Name: Gedifferentieerde muis adipocyten in primaire cultuur: een model van insulineresistentie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Leer hoe je gedifferentieerde muis adipocyten isoleert en kweekt om insulineresistentie te bestuderen. Deze methode gebruikt westerse blotanalyse om insulinesignaalering te evalueren in primaire cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla en María Antonieta Carbajo voor hun technische assistentie, en Jessica Gonzalez Norris voor het kritisch bewerken van het manuscript. Dit protocol werd ondersteund door Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (aan Y.M.).

Alle knaagdierexperimenten werden goedgekeurd door de Commissie Bio-ethiek van het Instituut voor Neurobiologie van de UNAM, protocolnummer 075.
1. Isolatie van adipocytenvoorlopercellen van muizen
<ol><li>Euthanaseer 8-10 weken oude mannelijke C57BL/6-muizen (bijv. door CO 2-inhalatie en daaropvolgende cervicale dislocatie) (vier dieren per isolatie). Desinfecteer de muizen door te wrijven met 70% ethanol en verkrijg het vetweefsel onmiddellijk na het offer. OPMERKING: Isoleer na de euthanasie van knaagdieren het vetweefsel onmiddellijk en voer alle stappen uit in een steriele laminaire stroomkap. Muizen worden onder 12 uur licht/donker cycli gehouden met vrije toegang tot voedsel en water.</li>
	<li>Ontleed het inguinale onderhuidse vetweefsel van elke muis. Verwijder alleen het vetweefsel, vermijd de verwijdering van spieren, huid of ander weefsel en verzamel het in een conische buis van 50 ml met 15 ml type 1 collagenase-oplossing (1,5 mg / ml) op ijs. Los type 1 collagenase op in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) hoog glucose-1% runderserumalbumine (BSA) en filtreer door spuitfilters van 0,2 μm.</li>
	<li>Snijd het vetweefsel in kleine stukjes met een steriele chirurgische schaar en verteer de monsters door incubatie met type 1 collagenase-oplossing bij 37 °C in een orbitale shaker (150 rpm) gedurende 30 minuten (plaats de buis met vet en collagenase in een horizontale positie voor een groter schudoppervlak). Controleer de spijsvertering elke 10 minuten om er zeker van te zijn dat deze werkt (weefselafbraak is zichtbaar) en om overdigestie te voorkomen (zie aanvullende figuur S1).</li>
	<li>Filter met een mesh-spuit van 200 μm (voorheen geautoclaveerd) om weefsel te verwijderen dat niet is verteerd met collagenase. Breng het filter over de rand van de buis om zoveel mogelijk cellen in de oplossing af te voeren. Voeg 15 ml koude DMEM-1% BSA toe om de spijsvertering te stoppen en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 400 × g bij 4 °C.</li>
	<li>Zuig de bovenste laag met rijpe adipocyten en het grootste deel van de vloeibare laag op; Vermijd het aanraken of verstoren van de pellet. Voeg 20 ml koud fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)-2% foetaal runderserum (FBS) toe en resuspensie van de pellet. Centrifugeer bij 400 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en zuig eerst de bovenste laag aan om de resterende adipocyten en vet te verwijderen. Resuspendeer de pellet in 1 ml ammoniumchloridekalium (ACK) lyseringsbuffer (om rode bloedcellen te lyseren) en incubeer gedurende 5 minuten op ijs. Voeg 10 ml PBS-2% FBS toe, meng en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 × g bij 4 °C.</li>
	<li>Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 200 μL anti-Fc-oplossing (gezuiverde rat anti-muis CD16/CD32 verdund in PBS-2% FBS [1:150]) om de Fc-receptor-gemedieerde binding door antilichamen van belang te verminderen. Incubeer op ijs gedurende 5 min. Breng de celsuspensie over in een buis van 5 ml die in de voorgekoelde rekken van een magnetische celscheider past en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 × g bij 4 °C.</li>
	<li>Elimineer het supernatant, voeg 200 μL van het mengsel van CD31 (PECAM-1) monoklonaal antilichaam (390) -biotine (1:100) en CD45 monoklonaal antilichaam (30-F11)-biotine (1:100) toe, meng goed en incubeer gedurende 15 minuten op ijs (bereid antilichaamverdunningen in anti-Fc-oplossing; zie tabel 1). Voeg 400 μL PBS-2% FBS toe en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 × g bij 4 °C. OPMERKING: CD31 en CD45 zijn markers van respectievelijk endotheelcellen en hematopoëtische cellen.</li>
	<li>Zuig het supernatant op en incubeer in 100 μL anti-biotine microbeads (1:5) gedurende 15 minuten op ijs (bereid antilichaamverdunningen in anti-Fc-oplossing, zie tabel 1). Voeg 400 μL PBS-2% FBS toe en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 × g bij 4 °C.</li>
	<li>Gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellet in 350 μL PBS-2% FBS. Verwijder celaggregaten of grote deeltjes uit de eencellige suspensies met een voorscheidingsfilter (70 μm). Activeer eerst het filter met 100 μL PBS-2% FBS, passeer de celsuspensie door het filter (verzamel in een schone buis) en was ten slotte het filter met 100 μL PBS-2% FBS.</li>
	<li>Voer magnetische scheiding van cellen uit met behulp van de negatieve scheidingsstrategie met een magnetische celscheider.<ol><li>Plaats het monster in positie A van het koelrek (zorg ervoor dat het rek is voorgekoeld) en twee lege buizen in positie B en C om respectievelijk de niet-gelabelde en gelabelde cellen terug te winnen.</li>
		<li>Laad de wasbuffer en de lopende buffer in de bijbehorende flessen voordat u de apparatuur inschakelt. Programmeer de apparatuur om de magnetische scheiding van cellen uit te voeren met het DEPLETE-protocol . OPMERKING: Dit protocol is voor uitputting in de standaardmodus voor het verwijderen van cellen met normale antigeenexpressie (in dit geval cellen gelabeld met anti-CD31 en anti-CD45), als herstel de hoogste prioriteit heeft.</li>
		<li>Selecteer in de scheidingssectie het aantal monsters dat moet worden gescheiden en selecteer het DEPLETE-protocol . Druk op Uitvoeren en start de scheiding. Aan het einde van het programma worden de niet-gelabelde cellen teruggewonnen en centrifugeer u gedurende 5 minuten bij 400 × g bij 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspensie van de pellet in 500 μL groeimedium (tabel 1).</li>
	<li>Zaai de APC's in een put van een 12-putplaat die eerder is bedekt met 2,5% keldermembraanmatrix (ongeveer 50.000-75.000 cellen worden verkregen). Voeg 400 μL 2,5% keldermembraanmatrix toe om het hele oppervlak van elke put te bedekken. Laat de plaat onmiddellijk na het verwijderen van de overtollige oplossing en het achterlaten van slechts een kleine laag de plaat drogen (zonder deksel) in de laminaire stroomkap gedurende ten minste 1 uur. Incubeer bij 37 °C in een CO 2-atmosfeer van 5%. Verander het medium elke 48 uur totdat de cellen 80% samenvloeiing bereiken.</li>
	<li>Verwijder bij 80% samenvloeiing het medium volledig en was met 350 μL PBS-2% FBS. Oogst de cellen met 350 μL 0,05% trypsine-EDTA gedurende 2 minuten bij 37 °C. Voeg 2 ml groeimedium toe en verzamel de cellen in een nieuwe conische buis van 50 ml en centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten op 400 × g .</li>
	<li>Passeer de APC's naar 12-putplaten (10.000-20.000 cellen per put) die eerder zijn bedekt met 2,5% keldermembraanmatrix. Incubeer bij 37 °C met 5% CO2. Verander het medium elke 48 uur totdat de cellen 80% samenvloeiing bereiken. OPMERKING: APC's kunnen eenmaal worden gepasseerd. Vervolgens verliezen ze hun vermogen om zich te vermenigvuldigen en te differentiëren. Zie de workflow voor het APC-isolatieproces in aanvullende figuur S2.</li>
</ol>2. Adipocytendifferentiatie en inductie van insulineresistentie
OPMERKING: Houd de cellen op 37 °C in 5% CO2 en voer stappen uit waarbij het medium wordt veranderd en behandelingen met TNF-α en insuline in een steriele kap.
<ol><li>Begin bij 80% samenvloeiing met het differentiatieproces; zuig elk groeimedium af en vervang het door 500 μL differentiatiemedium (tabel 1) met 3,3 nM botmorfogenetisch eiwit (BMP4) in elk putje.</li>
	<li>Vervang het medium na 48 uur door het differentiatiemedium (500 μL per put) en de differentiatiecocktail (tabel 1).</li>
	<li>Verwijder het medium 72 uur later en voeg 100 nM insuline toe aan 500 μL vers differentiatiemedium. OPMERKING: Cellen beginnen een rond uiterlijk te vertonen met kleine lipidedruppeltjes erin.</li>
	<li>Zuig elk differentiatiemedium af en vervang het 48 uur later door 500 μL eenvoudig medium-2% FBS (tabel 1). Induceer insulineresistentie met 4 ng/ml TNF-α. Inclusief controleputten zonder TNF-α behandeling.</li>
	<li>Voeg na 24 uur incubatie 4 ng/ml TNF-α toe in eenvoudige medium-0% FBS (tabel 1). Onderhoud controleputten zonder TNF-α behandeling.</li>
	<li>Activeer de insulinesignaleringsroute 24 uur later door 100 nM insuline toe te voegen en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C in een 5% CO 2-atmosfeer. Verwijder het medium en was met 500 μL PBS. Inclusief controleputten zonder insulinebehandeling.</li>
</ol>3. Evaluatie van de insulinesignaleringsroute door western blot
<ol><li>Eiwitextractie en kwantificering<ol><li>Was elk putje van cellen met 500 μL PBS en houd het op ijs om de cellen te lyseren in 50 μL RIPA-buffer (tabel 1) met 1% proteaseremmercocktail toegevoegd net voor de monsterisolatie. Schraap het hele oppervlak van de put met een punt en breng het lysaat over in een microcentrifugebuis van 0,6 ml (op ijs houden).</li>
		<li>Incubeer gedurende 1 uur bij 4 °C in een roterende schudder, meng door vortexing en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 8.000 × g bij 4 °C en win het supernatant terug (op ijs houden).</li>
		<li>Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-test (verdun het monster niet om te kwantificeren).</li>
		<li>Neem het benodigde volume dat overeenkomt met 40-60 μg en denatureer met 6x Laemmli-buffer (tabel 1) door gedurende 15 minuten bij 97 °C te broeden terwijl u schudt bij 550 tpm. Invriezen tot gebruik.</li>
	</ol></li>
	<li>SDS-polyacrylamide gel elektroforese<ol><li>Voer SDS-polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) uit met een 7,5% polyacrylamide gel van 1,5 mm dikte. Steek de gel in de tank en vul met loopbuffer (tabel 1).</li>
		<li>Voeg 3 μL voorgeroeste eiwitstandaard toe aan de eerste put van de gel en laad elk monster in volgende putjes.</li>
		<li>Laat de gel ongeveer 15 minuten op 80 V draaien om ervoor te zorgen dat het monster in de gelmatrix van de polyacrylamideconcentrator komt. Verhoog daarna de spanning tot 90 V gedurende 2,5 uur of totdat de 37 kDa molecuulgewichtsmarker aan de onderkant van de gel te zien is.</li>
		<li>Breng de eiwitten van de gel over naar een nitrocellulosemembraan in een halfdroge kamer gedurende 35 minuten bij 25 V. Dompel vooraf de gel, het membraan en de filters gedurende enkele minuten onder in de transferbuffer (tabel 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Western blot<ol><li>Was het membraan na de overdracht gedurende 3 minuten met Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) met 0,1% Tween 20 (TBS-T 0,1%) (tabel 1) met schudden bij 30 tpm.</li>
		<li>Blokkeer het membraan met de blokkeringsoplossing (tabel 1) bij 4 °C gedurende 1 uur in constante rotatie.</li>
		<li>Snijd het membraan in drie delen volgens de molecuulgewichtsmarker om 's nachts te incuberen met verschillende primaire antilichamen (verdund in blokkerende oplossing) bij 4 °C in constante rotatie: fosfo-IRS1 (Tyr608) antilichaam (1:1.000), verwachte band bij 180 kDa; Fosfo-insulinereceptor β (Tyr1150/1151) antilichaam (1:1.000), verwachte band bij 95 kDa; Fosfo-Akt (Ser473) antilichaam (1:1.000), verwachte band bij 60 kDa.</li>
		<li>Was de vliezen 5x gedurende 5 min elk met TBS-T 0,1%.</li>
		<li>Incubeer de membranen met het overeenkomstige peroxidase-gekoppelde secundaire antilichaam (verdund in blokkerende oplossing) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in constante rotatie: peroxidase affiniPure ezel anti-konijn IgG (H + L) (1: 5.000).</li>
		<li>Was de vliezen 5x gedurende 5 min elk met TBS-T 0,1%.</li>
		<li>Detecteer de eiwitten met behulp van het chemiluminescentiedetectiesysteem. Bereid het substraat voor volgens de instructies van de fabrikant.</li>
		<li>Doe de vlek in een plastic zak en voeg 200 μL chemiluminescent substraat toe om het membraan volledig te bedekken. Laat overtollig substraat aftappen en verwijder eventuele luchtbellen.</li>
		<li>Stel elke vlek gedurende 30-60 s bloot in een hoogwaardig beeldvormingssysteem dat compatibel is met chemiluminescentie.</li>
		<li>Strip de membranen (stappen 10-13 van de western blot-sectie) om de antilichaam-antigeeninteracties te breken en zo nitrocellulosemembranen opnieuw te laten uitwissen. Recupereer de membranen en was 3x gedurende 5 min elk met TBS-T 1% bij 50 rpm.</li>
		<li>Incubeer gedurende 7 minuten met 10 ml van 0,2 M NaOH bij 50 tpm.</li>
		<li>Was 3x gedurende 5 min elk met kraanwater op 50 rpm.</li>
		<li>Was gedurende 10 minuten met TBS-T 1% bij 50 tpm.</li>
		<li>Herhaal stap 2-9 van de western blot-sectie om het membraan te incuberen met anti-bèta-tubuline (55 kDa) als belastingscontrole met behulp van 1:1.000 verdunning.</li>
		<li>Voer densitometrische analyse25 uit voor elk eiwit met behulp van ImageJ-software (https://imagej.nih.gov/).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Elmus, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+signaling+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Insulin signaling and insulin resistance.</a> Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).</li>
<li>Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+stimulates+tyrosine+phosphorylation+of+the+insulin+receptor+in+a+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system.</a> Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).</li>
<li>Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+stimulates+the+phosphorylation+of+the+95%2C000-dalton+subunit+of+its+own+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit of its own receptor.</a> Science. 215 (4529), 185-187 (1982).</li>
<li>Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+nodes+in+signalling+pathways%3A+insights+into+insulin+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 85-96 (2006).</li>
<li>Freeman, A. M., Pennings, N. Insulin Resistance. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/</a> (2021).</li>
<li>Petersen, M. C., Shulm, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+insulin+action+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of insulin action and insulin resistance.</a> Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).</li>
<li>Batista, T. M., Haider, N., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+underlying+defect+in+insulin+action+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Defining the underlying defect in insulin action in type 2 diabetes.</a> Diabetologia. 64 (5), 994-1006 (2021).</li>
<li>Unamuno, X., Frühbeck, G., Catalán, V. Adipose Tissue. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aUnamuno%2C+X+%22Encyclopedia+of+Endocrine+Diseases.+Second+edition%22">Encyclopedia of Endocrine Diseases. Second edition</a>. , Academic Press. 370-384 (2019).</li>
<li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pink+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Pink adipocytes.</a> Trends in Endocrinology & Metabolism. 29 (9), 651-666 (2018).</li>
<li>Kahn, B. B., Flier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Obesity and insulin resistance.</a> The Journal of Clinical Investigation. 106 (4), 473-481 (2000).</li>
<li>Klemm, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-induced+adipocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Insulin-induced adipocyte differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (30), 28430-28435 (2001).</li>
<li>Wilcox, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Clinical+Biochemist.+Reviews%22%5BJournal%5D)">Insulin and insulin resistance.</a> The Clinical Biochemist. Reviews. 26 (2), 19-39 (2005).</li>
<li>Yohannes, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+insulin+resistance%2C+and+type+2+diabetes%3A+associations+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2C+Metabolic+Syndrome+and+Obesity%3A+Targets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 13, 3611-3616 (2020).</li>
<li>James, D. E., Stöckli, J., Birnbaum, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+etiology+and+molecular+landscape+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The etiology and molecular landscape of insulin resistance.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (11), 751-771 (2021).</li>
<li>Wondmkun, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+insulin+resistance%2C+and+type+2+diabetes%3A+associations+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2C+Metabolic+Syndrime+and+Obesity%3A+Targets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications.</a> Diabetes, Metabolic Syndrime and Obesity: Targets and Therapy. 9 (13), 3611-3616 (2020).</li>
<li>Hardy, O. T., Czech, M. P., Corvera, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+causes+the+insulin+resistance+underlying+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Endocrinology%2C+Diabetes%2C+and+Obesity%22%5BJournal%5D)">What causes the insulin resistance underlying obesity.</a> Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 19 (2), 81-87 (2012).</li>
<li>Klein, S., Gastaldelli, A., Yki-Järvinen, H., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+does+obesity+cause+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Why does obesity cause diabetes.</a> Cell Metabolism. 34 (1), 11-20 (2022).</li>
<li>Lo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+in+vitro+insulin-resistance+models+and+their+physiological+relevance+to+in+vivo+diet-induced+adipose+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of in vitro insulin-resistance models and their physiological relevance to in vivo diet-induced adipose insulin resistance.</a> Cell Reports. 5 (1), 259-270 (2013).</li>
<li>Asterholm, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+inflammation+is+essential+for+healthy+adipose+tissue+expansion+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling.</a> Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).</li>
<li>Hotamisligil, G. S., Murray, D. L., Choy, L. N., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+alpha+inhibits+signaling+from+the+insulin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor alpha inhibits signaling from the insulin receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (11), 4854-4858 (1994).</li>
<li>Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Parijs, L. V., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-%CE%B1+suppresses+adipocyte-specific+genes+and+activates+expression+of+preadipocyte+genes+in+3T3-L1+adipocytes.+Nuclear+factor-%CE%BAB+activation+by+TNF-%CE%B1+is+obligatory%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-α suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes. Nuclear factor-κB activation by TNF-α is obligatory.</a> Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).</li>
<li>Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+receptor+signaling+in+normal+and+insulin-resistant+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 009191(2014).</li>
<li>Hotamisligil, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRS-1-mediated+inhibition+of+insulin+receptor+tyrosine+kinase+activity+in+TNF-alpha-+and+obesity-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-alpha- and obesity-induced insulin resistance.</a> Science. 271 (5249), 665-668 (1996).</li>
<li>Copps, K. D., White, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+insulin+sensitivity+by+serine%2Fthreonine+phosphorylation+of+insulin+receptor+substrate+proteins+IRS1+and+IRS2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Regulation of insulin sensitivity by serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate proteins IRS1 and IRS2.</a> Diabetologia. 55 (10), 2565-2582 (2012).</li>
<li>Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+western+blots%3A+pitfalls+of+densitometry%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Quantifying western blots: pitfalls of densitometry.</a> Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).</li>
<li>Skurk, T., Hauner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+human+adipocyte+precursor+cells%3A+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary culture of human adipocyte precursor cells: expansion and differentiation.</a> Methods in Molecular Biology. 806, 215-226 (2012).</li>
<li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+preadipocytes+from+rodent+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 456, 201-219 (2008).</li>
<li>Macotela, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+differences+in+adipocyte+precursor+cells+from+different+white+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots.</a> Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).</li>
<li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li>
<li>Hausman, D. B., DiGirolamo, M., Bartness, T. J., Hausman, G. J., Martin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+white+adipocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+Reviews%22%5BJournal%5D)">The biology of white adipocyte proliferation.</a> Obesity Reviews. 2 (4), 239-254 (2001).</li>
<li>Kirkland, I. M., Tchkonia, T., Pirtskhalava, T., Han, J., Karagiannides, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenesis+and+aging%3A+does+aging+make+fat+go+MAD%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Geronotology%22%5BJournal%5D)">Adipogenesis and aging: does aging make fat go MAD.</a> Experimental Geronotology. 37 (6), 757-767 (2002).</li>
<li>Guo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+results+in+paradoxical+susceptibility+of+fat+cell+progenitors+to+lipotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Aging results in paradoxical susceptibility of fat cell progenitors to lipotoxicity.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (4), 1041-1051 (2007).</li>
<li>Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Van Parijs, L., Lodish, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F.Tumor+necrosis+factor-a+suppresses+adipocyte-specific+genes+and+activatesexpression+of+preadipocyte+genes+in+3T3-L1+adipocytes%3A+nuclear+factor-kappaB+activation+by+TNF-a+is+obligatory%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">F.Tumor necrosis factor-a suppresses adipocyte-specific genes and activatesexpression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNF-a is obligatory.</a> Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).</li>
<li>Jager, J., Gre ́meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1b-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+throughdown-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1b-induced insulin resistance in adipocytes throughdown-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li>
<li>Rotter, V., Nagaev, I., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-6+%28IL-6%29+induces+insulinresistance+in+3T3-L1+adipocytes+and+is%2C+like+IL-8+and+tumor+necrosis+factor-a%2Coverexpressed+in+human+fat+cells+from+insulin-resistant+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interleukin-6 (IL-6) induces insulinresistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor-a,overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (46), 45777-45784 (2003).</li>
<li>Isidor, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+rewires+the+metabolic+gene+program+and+glucose+utilization+in+human+white+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Obesity%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes.</a> International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).</li>
<li>Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+have+a+causal+role+in+multiple+forms+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance.</a> Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Dit artikel biedt een methode voor het bestuderen van insulineresistentie die primaire adipocyten gebruikt in cultuur behandeld met TNF-α. Dit model heeft het voordeel dat primaire adipocyten gedurende lange tijd onder gedefinieerde omstandigheden kunnen worden gekweekt met een strakke controle van cellulaire omgevingsfactoren26. De testduur is 15-20 dagen, hoewel variaties in het percentage gedifferentieerde adipocyten kunnen optreden tussen experimenten. Primaire adipocyten hebben voordelen ten ...

Insuline is een anabolisch hormoon geproduceerd door pancreas eilandje β-cellen en de belangrijkste regulator van glucose en lipiden metabolisme. Onder de vele functies reguleert insuline de opname van glucose, glycogeensynthese, gluconeogenese, eiwitsynthese, lipogenese en lipolyse1. Het initiële moleculaire signaal na insuline-interactie met zijn receptor (IR) is de activering van de intrinsieke tyrosine-eiwitkinaseactiviteit van IR2, resulterend in de autofosforylering3 en de daaropvolgende activering van een familie van eiwitten die bekend staat als insulinereceptorsubstraten (IRS), die bindt aan adaptoreiwitten die leiden tot activering van een cascade van eiwitkinasen4 . Insuline activeert twee belangrijke signaalroutes: fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K)-eiwitkinase B (AKT) en Ras-mitogeen-geactiveerd eiwitkinase (MAPK). De eerste vormt een belangrijk vertakkingspunt of knooppunt 4,5 voor de activering van talrijke downstream-effectoren die betrokken zijn bij diverse fysiologische functies, waaronder de regulatie van brandstofhomeostase, terwijl de laatste de celgroei en differentiatie reguleert 4,6. Insuline acties zijn uiteindelijk afhankelijk van het celtype en de fysiologische context7.
Een van de belangrijkste insuline-responsieve metabole weefsels is het vetweefsel. Wit vetweefsel is het meest voorkomende type vet bij mensen en knaagdieren, verdeeld in onderhuids vet (tussen de huid en spieren) en visceraal vet (rond de organen in de buikholte). Gezien hun grote volume zijn adipocyten of vetcellen het meest voorkomende celtype in vetweefsel. Deze vetcellen kunnen bruin/beige (thermogeen), roze (in de borstklier) en wit 8,9 zijn. Witte adipocyten houden de belangrijkste energiereserves in het lichaam in de vorm van triglyceriden, een insulineafhankelijk proces. Insuline bevordert glucosetransport en lipogenese, terwijl het lipolyse of lipidenafbraak remt 7,10. Het vergemakkelijkt ook de differentiatie van preadipocyten in adipocyten - de volwassen vetopslagcellen11.
Insulineresistentie treedt op wanneer een normaal insulineniveau een verzwakte biologische respons produceert, wat resulteert in compenserende hyperinsulinemie12. Insulineresistentie is een aandoening geassocieerd met overgewicht en obesitas5, die in combinatie leidt tot diabetes type 2 (T2D) en andere stofwisselingsziekten13. Hyperinsulinemie compenseert insulineresistentie in perifere weefsels om normale bloedglucosespiegels te handhaven14. Uiteindelijk β-celverlies of -uitputting, samen met verergerde insulineresistentie, leidt echter tot verhoogde bloedglucosespiegels die consistent zijn met T2D5. Daarom kunnen insulineresistentie en hyperinsulinemie bijdragen aan de ontwikkeling van van obesitas afgeleide metabole ziekten15. Bovendien kan obesitas chronische laaggradige lokale ontsteking veroorzaken die insulineresistentie in vetweefsel bevordert15,16,17. Bovendien leiden van obesitas afgeleide veranderingen in vetweefsel, zoals fibrose, ontsteking en verminderde angiogenese en adipogenese, tot lagere adiponectine-serumspiegels (een insulinesensibilisator) en verhoogde secretie van factoren zoals plasminogeenactivatorremmer 1 (PAI-1), vrije vetzuren en exosomen in de bloedbaan, waardoor insulineresistentie wordt verergerd17.
Veel aspecten die ten grondslag liggen aan insulineresistentie blijven onbekend. In vitro en in vivo modellen zijn ontwikkeld om de mechanismen te bestuderen die insulineresistentie bemiddelen in belangrijke doelweefsels, waaronder vetweefsel. Het voordeel van in vitro modellen is dat onderzoekers meer controle hebben over de omgevingscondities en insulineresistentie in specifieke celtypen kunnen evalueren. Met name adipocytenvoorlopercellen (APC's) hebben het individuele fenotype van het donorweefsel, dat de fysiologie beter kan weerspiegelen dan adipocytcellijnen. Een belangrijke factor die insulineresistentie in vitro induceert, is tumornecrosefactor-α (TNF-α). TNF-α is een pro-inflammatoir cytokine dat wordt uitgescheiden door adipocyten en macrofagen in vetweefsel18. Hoewel het nodig is voor een goede remodellering en expansie van vetweefsel19, induceert langdurige blootstelling aan TNF-α insulineresistentie in vetweefsel in vivo en in adipocyten in vitro20. Chronische TNF-α behandeling van verschillende celtypen leidt tot verhoogde serinefosforylering van zowel IR als IRS-1, waardoor verminderde tyrosinefosforylering wordt bevorderd21. Verhoogde fosforylering van IRS-1 op serineresiduen remt de IR-tyrosinekinaseactiviteit en kan een van de belangrijkste mechanismen zijn waardoor chronische TNF-α behandeling de insulinewerking schaadt22,23. TNF-α activeert routes waarbij de serine/threonine kinaseremmer van nucleaire factor ĸB kinase β (IKKβ) en c-Jun N terminal kinase (JNK)24 betrokken zijn. JNK induceert een complex pro-inflammatoir transcriptioneel programma, maar fosforyleert ook direct IRS-16.
Het begrijpen van de pathogenese van insulineresistentie is steeds belangrijker geworden om de ontwikkeling van toekomstige therapieën tegen T2D te begeleiden. APC's hebben bewezen een uitstekend model te zijn voor de studie van vetcelbiologie, inclusief de gevoeligheid en resistentie tegen insuline, en voor het identificeren van de intrinsieke eigenschappen van adipocyten onafhankelijk van de systemische omgeving. APC's kunnen gemakkelijk worden verkregen uit verschillende vetdepots en onder de juiste omstandigheden worden gedifferentieerd in volwassen adipocyten. Met deze methode kunnen directe effecten op insulineresistentie/gevoeligheid in adipocyten worden geëvalueerd.

<table><tbody><tr><td>1. Isolatie van muis adipocyte precursor cellen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACK lysing buffer&nbsp;</td><td>LONZA</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Biotin Microbeads&nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31</td><td>eBioscience</td><td>13-0311-85</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Pro Separator</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Basement membrane matrix (matrigel)</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>Groeifactor</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Equitech-Bio, Inc.</td><td>BAC63-1000</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>13-0451-85</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, Type 1</td><td>Worthington Biochem</td><td>LS004197</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>DMEM low glucose</td><td>GIBCO</td><td>31600-034</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>Groeifactor</td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>ITS mix</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbinezuur 2-fosfaat</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>Millipore</td><td>ESG1107</td><td>Groeifactor</td></tr><tr><td>Linolzuur-albumine</td><td>Sigma</td><td>L9530</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 201 medium</td><td>Sigma</td><td>M6770</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-2</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>315-18</td><td>Groeifactor</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>BioWest</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>Pre-Separation Filters (70 &micro;m)</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>Gezuiverd rat anti-muis CD16 / CD32&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>2. Differentiatie van adipocyten en inductie van insulineresistentie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX]</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td>Differentiatiecocktail</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R&amp;D Systems</td><td>5020-BP-010</td><td>Differentiatiecocktail</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma</td><td>D1756</td><td>Differentiatiecocktail</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Cayman</td><td>71742</td><td>Differentiatiecocktail</td></tr><tr><td>TNF&alpha;</td><td>R&amp;D Systems</td><td>210-TA-005&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>3. Evaluatie van de insulinesignaleringsroute door middel van western blot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-beta tubulin antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab6046</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenolblauw</td><td>BioRad</td><td>161-0404</td><td>Laemmli buffer</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>RIPA buffer</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td>RIPA buffer</td></tr><tr><td>FluorChem E systeem</td><td>ProteinSimple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G6279</td><td>Laemmli buffer</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7126</td><td>Lopen en Overdracht buffer</td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma</td><td>I3021</td><td>RIPA buffer</td></tr><tr><td>2- mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>Laemmli buffer</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>JT Baker</td><td>907007</td><td>Overdracht buffer</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>JT Baker</td><td>3624-05</td><td>TBS-T</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma</td><td>77F-0379</td><td>RIPA buffer</td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>JT Baker</td><td>3722-19</td><td></td></tr><tr><td>Na4P2O7</td><td>Sigma</td><td>114F-0762</td><td>RIPA buffer</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td>RIPA buffer</td></tr><tr><td>Nitrocellulose membraan&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Vetvrije droge melk</td><td>BioRad</td><td>1706404</td><td>Blocking solution</td></tr><tr><td>Voorbehandelde eiwitstandaard&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1610395</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8340-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Ezel Anti-Konijn IgG (H+L)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-035-132</td><td></td></tr><tr><td>Phospho- Insulin Receptor &beta;&nbsp;</td><td>Cell signaling</td><td>3024</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-Akt (Ser473) Antilichaam</td><td>Cell signaling</td><td>9271</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-IRS1 (Tyr608) antilichaam</td><td>Millipore</td><td>9432</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose&nbsp;</td><td>JT Baker</td><td>407205</td><td>RIPA buffer</td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioRad</td><td>1610302</td><td>Lopen en laemmli buffer</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substraat</td><td>Thermo Scientific</td><td>34577</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td>Lopen, overdracht en laemmli buffer</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>JT Baker</td><td>4103-02</td><td>RIPA buffer - TBS</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td>TBS-T</td></tr></tbody></table>

gedifferentieerde muis adipocyten in primaire cultuur: een model van insulineresistentie

Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance

Insulineresistentie is een verminderd effect van insuline op de doelcellen, meestal afgeleid van verminderde insulinereceptorsignalering. Insulineresistentie draagt bij aan de ontwikkeling van diabetes type 2 (T2D) en andere van obesitas afgeleide ziekten met een hoge prevalentie wereldwijd. Daarom is het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan insulineresistentie van groot belang. Verschillende modellen zijn gebruikt om insulineresistentie zowel in vivo als in vitro te bestuderen; Primaire adipocyten vormen een aantrekkelijke optie om de mechanismen van insulineresistentie te bestuderen en moleculen te identificeren die deze aandoening tegengaan en de moleculaire doelen van insuline-sensibiliserende geneesmiddelen. Hier hebben we een insulineresistentiemodel opgesteld met behulp van primaire adipocyten in cultuur behandeld met tumornecrosefactor-α (TNF-α).
Adipocytenvoorlopercellen (APC's), geïsoleerd uit collagenase-verteerd onderhuids vetweefsel van muizen door magnetische celscheidingstechnologie, worden gedifferentieerd in primaire adipocyten. Insulineresistentie wordt vervolgens geïnduceerd door behandeling met TNF-α, een pro-inflammatoir cytokine dat de tyrosinefosforylering / activering van leden van de insulinesignaleringscascade vermindert. Verminderde fosforylering van insulinereceptor (IR), insulinereceptorsubstraat (IRS-1) en eiwitkinase B (AKT) worden gekwantificeerd door western blot. Deze methode biedt een uitstekend hulpmiddel om de mechanismen te bestuderen die insulineresistentie in vetweefsel bemiddelen.

In de afgelopen jaren heeft de toegenomen prevalentie van obesitas en T2D geleid tot een intense zoektocht naar de mechanismen die insulineresistentie in vetweefsel bemiddelen. Met het hier beschreven protocol kunnen APC's worden gedifferentieerd in volwassen adipocyten om insulineresistentie en -gevoeligheid te evalueren. Zodra de APC's confluentie bereiken, duurt het 10 dagen om hun differentiatie in volwassen adipocyten en hun TNF-α-gemedieerde inductie van insulineresistentie te voltooien (figuur...

Dit protocol beschrijft de isolatie van muis preadipocyten uit onderhuids vet, hun differentiatie in volwassen adipocyten en de inductie van insulineresistentie. De werking van insuline wordt geëvalueerd door de fosforylering/activering van leden van de insulinesignaleringsroute door western blot. Deze methode maakt directe bepaling van insulineresistentie/gevoeligheid in primaire adipocyten mogelijk.

Gedifferentieerde muis adipocyten in primaire cultuur: een model van insulineresistentie

Insulin resistance is a reduced effect of insulin on its target cells, usually derived from decreased insulin receptor signaling. Insulin resistance ...

Insulineresistentie kan worden geëvalueerd in primaire adipocyten, waardoor donoren kunnen worden bestudeerd onder verschillende fysiopathologische contexten, zoals mager versus zwaarlijvig, of cellen van verschillende vetdepo's. Primaire adipocyten behouden veel van hun intrinsieke eigenschappen en kunnen gedurende een lange periode onder gedefinieerde omstandigheden worden gekweekt, met een strakke controle van cellulaire omgevingsfactoren. Om het differentiatieproces te starten, moeten cellen op 80% samenvloeiing zijn.Als differentiatie begint bij een lagere of hogere samenvloeiing, zullen cellen minder differentiëren of hun differentiatiecapaciteit verliezen. Nadat je het dier hebt opgeofferd, desinfecteer je de muizen door ze in te wrijven met 70% ethanol. Ontleed het inguinale onderhuidse vetweefsel van elke muis en verzamel het in een conische buis van 15 milliliter, met 15 milliliter collagenase-oplossing van het type één op ijs.Snijd het vetweefsel in kleine stukjes met een steriele chirurgische schaar en verteer de monsters door incubatie met type één collagenase-oplossing bij 37 graden Celsius in een orbitale shaker bij 150 RPM gedurende 30 minuten. Controleer de spijsvertering elke 10 minuten om er zeker van te zijn dat het werkt en om oververtering te voorkomen. Filter met behulp van een 200-micrometer gaasspuit om het weefsel te verwijderen dat niet is verteerd met collagenase en passeer het filter over de rand van de buis om zoveel mogelijk cellen in de oplossing af te voeren.Voeg 15 milliliter koude DMEM 1% BSA toe om de spijsvertering te stoppen en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 400 G bij vier graden Celsius. Zuig de bovenste laag aan die rijpe adipocyten bevat en het grootste deel van de vloeibare laag. Voeg er 20 milliliter koude PBS 2% FBS aan toe en resuspensie van de pellet.Nadat u opnieuw gedurende vijf minuten hebt gecentrifugeerd, verwijdert u het supernatant door de bovenste laag aan te zuigen om de resterende adipocyten en vet te verwijderen. Resuspendeerde de pellet in één milliliter ACK-lysingsbuffer. Incubeer vijf minuten op ijs.Voeg 10 milliliter PBS 2% FBS toe en meng het. Na vijf minuten centrifugeren en het supernatant opzuigen, resuspensie de pellet in 200 microliter anti-FC-oplossing. Incubeer gedurende vijf minuten op ijs en breng de celsuspensie over naar een buis van vijf milliliter die in de voorgekoelde rekken van een magnetische celscheider past.Na vijf minuten centrifugeren en het supernatant elimineren, voeg je er 200 microliter van het mengsel van CD 31 monoklonaal antilichaambiotine en CD 45 monoklonaal antilichaambiotine aan toe. Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten op ijs. Voeg vervolgens 400 microliter PBS 2% FBS toe en centrifugeer opnieuw op 400 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.Zuig het supernatant op en incubeer het in 100 microliter anti-biotine microbeads gedurende 15 minuten op ijs. Voeg 400 microliter PBS 2% FBS toe en centrifugeer opnieuw bij 400 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius, zoals eerder getoond. Na het weggooien van het supernatant, resuspensie de pellet in 350 microliter PBS 2% FBS.Om de celaggregaten, of grote deeltjes, uit de enkele celsuspensies met een 70-micrometer voorscheidingsfilter te verwijderen, activeert u het filter met 100 microliter PBS 2% FBS. Haal de celsuspensie door het filter en verzamel deze in een schone buis. Was vervolgens het filter met 100 microliter PBS 2%FBS.Om magnetische scheiding van cellen uit te voeren met behulp van de negatieve scheidingsstrategie, plaatst u het monster in positie A van het gekoelde rek en twee lege buizen in posities B en C om de niet-gelabelde en gelabelde cellen te herstellen. Laad vervolgens de wasbuffer en loopbuffer in de bijbehorende flessen. Selecteer in de scheidingssectie het aantal monsters dat moet worden gescheiden en selecteer het afbraakprotocol.Druk op uitvoeren en start de scheiding. Herstel aan het einde van het programma de niet-gelabelde cellen. Bedek vervolgens een 12-putplaat met keldermembraanmatrix door 400 microliter 2,5% keldermembraanmatrix toe te voegen om het hele oppervlak van elke put te bedekken.Verwijder de overtollige oplossing en laat de plaat minstens een uur drogen in de laminaire stroomkap. Na vijf minuten centrifugeren en het weggooien van het supernatant, resuspensie de pellet in 500 microliter groeimedium. Zaai de adipocytenvoorlopercellen, of APC's, in een put van de 12-putplaat die eerder was bedekt met 2,5% keldermembraanmatrix.Incubeer bij 37 graden Celsius in een 5% kooldioxide-atmosfeer en verander het medium elke 48 uur totdat de cellen 80% samenvloeiing bereiken. Nadat u het medium volledig hebt verwijderd, wast u de cellen met 350 microliter PBS 2% FBS. Oogst de cellen met 350 microliter 0,05% tripsin EDTA gedurende twee minuten bij 37 graden Celsius en voeg twee milliliter groeimedium toe.Verzamel de cellen in een nieuwe conische buis van 50 milliliter en centrifugeer gedurende vijf minuten op 400 G. Passeer de APC's naar 12-putplaten, eerder bedekt met 2,5% keldermembraanmatrix, en incuber bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Verander het medium elke 48 uur totdat de cellen 80% samenvloeiing bereiken.Bij 80% samenvloeiing, zuig elk groeimedium af en vervang het door 500 microliter differentiatiemedium, met 3,3 nanomolair botmorfogenetisch eiwit in elk putje. Vervang na 48 uur het medium door 500 microliter per putdifferentiatiemedium en de differentiatiecocktail. Verwijder het medium 72 uur later en voeg 100 nanomolair insuline toe aan 500 microliter vers differentiatiemedium.48 uur later insulineresistentie induceren met vier nanogram per milliliter tumornecrosefactor alfa of TNF-alfa. Zuig elk differentiatiemedium af en vervang het door 500 microliter eenvoudig medium 2% FBS met TNF-alfa. Voeg na 24 uur incuberen vier nanogram per milliliter TNF-alfa toe in een eenvoudige middelgrote 0% FBS.Activeer de insulinesignaleringsroute 24 uur later door 100 nanomolaire insuline toe te voegen en gedurende 15 minuten te incuberen bij 37 graden Celsius in een 5% koolstofdioxide-atmosfeer, zoals eerder getoond. Verwijder na incubatie het medium en was met 500 microliter PBS, inclusief een controleput zonder de insulinebehandeling. Extract eiwit en meet de fosforylering van insuline-signalerende markers door Western blot.Subcutane adipocytenvoorlopercellen bij 80% samenvloeiing voorafgaand aan het induceren van differentiatie in de 12-well kweekplaten, en primaire adipocyten na zeven dagen van inducerende differentiatie worden in deze figuur weergegeven. De insulineresistentie geïnduceerd door TNF-alfa in subcutane primaire adipocyten werd aangetoond door verminderde insuline-geïnduceerde fosforylering van insulinereceptor, insulinereceptorsubstraat één en eiwitkinase B of AKT. Het membraan werd onderzocht met anti-gefosforyleerde insulinereceptor, anti-gefosforyleerde insulinereceptorsubstraat één, anti-gefosforyleerde AKT en anti-bèta-tubuline werd gebruikt als belastingscontrole.Het signaal werd gevisualiseerd met chemiluminescentiedetectie. De representatieve vlekken en de kwantificering van drie onafhankelijke experimenten worden hier getoond. Bij het proberen van deze procedure, een ding dat moet worden geregeld, is dat de inductie van insulineresistentie met TNF-alfa is met 2% FBS gedurende 24 uur en met 0% FBS gedurende de laatste 24 uur.

differentiated-mouse-adipocytes-primary-culture-model-insulin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates the differentiation of bone marrow stromal cells (BMSCs) into adipocytes. In the two-step process, in the presence of specific growth factors and hormones, undifferentiated BMSCs first differentiate into preadipocytes. The second step involving treatment with glucose and insulin leads to the formation of mature adipocytes with multiple lipid droplets.

In Vitro Mouse Bone Marrow Stromal Cell Differentiation into Adipocytes

Primaire witte preadipocyten geïsoleerd van wit vetweefsel in muizen kunnen worden onderscheiden in beige / brite cellen. Hier wordt gepresenteerd is een betrouwbare cellulaire modelsysteem om de moleculaire regulatie van "bruinen" van wit vet te bestuderen.

Isolatie en differentiatie van Stroma vasculaire cellen te Beige / Brite Cellen

Membraan volwassen adipocyte aggregaat cultuur (MAAC) is een nieuwe methode om de cultuur volwassen menselijke adipocyten. Hier beschrijven we hoe adipocyten te isoleren van menselijke veten en hoe maac op te zetten.

Isolatie en cultuur van menselijke volwassen adipocyten met behulp van membraan volwassen adipocyte aggregaat culturen (MAAC)

Hier wordt een protocol gepresenteerd om oligonucleotiden zoals klein-interfererend RNA (siRNA), micro-RNA-mimics (miRs) of anti-micro-RNA (anti-miR) af te leveren in volwassen adipocyten om eiwit- en micro-RNA-expressie te moduleren.

Een adipocytencelkweekmodel om de impact van eiwit- en micro-RNA-modulatie op de adipocytenfunctie te bestuderen

Dit rapport beschrijft een protocol voor de gelijktijdige isolatie van primaire bruine en witte preadipocyten van pasgeboren muizen. Geïsoleerde cellen kunnen in cultuur worden gekweekt en worden geïnduceerd om zich te onderscheiden in volgroeide witte en bruine adipocyten. De methode maakt genetische, moleculaire en functionele karakterisering van primaire vetcellen in cultuur mogelijk.

Isolatie en differentiatie van primaire witte en bruine preadipocyten van pasgeboren muizen

Preadipocyten worden geïsoleerd uit de stromale vasculaire fractie van interscapulier bruin vetweefsel van pasgeboren muizen en gedifferentieerd tot cellen die lipidedruppeltjes accumuleren, moleculaire markers tot expressie brengen en de mitochondriale morfologie van volwassen bruine vetcellen vertonen. Deze cellen worden verder geanalyseerd door middel van immunofluorescentie en transmissie-elektronenmicroscopie.

Differentiatie en beeldvorming van bruine vetcellen uit de stromale vasculaire fractie van interscapulier vetweefsel van pasgeboren muizen

Dit protocol beschrijft de semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit muizenvetweefsel om preadipocyten te verkrijgen en adipocytendifferentiatie in vitro te bereiken. Het gebruik van een weefseldissociator voor collagenasevertering vermindert experimentele variatie en verhoogt de reproduceerbaarheid.

Semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie uit muizenwit vetweefsel met behulp van een weefseldissociator

De grootte en kwetsbaarheid van rijpe vetcellen hebben de technieken en hulpmiddelen die beschikbaar zijn voor hun studie en isolatie beperkt. Hier wordt een protocol beschreven voor de isolatie van rijpe muizenadipocyten, dat gemakkelijk kan worden aangepast voor verschillende vetdepots en muizendiëten.

Isolatie en kweek van primaire adipocyten van muizen van magere en zwaarlijvige muizen

Deze procedure beschrijft een methode voor de isolatie en de cultuur van het muriene orgaan van Corti, met of zonder de spiraal limbus en spiraal ganglion neuronen. We tonen ook aan een methode voor de expressie van een exogeen reportergen in het orgaan van Corti explant door elektroporatie.

Primaire Cultuur en Plasmide Elektroporatie van de muizen orgaan van Corti.

Orthotope diermodellen van kanker van de eierstokken te repliceren beter mens-en vaatziekten en daardoor meer inzicht in de progressie van kanker en tumor respons op therapie. Een muis model krijgt een intrabursale injectie van luciferase-expressie ovarium tumorcellen. De behandeling wordt toegediend via orale sondevoeding. Tumorgroei wordt bewaakt...

In vivo beeldvorming en therapeutische behandelingen in een orthotope Muis Model van eierstokkanker

Leer hoe je gedifferentieerde muis adipocyten isoleert en kweekt om insulineresistentie te bestuderen. Deze methode gebruikt westerse blotanalyse om insulinesignaalering te evalueren in primaire cellen.

Gedifferentieerde muis adipocyten in primaire cultuur: een model van insulineresistentie

Meer video's verkennen