Demonstratie van de sequentie-uitlijning om te voorspellen tussen soorten gevoeligheidsinstrument voor snelle beoordeling van eiwitbehoud

In de context van chemische veiligheid biedt het SeqAPASS-protocol een snel en gestroomlijnd proces voor het evalueren van eiwitbehoud in de diversiteit van soorten, voor extrapolatie van zowel toxiciteit als biologische pathway-kennis. SeqAPASS is ontwikkeld als een vereenvoudigde, transparante en gebruiksvriendelijke webgebaseerde interface voor snelle extrapolatie tussen soorten, bedoeld voor gebruik door zowel onderzoekers als besluitvormers. De tool gaat in op de uitdaging van het extrapoleren van chemische toxiciteitskennis met behulp van beschikbare informatie over soortgevoeligheid, om consequent chemische gevoeligheid te voorspellen voor honderden tot duizenden soorten die nooit in een laboratoriumomgeving zouden kunnen worden getest.

Als u wilt beginnen met het hulpprogramma SeqAPASS, navigeert u eerst naar seqapass.epa.gov. Bestaande gebruikers kunnen de inlogknop voor uw account selecteren. Nieuwe gebruikers kunnen een account aanmaken door de link op de homepage te selecteren.

Nadat u zich hebt aangemeld bij de SeqAPASS-tool, navigeert u naar het tabblad SeqAPASS Uitvoeren aanvragen. SeqAPASS bevat verschillende nuttige bronnen om gebruikers te helpen bij het identificeren van een query-eiwitdoel. Deze zijn toegankelijk door op de vervolgkeuzeknoppen onder Identificeer een eiwitdoel te klikken.

Zodra een eiwitdoel is geïdentificeerd, klikt u op soort of op toetreding onder Primaire aminozuursequenties vergelijken. Als u bijvoorbeeld het behoud van de mu-opioïdereceptor wilt analyseren, klikt u op Op toetreding en voert u het toetredingsnummer in het toetredingsvak voor eiwitten in. Tenzij de gebruiker al een eiwittoetreding heeft geïdentificeerd, wordt de zoekoptie voor soorten aanbevolen.

Selecteer Aanvraag uitvoeren om de query te starten. Zodra uw query is verzonden, selecteert u het tabblad SeqAPASS-uitvoeringsstatus boven aan de pagina om de status van de ingediende uitvoering te bekijken. De tijd tot voltooiing is afhankelijk van het huidige gereedschapsgebruik.

Op het tabblad SeqAPASS-rapporten weergeven worden alle runs weergegeven die onder een bepaald account worden uitgevoerd. Selecteer Rapport weergeven om gegevens weer te geven in de webbrowser en klik op Geselecteerd rapport aanvragen om de pagina Query Protein Information van niveau één te openen en resultaten en opties voor gegevensaanpassing weer te geven. Als u een SeqAPASS-analyse van niveau twee wilt ontwikkelen en uitvoeren om het behoud van specifieke eiwitdomeinen te beoordelen, klikt u op het plusteken naast de koptekst niveau twee op de pagina Level One Query Protein Information om het querymenu van niveau twee te vullen.

Klik op het vak Domein selecteren om een lijst met functionele domeinen voor het query-eiwit in te vullen. Zodra een domein is geïdentificeerd uit de NCBI Conserved Domain Database en is geselecteerd in de vervolgkeuzelijst SeqAPASS, start u de query van niveau twee. Dit wordt gedaan door op de knop Domein uitvoeren aanvragen te klikken.

Klik op Niveau twee en drie runs vernieuwen om gegevens van niveau twee in te vullen. Klik onder Gegevens van niveau twee weergeven op het vak Voltooid domein selecteren om de voltooide domeintoetreding te selecteren. U kunt vervolgens op de knop Gegevens van niveau twee weergeven klikken om de resultaten te openen.

Gegevens worden weergegeven op het tabblad SeqAPASS weergeven voor het geselecteerde niveau, laten we eerst eens kijken naar de gegevens van niveau één. Selecteer op de pagina Eiwitinformatie opvragen het keuzerondje naast het primaire of volledige rapport om de gegevens in een verkorte of uitgebreide indeling weer te geven. Soorten hebben ofwel een gevoeligheidsvoorspelling van ja of nee, wat aangeeft of het eiwit geconserveerd is ten opzichte van de querysequentie.

Klik in het rapport op de juiste eiwittoetreding of soort-ID om naar de NCBI-databases te linken en toegang te krijgen tot verdere informatie. Als u de overeenkomstige toxiciteitsgegevens voor de soort met gevoeligheidsvoorspellingen wilt onderzoeken, scrolt u naar de rechterkant van de tabel Resultaten om de ECOTOX-kolom weer te geven. Klik op links om de betreffende soort te openen in de ECOTOXicology-kennisbank, waar u toxiciteitsgegevens kunt vinden Naast volledige en primaire rapporten kan een samenvattend rapport van de gegevens worden bekeken door Overzichtsrapport van niveau één weergeven te selecteren.

Het overzichtsrapport bevat overzichtsstatistieken en gevoeligheidsvoorspellingen voor taxonomische groepen. Gegevens in elk rapportformaat kunnen eenvoudig worden gedownload. Terwijl het gewenste rapporttype is geselecteerd, klikt u op Tabel downloaden om het op te slaan als een spreadsheetbestand.

Als u gegevens van niveau twee wilt weergeven, scrolt u naar de bovenkant van het tabblad SeqAPASS weergeven en selecteert u Niveau twee. Niveau twee SeqAPASS-gegevens worden weergegeven in rapporten zoals die van niveau één en zijn ook beschikbaar onder aan de pagina Query Protein Information. Selecteer het keuzerondje naast het gewenste rapporttype om de gegevens weer te geven.

Rapporten van niveau twee geven vergelijkbare informatie weer als die van niveau één, met toegevoegde informatie over het eiwitdomein. SeqAPASS-gegevens kunnen eenvoudig worden gevisualiseerd om interpretatie te vergemakkelijken. Klik op het plusteken naast Visualisatie, gevolgd door de knop Gegevens visualiseren, om een interactieve BoxPlot in een nieuw tabblad te openen.

Selecteer in het nieuwe tabblad de knop BoxPlot. Boven aan de BoxPlot-pagina kunnen besturingsopties de gebruiker helpen de grafiek aan te passen. Gebruikers kunnen taxonomische groepen toevoegen aan of verwijderen uit de grafiek, ze kunnen soorten selecteren die in een legenda worden weergegeven, kiezen hoe de namen van de soorten worden weergegeven en specifieke soortensubsets markeren, zoals bedreigde of bedreigde soorten.

Visualisaties kunnen eenvoudig worden geëxporteerd en opgeslagen. Klik op BoxPlot downloaden om een bestandstype te selecteren en de afbeelding te downloaden. Voorafgaand aan het downloaden kunnen gebruikers de resolutie van het bestandstype van de afbeelding aanpassen.

Hoewel de standaard rapportinstellingen voldoende zijn voor de meeste analyses, kunnen parameters worden gewijzigd met behulp van de submenu's boven aan het menu Query Protein Information. Als u de huidige rapportinstellingen wilt vastleggen, klikt u op de knop Huidige rapportinstellingen downloaden om een bestand te downloaden waarin de huidige toegepaste instellingen worden vastgelegd. Dit kan voor niveau één en niveau twee.

Hier is het voorbeeld voor niveau één. Als u een SeqAPASS-analyse van niveau drie wilt starten, navigeert u naar de pagina Level One Query Protein Information en klikt u op het plusteken naast de Level Three Header om het Level Three Query Menu te vullen dat individuele aminozuurresiduvergelijkingen mogelijk maakt. Voordat een niveau drie-analyse kan worden uitgevoerd, moeten specifieke aminozuurresiduen worden geïdentificeerd door middel van een beoordeling van bestaande literatuur.

Klik op het plusteken naast de Referentieverkenner om het hulpprogramma Referentieverkenner te openen. Dit kan u helpen bij het genereren van een vooraf gedefinieerde Booleaanse tekenreeks om beschikbare literatuur op te vragen. Klik op de link Google Scholar genereren om een zoekreeks voor literatuur te genereren.

Dit kan worden gekopieerd en gebruikt om de gewenste literatuurdatabases te doorzoeken. Als u Google Scholar doorzoeken selecteert, wordt automatisch in de literatuur van Google Scholar gezocht met behulp van de vooraf gedefinieerde zoekreeks. Zodra aminozuurresiduen zijn geselecteerd, kunnen gebruikers een niveau drie-analyse instellen.

Selecteer de sjabloonvolgorde waarop de door de gebruiker geselecteerde soort wordt uitgelijnd en vergeleken. Optioneel kunnen aanvullende sjabloonreeksen worden ingevoerd in het vak Aanvullende vergelijkingen. Voordat gebruikers specifieke reeksen uitlijnen, moeten ze een door de gebruiker gedefinieerde uitvoeringsnaam invoeren.

Dit zal worden gebruikt om de run te identificeren. Selecteer de taxonomische groep in het vak Taxonomische groep kiezen. Opgemerkt moet worden dat dit proces zal worden herhaald voor alle taxonomische groepen waarvoor de gebruiker wil evalueren voor behoud.

Zodra alle gewenste soorten zijn geselecteerd voor uitlijning met de sjabloonvolgorde, selecteert u Restresidu uitvoeren aanvragen. Zodra alle soorten zijn uitgelijnd, klikt u op Niveau twee en drie runs vernieuwen om het menu Run Name van niveau drie selecteren te vullen met de voltooide taken van niveau drie. Gegevens van niveau drie kunnen worden bekeken per individuele taxonomische groep of in meerdere taxonomische groepen.

Klik op Gegevens van niveau drie combineren om het dialoogvenster gecombineerd niveau drie te openen en meerdere taxonomische groepen tegelijkertijd te analyseren. Selecteer in het dialoogvenster Rapporten van niveau drie combineren de sjabloon niveau drie die u als basis voor vergelijking wilt gebruiken. Kies vervolgens welke voltooide taken u wilt vergelijken.

Bestel taken van niveau drie naar wens en klik op Gegevens van niveau drie weergeven om een rapportpagina van niveau drie te maken. Op de pagina Level Three Template Protein Information worden eerder geïdentificeerde aminozuurposities uit de sjabloonvolgorde weergegeven en kunnen deze worden geselecteerd voor uitlijning. Voer posities in het tekstvak in, gescheiden door komma's, of selecteer een optie in de lijst met residuen.

Zodra alle posities zijn ingevoerd, selecteert u Kopiëren naar de lijst met residuen om residuen naar het selectievak te verplaatsen. Zodra alle aminozuurposities zijn geselecteerd en gecontroleerd op nauwkeurigheid, klikt u op Rapport bijwerken om uitgelijnde sequenties bij te werken met de opgegeven posities. Scrol naar de onderkant van de pagina om een rapport van de resultaten te bekijken.

Net als bij eerdere niveaus selecteert u het keuzerondje naast het primaire of volledige rapport om het rapporttype te selecteren. Niveau drie rapporten tonen vergelijkbare soorten en eiwitten, en bevatten uitlijnings- en conserveringsinformatie voor elk beoordeeld aminozuurresidu. Als u het rapport wilt opslaan, klikt u op Tabel downloaden onder aan het rapport en slaat u het op als spreadsheetbestand.

Gebruikers kunnen ook Overzichtsrapport van niveau drie weergeven selecteren om een overzichtsrapporttabel weer te geven en te downloaden. Als u een visualisatie voor gegevens van niveau drie wilt weergeven, klikt u op het plusteken naast de visualisatiekop en selecteert u Gegevens visualiseren om een nieuwe pagina te openen. Klik op Heat Map op de pagina met visualisatie-informatie om de interactieve afbeelding en besturingselementen te openen.

Selecteer op de visualisatiepagina onder Besturingselementen de taxonomische groepen die in de heatmap moeten worden weergegeven, shuttle ze met de pijlknop en herschik indien gewenst. Standaard geeft de heatmapvisualisatie de algemene naam van de soort, de algemene gevoeligheidsvoorspellingen en de matchstatus van elk aminozuurresidu weer. Opties voor het manipuleren van heatmapinstellingen vindt u in de uitvouwbare menu's onder de kop Control.

Onder Rapportopties kan een eenvoudig of een volledig rapport worden geselecteerd en kan de weergegeven soort worden gewisseld tussen algemene of wetenschappelijke namen. Onder Optionele selecties kunnen subsets van soorten, zoals orthologe kandidaten, bedreigde soorten, bedreigde soorten en gemeenschappelijke modelorganismen, worden geselecteerd en gemarkeerd in de heatmap. Onder Heat Map-instellingen kan de informatie die op de heatmap wordt weergegeven, worden aangepast door selectievakjes uit te schakelen en uit te schakelen.

Gevoeligheidsvoorspellingen en gevoeligheidstekst kunnen worden verwijderd en aminozuuruitlijningen en aminozuurinformatie kunnen worden verwijderd. Als u de heatmapvisualisatie wilt opslaan, klikt u op Heatmap downloaden en kiest u het gewenste bestandstype. SeqAPASS beschikt over een samenvattend beslissingsrapport, waarmee gebruikers snel gevoeligheidsvoorspellingen op verschillende niveaus en soorten tegelijkertijd kunnen evalueren.

Als u op Push Level to DS Report klikt vanaf de pagina's Resultaten of Gegevensvisualisatie, worden de gegevens overgebracht naar het tabblad DS Report, waar alle niveaus van analyses kunnen worden gecombineerd en weergegeven. De resultaten van de niveau één analyse voor de mu opioïde receptor tonen een gevoeligheidsafsluiting van 55% met procent overeenkomsten voor zoogdieren, vogels, reptielen, amfibieën en de meeste vissoorten die boven deze cutoff vallen en een gevoeligheidsvoorspelling van Ja ontvangen. Die vakjes helemaal onder de cutoff krijgen een gevoeligheidsvoorspelling van een nee.

De niveau twee analyse voor het mu opioïde functionele domein identificeerde een hogere gevoeligheidsgrens van 88% gelijkenis met zoogdieren, vogels, reptielen, amfibieën en de meeste vissoorten boven deze cutoff, wat een andere bewijslijn biedt voor behoud, of de mu opioïde receptor over gewervelde dieren. Binnen de niveau drie analyse resulteerden alle beoordeelde soorten in een gevoeligheidsvoorspelling van ja. Omdat deze aminozuren belangrijk zijn bij de binding van zowel sterke mu opioïde receptoragonisten als sterke antagonisten, suggereren deze gegevens dat opioïde verbindingen gericht op menselijke receptoren op dezelfde manier kunnen interageren met receptoren bij gewervelde soorten.

Niveau drie van SeqAPASS is nuttig voor het genereren van hypothesen. Zelfs als kritische aminozuurresiduen niet bekend staan om het eiwit van belang, kan de tool worden gebruikt om over soorten heen te kijken en te identificeren waar behoud bestaat of minder wordt bewaard. Deze hypothesen kunnen vervolgens worden getest met moleculair biologische technieken, zoals site-gerichte mutagenesestudies.

De eerste focus van SeqAPASS lag op chemische doelen. Ons onderzoek breidt zich echter uit naar primaire metaboliserende enzymen, transporteiwitten en eiwitten die betrokken zijn bij bioaccumulatie.