Whole-Kidney Driedimensionale Kleuring met CUBIC
18 juli 2022
Het huidige protocol beschrijft een weefselzuiveringsmethode en immunofluorescente kleuring met volledige mount voor driedimensionale (3D) nierbeeldvorming. Deze techniek kan macroscopische perspectieven bieden in de nierpathologie, wat leidt tot nieuwe biologische ontdekkingen.
Dit protocol maakt een visualisatie van driedimensionale structuren in volledige nier mogelijk, wat kan leiden tot innovatieve ontdekkingen in nieronderzoek door een macroscopisch perspectief te bieden. Orgaankleuring met hele montage is een uitdaging vanwege de moeilijkheid bij de penetratie van antilichamen. Dit protocol heeft de hoogwaardige, hele kleuring van de nieren door de antilichamen aangetoond.
Voer om te beginnen de onderdompelingsfixatie uit onmiddellijk na de perfusiefixatie en nierbemonstering, door de nier gedurende 16 uur onder te dompelen in 4% paraformaldehyde bij vier graden Celsius. Geef drie wasbeurten met PBS gedurende elk twee uur. Voer het ontkleurings- en delipidatieproces uit door de vaste nier onder te dompelen in zeven millimeter van 50% CUBIC-L in een buis met ronde bodem van 14 milliliter, met zacht schudden bij kamertemperatuur.
Dompel na zes uur de nier onder in zeven milliliter CUBIC-L in een buis met ronde bodem van 14 millimeter, met zacht schudden bij 37 graden Celsius gedurende vijf dagen. Ververs CUBIC-L elke dag. Zodra de ontkleuring en delipidatie zijn voltooid, gebruikt u een doseerlepel voor monsterbehandeling en wast u de nier driemaal met PBS op kamertemperatuur gedurende twee uur.
Immunostain de gedelipideerde nier in primaire antilichamen verdund in kleuring buffer oplossing, met zacht schudden in een incubator shaker bij 37 graden Celsius gedurende zeven dagen. Was vervolgens de nier met 0,5% Triton X-100 in PBS, ook bekend als PBST, bij kamertemperatuur gedurende één dag. Voor secundaire antilichamenkleuring, behandel de nier met secundaire antilichamen in de kleuringsbuffer, in het donker, met zacht schudden bij 37 graden Celsius gedurende zeven dagen.
Bevestig de vlek met een PBST-wasbeurt op kamertemperatuur gedurende één dag. Dompel de nier na fixatie drie uur onder in 1% formaldehyde in PB en was deze zes uur lang met PBS op kamertemperatuur. Voer de refractieve indexmatching uit door de nier gedurende één dag onder te dompelen in zeven milliliter van 50% CUBIC-R + in een 14 milliliter buis met ronde bodem met schudden, gevolgd door behandeling met zeven milliliter CUBIC-R + met schudden bij kamertemperatuur gedurende twee dagen.
Met behulp van de immuunkleuringsmethode werden sympathische zenuwen en slagaders in een hele nier gevisualiseerd in 3D-nierbeeldvorming. Bovendien werden abnormale renale sympathische zenuwen gevisualiseerd na ischemie-reperfusieletsel. Dit protocol vergemakkelijkte ook het visualiseren van sympathische zenuwen in de hele milt.
Het gegevenskwantificeringsproces voor de driedimensionale immunofluorescente kleuring wordt hier weergegeven. Bovendien werden verzamelkanalen, het S1-segment van proximale tubuli en de glomeruli met succes gevisualiseerd in een hele nier. De onderdrukte glomerulomegalie, als gevolg van toediening van geneesmiddelen in de vroege stadia van diabetische nierziekte, werd ook gevisualiseerd in 3D-beeldvorming.
Dit protocol kan het specifieke molecuul in een hele nier labelen. Zo kunnen onderzoekers structuurverandering in de vasculatuur analyseren of zeldzame gebeurtenissen in nierweefsels vinden.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol maakt de visualisatie van driedimensionale structuren in de volledige nier mogelijk, wat een macroscopisch perspectief biedt dat kan leiden tot innovatieve ontdekkingen in nieronderzoek. De methode omvat weefselklaring en whole-mount immunofluorescentiekleuring voor een verbeterde beeldkwaliteit.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Pathologie
Achtergrond
- Whole-mount kleuring van organen is uitdagend vanwege problemen met de penetratie van antilichamen.
- Kleuring van hoge kwaliteit is cruciaal voor nauwkeurige 3D-beeldvorming.
- Dit protocol pakt veelvoorkomende problemen bij beeldvorming van de nier aan.
- Macroscopische perspectieven kunnen leiden tot nieuwe biologische inzichten.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor 3D-beeldvorming van de nier.
- Om de visualisatie van nierstructuren te verbeteren.
- Om innovatieve ontdekkingen in de nierpathologie te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Fixatie door immersie in 4% paraformaldehyde bij 4°C gedurende 16 uur.
- Wassen met PBS, drie keer gedurende elk twee uur.
- Ontkleuring en ontvetting met behulp van 50% CUBIC-L.
- Zacht schudden bij kamertemperatuur tijdens het ontvettingsproces.
Belangrijkste resultaten
- Hoge kwaliteit whole-mount kleuring van nieren aangetoond.
- Verbeterde antibody-penetratie bereikt.
- Duidelijke 3D-visualisatie van nierstructuren geleverd.
- Macroscopische perspectieven mogelijk gemaakt voor een beter begrip van nierpathologie.
Conclusies
- Het protocol verbetert de beeldvormingstechnieken van de nieren met succes.
- Het opent nieuwe wegen voor ontdekkingen in het nieronderzoek.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methode voor verdere inzichten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Driedimensionale kleuring van de gehele nier met CUBIC maakt een volledige visualisatie van renale microstructuren mogelijk, waardoor de beperkingen van de conventionele pathologie worden overwonnen. Deze mogelijkheid ondersteunt het brengen van resolutiekaarten van bloedvaten, tubuli, glomeruli en sympathische zenuwen, wat cruciale inzichten verschaft voor vroege ontdekking en mechanistische risicoreductie in onderzoek naar nierziekten. De methode verhoogt het voorspellende vertrouwen op belangrijke kantelpunten bij de verdere ontwikkeling van preklinische portfolio's.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek van de renale architectuur en cellulaire netwerken mogelijk met een resolutie op enkelcelniveau.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door het visualiseren van structurele veranderingen na letsel of interventie.
- Faciliteert functionele targetvalidatie via uitgebreide mapping van sympathische zenuwen en glomeruli.
- Verbetert het voorspellend vertrouwen bij het prioriteren van targets voor nierziekten.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde 3D biologische systemen voor op downstream imaging- en kwantificeringsworkflows.
- Standaardiseert staining van hele organen voor reproduceerbare, kwantitatieve resultaten over verschillende studies heen.
- Maakt schaalbare imaging van zeldzame gebeurtenissen en structurele veranderingen in nierweefsel mogelijk.
- Ondersteunt een betrouwbare evaluatie van de effecten van verbindingen op de renale microanatomie.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Lijnt 3D-beeldgevingsresultaten uit met ziekterelevante biomarkers, zoals glomerulomegalie.
- Biedt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door het visualiseren van interventie-effecten.
- Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere voortgang mogelijk op basis van uitgebreide weefselanalyse.
- Levert voorspellende risicoreductie voor translationele nieronderzoeksprogramma's.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol voor 3D-kleuring van de gehele nier is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek en ondersteunt hypothesetoetsing, targetvalidatie en de afstemming van translationele biomarkers in het nieronderzoek.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetoetsing en het verduidelijken van pathways door het in kaart brengen van renale structuren en letselresponsen.
- Screening: Levert assay-klare, reproduceerbare 3D-beeldvormingsresultaten voor kwantitatieve vergelijking van experimentele condities.
- Analytics: Maakt meting en kwantificering van structurele veranderingen mogelijk, wat robuuste statistische analyse ondersteunt.
- Translationeel onderzoek: Verbindt bevindingen uit beeldvorming met ziektemodellen en vroege identificatie van biomarkers.
- Enterprise hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor whole-organ imaging voor onderzoek naar renale en aanverwante weefsels.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van renale targets.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, schaalbare en reproduceerbare 3D-beeldvormingsworkflows.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door uitgebreide weefselanalyse mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang van programma's voor nierziekten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in weefselklaring, immunokleuring en 3D-beeldanalyse.
- Toegang tot geavanceerde beeldvormingsinstrumentatie en computationele analyse-instrumenten is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid van gegevens.
- Aanpassing voor verschillende orgaansystemen of antilichaampanels kan noodzakelijk zijn.
- De penetratie van antilichamen en de duur van de kleuring zijn praktische beperkingen voor beeldvorming van volledige organen.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:37
Kidney Fixation, Decolorization, and De-Lipidation
1:45
Whole-Mount Immunofluorescent Staining and Refractive Index (RI) Matching
3:03
Results: Whole-Mount Immunofluorescent Staining for Three-Dimensional (3D) Kidney Imaging
4:00
Conclusion
