Synthese van stimuli-responsieve nanogels met behulp van waterige eenstaps crosslinking en co-nanopolymerisatie
24 januari 2025
Nanogels zijn een uitstekend en veelzijdig nanodeeltjesplatform voor de levering van biologische geneesmiddelen. Stimuli-responsieve poly(ethyleen) glycol-gebaseerde polymere nano-gels, die in staat zijn om op eiwitten gebaseerde ladingen in te kapselen, werden gesynthetiseerd met behulp van een eenstaps cross-linking co-nanopolymerisatiestrategie in waterige omstandigheden. De optimale fabricage en karakterisering van deze nieuwe nanodeeltjes worden hier gepresenteerd.
Ons protocol biedt een aanzienlijke vooruitgang in het synthetiseren van sub-100-nanometer eiwit-geladen nanogels in een enkele stap crosslinking en co-polymerisatietechniek onder milde, op water gebaseerde reactieomstandigheden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het vermogen om met eiwitten beladen nanogels te synthetiseren onder milde omstandigheden, waarbij agressieve organische oplosmiddelen en hoge temperaturen worden vermeden, waardoor de integriteit van de biologische lading behouden blijft. Begin met het wassen van het glaswerk met gefilterd gedeïoniseerd water.
Om het glaswerk te drogen, bevestigt u een veilig mondstuk aan de persluchtuitlaat aan de zijkant van de zuurkast. Houd de injectieflacon stevig vast, plaats het mondstuk erin en activeer de perslucht om een gecontroleerde stroom af te geven. Vul vervolgens een glazen injectieflacon van 10 milliliter met gedeïoniseerd water en sluit deze af met een rubberen septum.
Om het water van zuurstof te voorzien, vult u een ballon met stikstofgas en bevestigt u een naald aan de ballon. Plaats het op het septum en prik in het rubberen septum om de stikstof te laten stromen. Bevestig ook een uitgangsnaald aan de kolf om een consistente stikstofstroom te behouden.
Los vervolgens BSA of Cy7-gelabeld BSA op in zuurstofarm gedeïoniseerd water. Voeg deze oplossing vervolgens toe aan een schone glazen injectieflacon van 10 milliliter. Voeg AETC-oplossing toe aan de kolf en sluit deze af met een ander rubberen septum.
Los acrylamide en zuurstofarm gedeïoniseerd water op en voeg deze oplossing toe aan het mengsel van de injectieflacon. Los vervolgens de disulfide-kruislinker op in gedeïoniseerd water en voeg deze toe aan het mengsel in de injectieflacon. Spoel het mengsel gedurende 20 minuten met stikstofgas.
Los daarna SDS op in zuurstofarm gedeïoniseerd water. Gebruik een met stikstofgas gespoelde spuit om deze in het mengsel te brengen. Voeg vervolgens TEMED toe aan het reactiemengsel.
Laat het mengsel drie minuten zuurstofarm worden onder een continue stroom van stikstofgas. Los ammoniumpersulfaat op in één milliliter zuurstofarm gedeïoniseerd water en voeg het toe aan het reactiemengsel. Sluit de kolf vervolgens af onder een stikstofatmosfeer en roer het mengsel gedurende drie uur en 30 minuten op kamertemperatuur.
Om de reactie te beëindigen, verwijdert u de afdichting van de kolf. De reactie eindigt zodra het mengsel helder en kleurloos wordt. Om nanogels te zuiveren, voegt u het reactiemengsel toe aan een centrifugaalfiltereenheid van 15 milliliter.
Vul het apparaat met gedeïoniseerd water en centrifugeer om niet-reactieve chemicaliën of niet-ingekapselde lading te verwijderen. Voeg twee milliliter gedeïoniseerd water toe aan de centrifugaaleenheid om het nanogelmonster te verdunnen. Bewaar het uiteindelijke monster bij twee tot acht graden Celsius om afbraak van het ingekapselde eiwit te voorkomen.
Neem een cuvet of een wegwerp gevouwen capillaire cel voor analyse. Reinig het met gedeïoniseerd water van het filter, gevolgd door het blazen van perslucht om grote stofdeeltjes te verwijderen. Vul vervolgens de cuvet met 50 tot 100 microliter van het monster en verdun het met 750 tot 1.000 microliter gefilterd gedeïoniseerd water.
Om de cuvet in het DLS-instrument te plaatsen, opent u het deksel van het monstercompartiment en houdt u de cuvet bij de bovenranden vast om te voorkomen dat er vingerafdrukken op de optische vensters achterblijven. Plaats de cuvet goed uitgelijnd met het optische pad van het instrument. Sluit vervolgens het monstercompartiment om omgevingslicht te blokkeren.
Start de meting van de deeltjesgrootte met behulp van de relevante software op de DLS-machine. Selecteer na de meting de resultaten die relevant zijn voor de steekproef, waaronder het Z-gemiddelde, de gemiddelde PI, de telsnelheid per minuut, de zeta-potentiaal en de bijbehorende grafieken. Controleer of de correlatiefunctie een gladde sigmoïdale curve weergeeft die een indicatie geeft van een uniforme steekproef.
Zodra de analyse is voltooid, verwijdert u de cuvet voorzichtig uit het DLS-instrument. Er werd een geleidelijke afname waargenomen in de intensiteit van de piek geassocieerd met het BSA-eiwit, wat suggereert dat het eiwit is ingekapseld in de nanogelstructuur. De fysisch-chemische karakterisering van de Cy7-gelabelde BSA-geladen nanogels vertoonde een enkele gedefinieerde piek op 50 tot 100 nanometer.
Lege nanogels vertoonden echter inconsistente en grotere maten. Tot 86% van de ingekapselde Cy7-tagged BSA werd binnen 48 uur vrijgegeven. Aan de andere kant leidden controle-experimenten zonder toegevoegd glutathion slechts tot 15%eiwit dat vrijkwam.
Fouriertransformatie-infraroodanalyse toonde aan dat BSA geïsoleerd tijdens de nanogelsynthese en postglutathion-incubatie zijn structuur behield, aangegeven door de piek op 1.662 centimeter omgekeerd die intacte bèta-bochten vertegenwoordigt. BSA van nanogels die 30 dagen werden bewaard, vertoonde echter een piek van 1.613 centimeter omgekeerd, wat wijst op intermoleculaire bètabladstructuren en eiwitaggregatie. Circulair dichroïsme vertoonde ongewijzigde spectra zoals native BSA, wat wijst op een behouden alfa-spiraalvormige structuur.
Kleine afwijkingen in de kenmerkende pieken voor BSA die na 30 dagen werden geïsoleerd, suggereerden echter enige aggregatie. Het handhaven van een continue stikstofstroom is van cruciaal belang om te voorkomen dat zuurstof de polymerisatie van vrije radicalen remt. Bovendien moeten de initiërende systeemcomponenten snel worden toegevoegd voor een succesvolle synthese.
Na deze procedure kunnen de distributie, morfologie en kinetiek van de afgifte van de lading ter grootte van een nanogel verder worden gekarakteriseerd door middel van DLS-, TEM- en redoxresponsiviteitsbeoordeling via incubatie met het fysiologische reductiemiddel glutathion.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een nieuwe methode voor de synthese van eiwitgeladen nanogels met behulp van een eenstaps cross-linking- en co-polymerisatietechniek. Deze aanpak maakt de creatie van nanogels kleiner dan 100 nanometer mogelijk onder milde waterige omstandigheden, waardoor de integriteit van de biologische payload behouden blijft.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Nanodeeltjessynthese
- Aflevering van biologische geneesmiddelen
- Polymeermaterialen
Achtergrond
- Nanogels zijn veelzijdige platforms voor geneesmiddelentoediening.
- Traditionele methoden maken vaak gebruik van zware condities die biologische materialen kunnen beschadigen.
- Deze studie onderzoekt een nieuwe synthesemethode die deze problemen vermindert.
- Het gebruik van poly(ethyleenglycol) verbetert de eigenschappen van de nanogels.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het efficiënt creëren van eiwitgeladen nanogels.
- Om de voordelen van milde synthesiscondities aan te tonen.
- Om de resulterende nanodeeltjes te karakteriseren voor potentiële toepassingen.
Gebruikte methoden
- Eenstaps cross-linking co-polymerisatietechniek.
- Gebruik van gefilterd gedeïoniseerd water voor het wassen van glaswerk.
- Gecontroleerde droging van glaswerk met perslucht.
- Inkapseling van eiwitgebaseerde payloads in nanogels.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle synthese van eiwitgeladen nanogels kleiner dan 100 nanometer.
- Behoud van de integriteit van de biologische payload tijdens de synthese.
- Karakterisering van de nanodeeltjes bevestigde hun geschiktheid voor geneesmiddelentoediening.
- Aantoonde de efficiëntie van de één-staps synthesemethode.
Conclusies
- De nieuwe synthesemethode is effectief voor het creëren van nanogels.
- Milde condities zijn cruciaal voor het behoud van de integriteit van de payload.
- Deze benadering zou de aflevering van biologische geneesmiddelen in onderzoek en klinische toepassingen kunnen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directieleden
Stimuli-responsieve nanogels, gesynthetiseerd via waterige eenstaps-crosslinking, maken inkapseling en gecontroleerde afgifte van eiwittherapeutica onder milde omstandigheden mogelijk, waarmee de uitdagingen rondom de integriteit van de payload in vroege biofarmaceutische R&D direct worden aangepakt. Dit platform ondersteunt de voorspellende betrouwbaarheid van de biologische afgifte en vermindert de risico's van formulatiestrategieën op het snijvlak van discovery en preklinisch onderzoek. De compatibiliteit van de methode met gevoelige biomoleculen positioneert deze als een herbruikbare capaciteit voor translationeel onderzoek over de gehele portfolio.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt het mogelijk om de eiwitstabiliteit en releasekinetiek te onderzoeken onder fysiologisch relevante omstandigheden.
- Ondersteunt de functionele validatie van bezorgingsvoertuigen voor biologische payloads zonder risico op denaturatie.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door de eiwitstructuur tijdens inkapseling en release te behouden.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt gestandaardiseerde nanogelformuleringen voor reproduceerbare screening van encapsulatie-efficiëntie en afgifteprofielen.
- Levert kwantitatieve resultaten zoals grootte, polydispersiteit en encapsulatie-efficiëntie voor de optimalisatie van de assay.
- Maakt schaalbare preparatie van nanogels mogelijk voor verdere evaluatie van verbindingen en hergebruik van het platform.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelevante uitdagingen op het gebied van toediening door redox-responsieve, gecontroleerde afgifte in biomimetische omgevingen mogelijk te maken.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door de integriteit van de payload en de voorspelbaarheid van de afgifte te behouden.
- Vermindert het risico op falen in een laat stadium als gevolg van formulatie-instabiliteit of verlies van biologische activiteit.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode voor nanogel-synthese integreert alles van vroege ontdekking tot lead-identificatie en preklinische formulering, ter ondersteuning van hypothesetoetsing en optimalisatie van de afgifte van biologische geneesmiddelen.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetesten over eiwitinkapseling en -vrijgave onder fysiologische redoxomstandigheden.
- Screening: Biedt reproduceerbare, kwantitatieve DLS- en TEM-outputs voor nanogelkarakterisering en assay-gereedheid.
- Analytics: Maakt meting van inkapselingsefficiëntie, vrijgavekinetiek en de structurele integriteit van eiwitten na vrijgave mogelijk.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt in vitro vrijgaveprofielen met in vivo-relevante reducerende omgevingen voor biomarker-afgestemde aflevering.
- Enterprise Reuse: Biedt een gestandaardiseerd, mild syntheseplatform dat aanpasbaar is aan diverse eiwitladingen over verschillende programma's heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in de aflevering van biologische stoffen en vermindert mechanistische ambiguïteit in de formulering.
- Operationele waarde: Standaardiseert de synthese en karakterisering van nanogels voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Maakt gefundeerde go/no-go-beslissingen mogelijk door robuuste gegevens te verschaffen over de integriteit en afgifte van de payload.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van afleverplatforms en biologische kandidaten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in polymeerchemie, karakterisering van nanodeeltjes en eiwitanalyses.
- Toegang tot DLS, TEM en analytische assays voor de kwantificering van inkapseling en afgifte is noodzakelijk.
- Strikte standaardisatie van synthese- en meetprotocollen tussen teams is vereist.
- Aanpasbaar aan diverse eiwitladingen, maar optimalisatie kan nodig zijn voor verschillende molecuulgewichten of ladingen.
- Een continue stikstofstroom en snelle toevoeging van reagentia zijn cruciaal voor de reproduceerbaarheid en opbrengst.
