><tr><td>7</td>
			<td>Fluorescerend F-actinesignaal is zwak</td>
			<td colspan="4">De verhouding tussen gelabeld en donker actine is te laag. Ofwel de gelabelde actine of ongelabelde actine is te oud en ze copolymeriseren niet met elkaar.</td>
			<td colspan="4">Recycle actine opnieuw en probeer de ploymerisatie opnieuw met vers gerecyclede actine. Fotoschade kan F-actine vernietigen of depolymeriseren; gebruik indien mogelijk rode of verrode kleurstoffen voor actine (en myosine).</td>
		</tr><tr><td>8</td>
			<td>Myosine vertoont geen contractiliteit</td>
			<td colspan="4">er kan worden waargenomen dat na het toevoegen van ATP aan het myosine-geïnfundeerde systeem, er geen contractiliteit van de acto-myosine is.</td>
			<td colspan="4">Controleer of de myosineconcentratie of het zuiverheidsniveau goed is. Gebruik vers gerecycled myosine (gebruik binnen 6 weken na recycling). Het toevoegen van verse ATP aan de myosinemix kan helpen. Buffers ontgassen en zuurstofvangers gebruiken etc. kan het fotodegraat van de motoren verminderen.  Verdere informatie is te vinden in de protocollen van Plastino et al. of Stam et al. van dezelfde methodenverzameling</td>
		</tr><tr><td>9</td>
			<td>Coverglass is niet hydrofiel</td>
			<td colspan="4">Coverglass wordt niet goed schoongemaakt.</td>
			<td colspan="4">Schoon hydrophilllic coverglas is cruciaal voor de vorming van lipide bilagen. Een nuttige, visuele uitlezing van de hydrofielheid van het dekglas na het reinigingsprotocol is om de bevochtiging van het glas door water te observeren. Voeg een klein volume water toe aan een platliggende deklip. Het water blijft in de vorm van een ronde druppel als de coverslip niet goed wordt schoongemaakt. Hetzelfde volume water zal zich echter verspreiden en een dunne laag vormen, op een behandeld hydrofiel dekglas. Dit bevochtigingsgedrag van het water op het afdekglasoppervlak kan worden gebruikt om vast te stellen of de reinigingsstappen met de reinigingsoplossing / NaOH hebben gewerkt.</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2: Handleiding voor probleemoplossing met een overzicht van veelvoorkomende problemen en bijbehorende oplossingen. 
Aanvullende video S1: Contractiele actomyosinestromen stimuleren lokale clustering van het membraan-actine linker eiwit HYE. TIRF-timelapse van HYE (YFP-tagged), actinefilamenten (gelabeld met Atto-635 maleimide) en myosine II-filamenten (gelabeld met Atto-565 maleimide) na toevoeging van myosine II aan een SLB die HYE en F-actine bevat. Tijd wordt bovenaan aangegeven: 0 min is onmiddellijk voordat fluorescerende myofilamenten in het TIRF-veld begonnen te verschijnen. Schaalbalk = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/S1Movie_Act_myo_Hye_merge_timestamp_15fps.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Dit protocol beschrijft de vorming van ondersteunde lipide bilayers en de toevoeging van cytoskeletale filamenten en motoreiwitten om de dynamiek van gereconstitueerde, membraangebonden cytoskeletale netwerken te bestuderen met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Reconstitutie van membraangebonden minimale actinecorticosterces op ondersteunde lipidebilagen

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane ...

Hier demonstreren we een relatief eenvoudige en ongecompliceerde procedure om membraangebonden actomyosinenetwerken samen te stellen en de dynamiek te bestuderen met behulp van geavanceerde lichtmicroscopische technieken. Het belangrijkste voordeel is dat onze test de sequentiële toevoeging van eiwitten en kleine moleculen mogelijk maakt zonder de membraangebonden netwerken te verstoren. Deze methode kan eenvoudig worden aangepast om andere cytoskeletale eiwitten of samengestelde netwerken te bestuderen.Het meest kritieke onderdeel van het protocol is om ervoor te zorgen dat de ondersteunde lipide bilayer correct wordt gevormd, dus eerst moesten we deze stap onder de knie krijgen voordat we begonnen met het toevoegen van de cytoskeletale eiwitten. Neem om te beginnen drie tot vijf rechthoekige glazen afdekplaten en plaats ze in een coplin-pot. Schakel de badsonator in en stel de temperatuur in op 65 graden Celsius.Vul de coplinpot met 2% reinigingsoplossing om de coverslips volledig onder te dompelen en plaats deze gedurende 30 minuten in de sonicator in de volledige pulsmodus. Gebruik een stompe PTFE-gecoate tang om de coverslips één voor één te verwijderen. Spoel ze grondig af met gedestilleerd water en plaats ze in een andere coplin-pot gevuld met twee normale natriumhydroxide.Soniceer de coverslips gedurende 20 minuten in de volledige pulsmodus. Verwijder de coverslips, spoel grondig af met gedestilleerd water en plaats in een andere coplin-pot gevuld met gedestilleerd water. Voordat u met het experiment begint, neemt u de pot in een chemische kap die is uitgerust met een stikstofgastoevoer.Gebruik handschoenen en een tang om de coverslips te verwijderen om ze onder de stikstofstroom te drogen. Droog beide zijden en leg ze op een schoon plastic rooster met een deksel. Plaats de doos met de coverslips in een desiccator om contact met stofdeeltjes te vermijden, neem vervolgens geautoclaveerde PCR-buizen en knip hun deksels en onderste conische helften uit met een scherp chirurgisch mes.Neem de cilindrische half gesneden buizen, breng UV-uithardende lijm aan op de gladde rand van elke gesneden buis en plaats deze omgekeerd op een vers gereinigde coverslip, zodat de rand plat op de coverslip zit. Beweeg de cilinder niet zijdelings zodra deze op de afdekplaat is geplaatst om ervoor te zorgen dat de lijm niet in de centrale ruimte van de kamer terechtkomt. Plaats de kamer met afdeksels in een UV-ozonreiniger met zuurstoftoevoer en vacuüm.Zet het UV-licht aan en brand gedurende drie tot vijf minuten om de lijm te laten polymeriseren. Verwijder de afdekplaten en test de kamers op lekkage en gooi de lekkende kamers weg. Was elke kamer met SLB-formatiebuffer en laat aan het einde 100 microliter buffer achter.Markeer het niveau van de buffer op 100 microliter met een permanente marker, voeg vervolgens twee microliter 0,1 molair calciumchloride toe aan de kamer, gevolgd door acht microliter van de SUV-oplossing aan elke kamer en incubeer gedurende 15 minuten bij 25 graden Celsius. Verwijder 50 microliter van de SLB-formatiebuffer, laat slechts 50 microliter in de monsterkamer over, voeg vervolgens 100 microliter van één XKMEH toe aan de kamer en meng voorzichtig. Verwijder 100 microliter van de buffer zonder de bodem aan te raken.Herhaal de wasbeurten acht tot 10 keer door 100 microliter van één XKMEH toe te voegen en 100 microliter te verwijderen. Voeg 10 microliter van één milligram per milliliter bèta-caseïne toe aan de bilayer, meng voorzichtig en incubeer gedurende vijf tot 10 minuten bij kamertemperatuur. Spoel bèta-caseïne driemaal af met één XKMEH en breng het bufferniveau terug naar de grens van 100 microliter.Tijdens de bèta-caseïne-incubatie, haal een aliquot van membraan-actine linker eiwit voor min 80 graden Celsius ontdooid snel bij 37 graden Celsius, en houd het vervolgens op ijs. Verdun de aliquot met eiwitverdunningsbuffer tot een concentratie van één micromolair. Voeg het linkereiwit toe aan de oplossing in een bepaalde eindconcentratie en meng voorzichtig.Incubeer gedurende 30 tot 40 minuten bij kamertemperatuur en was drie tot vijf keer met één XKMEH-buffer om het ongebonden HSE-eiwit te verwijderen. Breng het bufferniveau in elke kamer terug naar de grens van 100 microliter. Het monster is nu klaar voor beeldvorming.Schakel de microscoop, de excitatielasers en de detectiecamera's in. Zorg ervoor dat de laser is uitgelijnd, het doel is schoongemaakt en de software klaar is om beelden te verkrijgen. Doe olie op het 100 keer objectief, monteer het monster op het microscoopstadium en richt het doel op de bilayer.Zorg ervoor dat de laserpositie zodanig is dat deze een totale interne reflectie op het monster ondergaat. Gebruik een excitatie van 488 nanometer. Om de integriteit van de bilayer te bepalen, voert u een snelle FRAP-test uit door een interessegebied op de bilayer te selecteren en een paar beelden van het gezichtsveld op te nemen met behulp van beeldomstandigheden die een signaal-ruisverhouding van vijf tot één of hoger bieden.Pauzeer de opname en sluit het veldmembraan van de TIRF-microscoop om een geconcentreerde laserstraal op een klein cirkelvormig gebied van de dubbellaag te richten om de fluoroforen lokaal te bleken. Schakel de laser in op de maximale uitvoer om het kleine gebied gedurende drie tot 10 seconden te fotograferen en schakel vervolgens de laser uit. Heropen het veldmembraan tot de oorspronkelijke straal, pas de beeldtoestand weer aan naar de voorbleekinstellingen en hervat onmiddellijk de opname van het herstel van fluorescerend signaal in het gezichtsveld.Controleer of de bilayer vloeiend is en sla de afbeeldingen op als 16-bits dot TIF-bestanden. Meng ongelabelde en fluorescerend gelabelde G-actine in een molaire verhouding van 10 tot één en vul het aan met G-buffer zodat de concentratie van G-actine 20 micromolair is. Voeg een tiende van 10 keer de ME-buffer toe aan de mix voor een eenmalige oplossing en incubeer gedurende twee minuten bij kamertemperatuur.Ontdooi vervolgens de flacon met afdekbare eiwitvoorraad snel op 37 graden Celsius en houd het vervolgens op ijs. Verdun met G-buffers zodat de concentratie van capping protein nu tweemaal de gewenste eindconcentratie is, voeg vervolgens een gelijk volume van de verdunde capping protein-oplossing toe aan de actinemix. Voeg ten slotte een gelijk volume verse twee keer doelbuffer toe aan de reactiemix.Het uiteindelijke volume van de oplossing moet vier keer het volume van de actinemix zijn. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van componenten is zoals beschreven in het tekstmanuscript. Incubeer de monsters in het donker bij 25 graden Celsius gedurende 45 tot 60 minuten om polymerisatie mogelijk te maken.Pipetteer voorzichtig vijf micromolaire gepolymeriseerde actine met een stompe pipetpunt en voeg deze toe aan een schone geautoclaveerde PCR-buis. Voeg een XKMEH toe aan de buis om het uiteindelijke volume meer dan 20 microliter te maken en meng voorzichtig om te voorkomen dat F-actine wordt geschoren. Verwijder uit de gemonteerde monsterkamer een gelijk volume van de buffer.Voeg de gepolymeriseerde actineoplossing toe aan de kamer en pipetteer voorzichtig driemaal op en neer zonder de dubbellaag aan de onderkant aan te raken. Monteer het monster op de TIRF-microscoop en laat het 20 tot 30 minuten rusten. Neem een paar beelden op uit verschillende gezichtsvelden nadat de toevoeging van F-actine een stabiele toestand heeft bereikt.Na 30 minuten actine-incubatie, monteer het monster terug op de microscoop. Controleer het signaal op de linker eiwit- en F-actinekanalen. Pas indien nodig de beeldomstandigheden aan.Selecteer een goede regio voor een lange time-lapse-opname. Neem 10 tot 15 frames op 0,1 tot 0,2 hertz op voordat myosine wordt toegevoegd en pauzeer de opname. Pipetteer het vereiste volume gerecycled spiermyosine twee uit de voorraadflacon met een stompe pipetpunt en voeg toe aan een schone geautoclaveerde PCR-buis.Voeg onmiddellijk een XKMEH toe aan de buis om het volume meer dan 20 microliter te maken en meng voorzichtig. Verwijder voorzichtig een gelijk volume van de KMEH-buffer uit de gemonteerde monsterkamer zonder deze te storen en voeg voorzichtig de myosineoplossing toe aan de monsterkamer. Pipetteer niet op en neer, omdat dit de aan het oppervlak gebonden filamenten zal verstoren.Hervat onmiddellijk de time-lapse-opname en sla alle afbeeldingen op en maak vervolgens achtergrondafbeeldingen voor alle kanalen met alleen een buffervoorbeeld. Sla alle afbeeldingen op als TIF-bestanden. De aanpassingswaarde van de diffusiecoëfficiënt was 1,34 vierkante micrometer per seconde, wat nauw overeenkwam met de op formule gebaseerde berekende waarde van 1,39 vierkante micrometer per seconde.Het lijnprofiel na fotobleaching en het herstelprofiel van het gebleekte gebied passen respectievelijk in vergelijkingen vier en vijf. De mobiele fractie van de lipide bilayer die de fractie van de gebleekte populatie vertegenwoordigt die terugkomt, was groter dan 0,9, wat wijst op een goede lipide bilayer. Myosine-activiteit induceerde contractiele actomyosinestromen die ontstonden in astro-achtige structuren in de steady state, waardoor lokale clustering van de gekoppelde membraancomponent werd aangedreven.Men kan een verscheidenheid aan microscopietechnieken gebruiken, zoals interferometrische verstrooiingsmicroscopie om de dynamiek van niet-gelabelde actomyosinenetwerken te bestuderen zonder fotoschade te veroorzaken, of superresolutie fluorescentiemicroscopie gebruiken. Deze techniek maakt de weg vrij voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het begrijpen hoe membraaneiwitcomplexen interageren met een dynamisch actomyosinenetwerk om hun architectuur en samenstelling te moduleren.

reconstitution-membrane-tethered-minimal-actin-cortices-on-supported

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een protocol voor de bereiding van ondersteunde lipide-dubbellagen en de karakterisering ervan met behulp van atoomkrachtmicroscopie en krachtspectroscopie.

Atomic Force Microscopy Imaging en Force Spectroscopie van Ondersteunde lipidendubbellagen

Hier presenteren we een protocol om enkele, SNARE-bemiddelde fusie gebeurtenissen tussen liposomen en ondersteund dubbellagen in microfluïdische kanalen met gepolariseerde TIRFM, met 'single molecule gevoeligheid en ~ 15 msec tijdsresolutie te detecteren. Lipide en oplosbare lading afgifte kan gelijktijdig worden gedetecteerd. Liposoom grootte, lipide diffusie, en fusie porie eigenschappen worden gemeten.

SNARE-gemedieerde Fusie van Single proteoliposomen met Tethered Ondersteund dubbellagen in een microfluïdische Flow Cell gecontroleerd door gepolariseerde TIRF Microscopie

Dit artikel beschrijft een methode voor het beoordelen van de interacties en assemblages van integrale membraaneiwitten in vitro met verschillende partnerfactoren in een lipid-proximaal milieu.

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren In Vitro

Wij bieden een protocol voor in vitro zelforganisatie testen van geest en mij op een ondersteunde lipide dubbelgelaagde in een open huis. Daarnaast beschrijven we hoe omsluiten de bepaling in lipide-geklede PDMS microcompartments na te bootsen in vivo voorwaarden door reactie opsluiting.

In Vitro Reconstructie van het zelf-organiserende eiwit patronen op ondersteunde lipide Bilayers

Mitochondriale fusie is een belangrijke homeostatische reactie die ten grondslag ligt aan mitochondriale dynamiek. Hier beschreven is een in vitro reconstitution systeem om mitochondriale binnenmembraan fusie die membraan tethering, docking, hemifusion, en porie opening kan oplossen. De veelzijdigheid van deze aanpak bij het verkennen van celmembraansystemen wordt besproken.

Een modelmembraanplatform voor het reconstrueren van mitochondriale membraandynamica

Dit protocol beschrijft de vorming van cel nabootsende uni-lipide en multi-lipide blaasjes, ondersteunde lipide bilayers en gesuspendeerde lipide bilayers. Deze in vitro modellen kunnen worden aangepast om een verscheidenheid aan lipidetypen op te nemen en kunnen worden gebruikt om verschillende molecuul- en macromolecuulinteracties te onderzoeken.

Assemblage van cellimitiek ondersteunde en gesuspendeerde lipide bilayer modellen voor de studie van moleculaire interacties

Dit artikel introduceert een eenvoudige methode voor snelle productie van gigantische unilamellaire blaasjes met ingekapselde cytoskeletale eiwitten. De methode blijkt nuttig te zijn voor bottom-up reconstitutie van cytoskeletstructuren in opsluiting en cytoskelet-membraaninteracties.

Snelle inkapseling van gereconstitueerd cytoskelet in gigantische unilamellaire blaasjes

In dit manuscript demonstreren we de experimentele technieken om het F-actinecytoskelet in te kapselen in gigantische unilamellaire lipideblaasjes (ook wel liposomen genoemd), en de methode om een cortex-biomimicking F-actinelaag te vormen aan de binnenste folder van het liposoommembraan.

In vitro Reconstitutie van het Actin Cytoskelet Inside Giant Unilamellar Vesicles

Dit protocol is een gids voor het visualiseren van dynamische actine en microtubuli met behulp van een in vitro total internal fluorescence (TIRF) microscopie assay.

Visualisatie van actine en microtubulikoppelingsdynamiek in vitro door total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie

Celvrije reconstitutie is een belangrijk hulpmiddel geweest om de cytoskeletassemblage te begrijpen, en het werk in het afgelopen decennium heeft benaderingen vastgesteld om septinedynamica in minimale systemen te bestuderen. Hier worden drie complementaire methoden gepresenteerd om septineassemblage in verschillende membraancontexten te observeren: vlakke bilayers, sferische steunen en staafsteunen.

Reconstitutie van septineassemblage bij membranen om biofysische eigenschappen en functies te bestuderen

Hier presenteren we methoden voor het bereiden van quasi-tweedimensionale (2D) verstrengelde, verknoopte en vloeibare kristalactine-assemblages van gezuiverde eiwitten.

Het afstemmen van de contractiliteit en vervormingsmodi van actieve op actine gebaseerde assemblages in vitro: van tweedimensionale actieve netwerken tot druppels van vloeibare kristallen

Leer hoe u membraangebonden actomyosine-netwerken assembleert op ondersteunde lipidebilagen met fluorescentiemicroscopie. Deze methode maakt sequentiële toevoeging van eiwitten mogelijk zonder netwerkintegriteit te verstoren.

Reconstitutie van membraangebonden minimale actinecorticosterces op ondersteunde lipidebilagen

Meer video's verkennen