Meting van leverstijfheid met behulp van atomic force microscopie in combinatie met polarisatiemicroscopie

Ons protocol biedt een onderscheid tussen collageenrijke en collageenarme gebieden in de leversecties. Het kan dus worden gebruikt om de processen van fibrogenese in de grotere details te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van de techniek ligt in het gebruik van polariserende microscopie om collageenrijke gebieden in de leversecties te lokaliseren.

Onze protocollen kunnen veel inzicht geven in de ontwikkeling van leverfibrose, en het kan ook worden toegepast voor andere zachte weefsels zoals longen na bepaalde optimalisaties. Verwijder om te beginnen de bevroren leversecties van min 80 graden Celsius en ontdooi ze bij kamertemperatuur gedurende twee minuten. Bevestig de secties met ijskoude 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius, gevolgd door vijf keer wassen met PBS.

Veeg na de laatste wasbeurt de overtollige PBS rond het levergedeelte met behulp van weefsel en markeer een grens van ongeveer twee bij vier centimeter rond het levergedeelte met een hydrofobe markerpen. Bedek het monster met PBS, laad het monster vervolgens op het AFM-stadium en bedek het met de AFM-kop. Ga in de atomic force microscopie- of AFM-software naar het tabblad Instellingen en markeer een vinkje bij automatisch opslaan om alle bestanden automatisch op te slaan.

Geef vervolgens de bestandsnaam en map op voor het opslaan van de meetbestanden door naar het tabblad Instellingen te gaan en op instellingen opslaan te klikken. Benader het weefseloppervlak met de AFM-cantilever door de laser in te schakelen en op de naderingstoets te klikken. Nadat de nadering is voltooid, trekt u de uitkragingstip in door eenmaal op de intreksleutel te klikken, waardoor de uitkraging naar de bovenkant van het piëzo-bereik wordt ingetrokken.

Lijn indien nodig de detector opnieuw uit met behulp van knoppen op de AFM-kop. Schakel de laser uit. De tip staat nu centraal in de doelstelling.

Leg vervolgens het optische veld van de microscoop met AFM-meetkaarten door op het tabblad accessoires te klikken en directe optische kalibratie van overlays te selecteren. Klik in het volgende venster op Volgende om een reeks afbeeldingen te maken van de cantilever die een specifiek gebied scant. Klik nogmaals op Volgende om naar het volgende venster te gaan.

Klik in de eerste afbeelding handmatig op het midden van de punt van de cantilever om de tippositie in de software weer te geven. De cirkel die de tippositie weergeeft, kan in grootte worden gemanipuleerd door de straal aan te geven om de nauwkeurigheid te vergroten. Klik op kalibreren om de vrijdragende tippositie in alle afbeeldingen automatisch te detecteren.

Bevestig de nauwkeurigheid van tipdetectie door de afbeeldingen door te nemen. Klik op Volgende en voltooi om de optische overlay te voltooien. Verplaats vervolgens het werkgebied om een collageenrijk gebied in het groene vak te plaatsen, zichtbaar op het tabblad Gegevensviewer, met behulp van de gepolariseerde afbeelding.

Selecteer het collageenrijke gebied door het gebied onder het rastertabblad te definiëren en vervolgens een rechthoek te maken op het tabblad gegevensviewer met een lange druk op de linkermuisknop in het opgegeven groene vak. Klik op nieuw scangebied bevestigen om het geselecteerde gebied in te stellen als meetgebied. Stel de parameters van de feedbacklus in.

Set I winst op 50 hertz en P winst op 0,001. Stel vervolgens het instelpunt in op één nano Newton. Selecteer de relatieve instelpuntwaarde op basis van de mechanische eigenschappen van de bestudeerde materialen en de stijfheid van de cantilever.

Geef een basislijn op die goed past bij de krachtcurven. Selecteer vervolgens de lengte van de cantileverbeweging in de Z-as op basis van de oppervlaktetopografie van het monster. Stel Z-beweging in op constante duur.

Stel de verlengingstijd in op één seconde met verlengings- en intrekkingsvertragingen als nul. Stel de samplefrequentie in op 5.000 hertz. Markeer een vinkje voor de gesloten Z-lus om de afstand tussen het monster en de vrijdragende punt tijdens de metingen automatisch aan te passen.

Schakel vervolgens de gemotoriseerde faseregeling uit door de knop Inschakelen te deselecteren. Schakel de laser in en benader het monster met de cantilever. Klik op scan starten om de krachtafstandscurven te verzamelen.

Analyseer de verkregen gegevens met behulp van de open source software AtomicJ. Laad de krachtcurves in het programma door op het pictogram proceskrachtcurven en kaarten te klikken. Voeg vervolgens in de verwerkingsassistent de kaarten toe die moeten worden geanalyseerd door op de knop Toevoegen te klikken.

Nadat de kaarten zijn geladen, klikt u op volgende. Geef de verwerkingsinstellingen op in het volgende venster. Om het contactpunt tussen het monster en de cantilever automatisch te schatten met behulp van een reeks passende curveparameters, gebruikt u de automatische schatting van het contactpunt.

Bepaal het contactpunt tussen de cantilever en het monster met behulp van de klassieke gerichte rastermethode. Selecteer de schattingsmethode als de modelonafhankelijke methode om de beste bepaling van het contactpunt te verkrijgen op basis van de kwaliteit van de gemeten krachtcurven, die empirisch moet worden bepaald tijdens de optimalisatie van gegevensanalyse. Pas de krachtinspringingscurve aan met behulp van een klassiek model als klassiek L twee voor modelfit.

Stel de pasvorm van het model in op de opnamecurve. Stel de verhouding van Poisson in op 0,45 zoals aanbevolen voor zachte weefsels zoals de lever. Stel de pasvorm van de curve in met behulp van een basislijngraad van drie en een contactgraad van één.

Wijzig de mate van polynomiale fit op basis van de schaal van afwijkingen van de curven van het model. Selecteer het model dat wordt gebruikt om in de onttrekkingscurven te passen als het Sneddon-model. Vul de straal van de bolvormige punt in tot 2,9 micrometer.

Laad de veerconstante en invOLS uit de gegevensbestanden door inlezen in te schakelen en klik vervolgens op voltooien. Na data-analyse doorloop je de krachtcurves. Sluit de krachtcurven uit waarbij de cantilever het oppervlak van het levergedeelte verkeerd benaderde.

Deze rondingen hebben een hoge ruis en afwijkende vormen. Hierna kunnen de gegevens worden gekopieerd of geëxporteerd. In deze studie werden mild gefixeerde leversecties verkregen van de controlemuizen en muizen met milde en gevorderde fibrose geïnduceerd door de injectie van koolstoftetrachloride onderzocht met AFM.

Gebieden dicht bij de centrale aderen die overeenkomen met de gebieden waar collageenvezels in koolstoftetrachloridemuizen zich meestal vormen, werden geanalyseerd in controlelevers. De verdeling van Young's moduli was reproduceerbaar over verschillende regio's in controlelevers en collageenrijke gebieden binnen een enkele leversectie. Bij met koolstoftetrachloride behandelde muizen vertoonden stijfheidskaarten die overeenkomen met de pericentrale gebieden van collageenafzettingen significant hogere waarden van Young's moduli in vergelijking met equivalente gebieden in controlemuizen.

Bovendien was er een significante toename van de waarden van Young's moduli bij een langere behandeling. Het effect van langdurige opslag van leversecties op de mechanische eigenschappen van collageenvezels werd ook beoordeeld. AFM-metingen toonden significant lagere waarden van Young's moduli in collageenrijke gebieden voor secties die drie maanden werden bewaard, vergeleken met die verkregen binnen twee weken.

De tijd van fixatie van de leversectie bepaalt in grote mate de mechanische eigenschappen van de leversectie. We raden aan om de getimede intervallen die in het protocol worden vermeld, strikt te volgen. Na bepaalde optimalisaties in het protocol kan de gegeven methode worden gebruikt voor zachte weefsels met significante collageenafzetting, die detecteerbaar is door polariserende microscopie.

De gegeven techniek biedt de onderzoekers een uniform en handig protocol om het mechanisme van lever te bestuderen voor gezond en ziek.