Fabricage en karakterisering van laag-voor-laag Janus Base Nano-Matrix om kraakbeenregeneratie te bevorderen
6 juli 2022
Dit protocol beschrijft de assemblage van een laag-voor-laag Janus base nano-matrix (JBNm) scaffold door janus base nanotubes (JBNts), matrilin-3 en Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1) sequentieel toe te voegen. De JBNm werd gefabriceerd en gekarakteriseerd; bovendien vertoonde het een uitstekende bioactiviteit, waardoor celfuncties zoals adhesie, proliferatie en differentiatie werden aangemoedigd.
Dit protocol laat zien hoe we de laag voor laag JBNm op moleculair niveau hebben geassembleerd en gekarakteriseerd. JBNm kapselt TGF-B1 in en voorkomt de afgifte ervan in het omliggende weefsel, waardoor gelokaliseerde chondrogenese wordt bevorderd. De vorming van de JBNm is gestandaardiseerd, waardoor verschillende JBNms kunnen worden gevormd voor toekomstige toepassingen.
De unieke laag voor laag structuur zorgt voor groeifactor inkapseling, waardoor een gestage gelokaliseerde afgifte ontstaat, die hypertrofie voorkomt en de groei ondersteunt. JBNm biedt een homeostatische micro-omgeving voor kraakbeenweefselregeneratie, binnen een beperkte locatie, vanwege de injecteerbaarheid, die kan worden gebruikt voor verschillende scenario's, zoals onregelmatig gevormde fracturen of holtes. Voeg om te beginnen acht microliter van één milligram per milliliter TGF-B1, gesuspendeerd in water toe aan 32 microliter van één milligram per milliliter Matrilin-3 gesuspendeerd in water.
Pipet om te zorgen voor een goede menging van deze eiwitten. Voeg 80 microliter van één milligram per milliliter toe. Janus Base Nanotubes, of JBNts gesuspendeerd in water, aan de TGF-B1, Matrilin-3 oplossing.
Pipetteer herhaaldelijk om een goede menging te garanderen. Voeg voor de JBNt-groep vijf microliter van één milligram per milliliter, JBNts toe aan 50 microliter water om een oplossing van 90,9 microgram per milliliter te maken. Voeg voor de Matrilin-3-groep 40 microliter van 10 microgram per milliliter Matrilin-3 toe aan 15 microliter water om een oplossing van 7,3 microgram per milliliter te maken.
Voeg voor de TGF-B1-groep 10 microliter van 10 microgram per milliliter, van TGF-B1 toe aan 45 microliter water, om een oplossing van 1,8 microgram per milliliter te maken. Voeg voor de Janus Base Nano-Matrix of JBNm-groep 40 microliter van 10 microgram per milliliter toe, Matrilin-3 tot 10 microliter van 10 microgram per milliliter TGF-B1. Roer om een goede menging te garanderen.
Voeg vervolgens vijf microliter van één milligram per milliliter JBNts toe aan de oplossing en pipetteer herhaaldelijk om het monster te mengen. Meet met behulp van een spectrofotometer het absorptiespectrum van elke groep. Label de TGF-B1 met behulp van een eiwitetiketteringskit, volgens de instructies van de fabrikant.
Voeg 20 microliter van 20 microgram per milliliter, gelabeld TGF-B1, toe aan 25 microliter water om een testoplossing van 8,9 microgram per milliliter te maken. Label de Matrilin-3 met behulp van een aparte labeling kit. Voeg 20 microliter van 80 microgram per milliliter met het label Matrilin-3 toe aan 25 microliter water om een testoplossing van 36 microgram per milliliter te maken.
Meng 20 microliter van 80 microgram per milliliter gelabeld Matrilin-3 met 20 microliter van 20 microgram per milliliter gelabeld TGF-B1, en vijf microliter water, wat resulteert in een gelabelde TGF-B1, Matrilin-3-verbinding. Pipetteer het mengsel meerdere keren om te mengen. Voeg vijf microliter van één milligram per milliliter JBNts toe aan 40 microliter water, wat resulteert in een oplossing van 111 microgram per milliliter.
Voeg vervolgens vijf microliter van één milligram per milliliter JBNts toe aan de gelabelde TGF-B1, Matrilin-3-oplossing en pipet herhaaldelijk om de verbinding te mengen. Breng elke monstergroep over naar de put van een zwarte 384 putplaat. Laad de plaat in een multi-mode microplaatlezer en voer metingen uit op excitatiegolflengten van 488 en 555 nanometer volgens de protocollen van de fabrikant.
Onder fysiologische omstandigheden was het zetapotentiaalspectrum van Matrilin-3 negatief geladen vanwege het iso-elektrische punt. Na de toevoeging van de TGF-B1 aan de Matrilin-3, steeg het zetapotentieel van de TGF-B1 Matrilin-3-verbinding tot een bijna neutrale waarde. Het zetapotentieel van JBNm was het hoogst van de drie groepen.
De UV-zichtbare absorptiespectra bevestigden de vorming van de hiërarchische laag voor laag inwendige structuur van de JBNm, de aromatische ringen van de lysine-zijketens en de JBNts droegen bij aan de absorptiepieken, respectievelijk 220 en 280 nanometer. TEM werd gebruikt om de morfologie van de JBNts en JBNm te karakteriseren. Na combinatie met eiwitten werden dikke bundels JBNm waargenomen die een steigerstructuur vormden.
Fluorescentiemicroscopie bevestigde de aanwezigheid van de laag door laagstructuur en toonde de doorsnede van de JBNm aan. Na het labelen van de rode fluorescerende Matrilin-3 omhulde de JBNt-bundels en vormde de buitenste laag van de JBNm, terwijl de groene fluorescerende TGF-B1 een binnenste laag vormde. De fluorescentieresonantie-energieoverdracht vertoonde emissiepieken op 520 nanometer voor gelabelde TGF-B1-groepen en 570 nanometer voor Matrilin-3-groepen.
Het effect van JBNm op de adhesie en celproliferatie van HMSC werd onderzocht. De JBNm toonde HMSC's samen met zichzelf geclusterd, terwijl minder cellen zich aan JBNts hechtten. De uitlijning van cellen en de grootte van de cellen op het JBNm toonden aan dat JBNts een rol speelden bij celadhesie, terwijl de eiwitten de affiniteit van celadhesie verhoogden.
Na dag één van de celkweek vertoonden JBNm- en TGF-B1-groepen een significante celproliferatie in vergelijking met de andere groepen. Toen de duur van de celstructuur werd verhoogd tot drie en vijf dagen, vertoonden de JBNm- en TGF-B1-groepen nog meer verhoogde celproliferatie. Bij het fluorescerend labelen van de JBNm is het belangrijk dat de TGF-B1 en Matrilin-3 individueel worden gelabeld en gemengd voordat de JBNts worden toegevoegd, om een goede vorming van de laag door laagstructuur mogelijk te maken.
Verdere beoordeling van de steiger kan inzicht geven in hoe ze effectief zijn in therapeutische behandelingen. Meer specifiek kan een high throughput proliferatietest de optimale dosering in vitro en later in vivo bepalen. Deze nieuwe NanoMatriX-creatie stelt onderzoekers in staat om een op nanomateriaal gebaseerde injecteerbare steiger te gebruiken om kraakbeen te regenereren.
Deze poly-nabootsingsbenadering zorgt voor verbeterde androgenese en het tegengaan van siteproliferatie.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol demonstreert de assemblage en karakterisering van een laag-voor-laag Janus base nano-matrix (JBNm) scaffold. De JBNm inkapselt TGF-β1, wat lokale chondrogenese bevordert en een homeostatische micro-omgeving biedt voor de regeneratie van kraakbeenweefsel.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Biomaterialen
- Tissue Engineering
- Regeneratieve Geneeskunde
Achtergrond
- Janus base nanotubes (JBNts) worden gebruikt bij de assemblage van het scaffold.
- TGF-β1 is essentieel voor het bevorderen van cel functies.
- De JBNm-structuur maakt een gecontroleerde afgifte van groeifactoren mogelijk.
- De injecteerbaarheid van JBNm maakt toepassing in onregelmatig gevormde defecten mogelijk.
Doel van de studie
- Om een steiger te creëren die de regeneratie van kraakbeenweefsel ondersteunt.
- Om de vorming van JBNm te standaardiseren voor diverse toepassingen.
- Om groeifactoren in te kapselen voor een vertraagde afgifte en om hypertrofie te voorkomen.
Gebruikte methoden
- Sequentiële toevoeging van TGF-β1 en Matrilin-3 om JBNm te vormen.
- Karakterisering van het steigerwerk op moleculair niveau.
- Beoordeling van de bioactiviteit met betrekking tot celadhesie en proliferatie.
- Evaluatie van de injecteerbaarheid van het steigerwerk voor praktische toepassingen.
Belangrijkste resultaten
- De JBNm vertoonde een uitstekende bioactiviteit, wat de celfuncties bevorderde.
- Lokale afgifte van TGF-β1 werd gerealiseerd, waardoor de chondrogenese werd verbeterd.
- Het scaffold handhaafde een homeostatische omgeving voor weefselregeneratie.
- Gestandaardiseerde vorming maakt veelzijdige toepassingen in tissue engineering mogelijk.
Conclusies
- Het laag-voor-laag JBNm-steunstructuur is effectief voor kraakbeenregeneratie.
- Inkapseling van groeifactoren is gunstig voor gelokaliseerd weefselherstel.
- Deze methode kan worden aangepast voor diverse klinische scenario's.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
De laag-voor-laag Janus base nano-matrix (JBNm) maakt nauwkeurige lokalisatie van groeifactoren en aanhoudende controle over de micro-omgeving mogelijk, waarmee een cruciale uitdaging in de regeneratieve geneeskunde en tissue engineering wordt aangepakt. Dit platform ondersteunt voorspellende betrouwbaarheid bij de screening van biomaterialen in een vroeg stadium en vermindert de risico's bij translationele vooruitgang door off-target effecten en hypertrofie te minimaliseren. De gestandaardiseerde assemblage en injecteerbaarheid maken het tot een herbruikbare methode voor diverse preklinische modellen voor kraakbeenherstel.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar groeifactor-gemedieerde chondrogenese in gecontroleerde micro-omgevingen mogelijk.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door de effecten van TGF-β1 binnen beperkte scaffolds te isoleren.
- Faciliteert functionele validatie van biomateriaal-eiwitinteracties voor weefselregeneratie.
Screening & assay-ontwikkeling
- Biedt een gestandaardiseerd, reproduceerbaar raamwerk voor kwantitatieve celadhesie- en proliferatie-assays.
- Maakt high-throughput beoordeling van de samenstelling van het raamwerk en de inkapseling van groeifactoren mogelijk.
- Levert consistente, kwantificeerbare resultaten voor de vergelijkende evaluatie van biomateriaal-kandidaten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelevante modellen door gelokaliseerde kraakbeenvorming in vitro en in vivo te ondersteunen.
- Handhaaft translationele continuïteit via injecteerbare, aanpasbare scaffold-formaten voor onregelmatige defecten.
- Vermindert het risico op hypertrofie en off-target effecten, wat risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling ondersteunt.
Integratie van Pipeline & Workflow
Het JBNm-platform integreert processen van vroege ontdekking tot preklinische validatie, waardoor hypothesetesten, assay-ontwikkeling en translationeel onderzoek in workflows voor kraakbeenherstel mogelijk worden gemaakt.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothese-gestuurde evaluatie van de effecten van groeifactoren in ontworpen micro-omgevingen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor celadhesie en proliferatie.
- Analytica: Maakt UV-Vis, fluorescentie- en zeta-potentiaalmetingen mogelijk voor scaffoldkarakterisering.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert continuïteit van in vitro screening naar in vivo modellen voor kraakbeenregeneratie.
- Zakelijke herbruikbaarheid: Gestandaardiseerde assemblage maakt aanpassing mogelijk binnen diverse programma's voor biomaterialen en weefselengineering.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in scaffold-gemedieerde weefselregeneratie en doelvalidatie.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, schaalbare protocollen voor reproduceerbare scaffold-fabricage en analyse.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go-beslissingen mogelijk door off-target effecten van groeifactoren te minimaliseren.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogecorrigeerde prioritering van biomateriaal-kandidaten voor regeneratieve geneeskunde-pipelines.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de assemblage van biomaterialen, eiwitlabeling en technieken voor scaffoldkarakterisering.
- Toegang tot infrastructuur voor spectrofotometrie, fluorescentiemicroscopie en TEM is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor reproduceerbare scaffoldbereiding en -analyse.
- Aanpasbaar aan diverse modelsystemen, maar optimalisatie voor specifieke weefseldoelen kan nodig zijn.
- Praktische beperkingen omvatten de precieze controle van componentverhoudingen en de labeling-efficiëntie.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:56
Fabrication of the Janus Base Nano-Matrix (JBNm), Composed of Janus Base Nanotube (JBNt)/Matn1/Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1)
1:41
Observation of Specimens with Ultraviolet-Visible (UV-Vis) Spectroscopy
3:12
Absorption Spectra Measurement of Fluorescent-Labeled Proteins
5:08
Results: Layer-By-Layer Assembly of Janus Base Nano-Matrix Structure Scaffold for a Cartilage Tissue Construct
8:01
Conclusion
