Generatie van multicue cellulaire micro-omgevingen door UV-fotopatterning van driedimensionale celcultuursubstraten

De invloed van micro-omgevingsfactoren op celgedrag wordt vaak bestudeerd met behulp van overgesimplificeerde in vitro platforms, die enkele signalen isoleren. Onze aanpak creëert celkweeksubstraten die meerdere van deze signalen combineren. Deze aanpak is zeer veelzijdig en maakt een systematische studie mogelijk met behulp van een breed scala aan celkweekmaterialen, contactgeleidingspatronen, cellulaire uitlezingen en eiwitten.

De procedure wordt gedemonstreerd door twee PSE-kandidaten uit ons lab. CAS VAN DER PUTTEN en MIRKO D'URSO First maken een negatieve glazen mal met behulp van een femtoseconde laser direct right techniek die alle interessante eigenschappen bevat. Plaats vervolgens voorzichtig de negatieve glasvorm op de bodem van een petrischaal en giet het polydimethylsiloxaan prepolymeer bovenop de negatieve glasvorm om het volledig te bedekken.

Plaats deze petrischaal in de vacuüm exsiccator en start de vacuümpomp. Zodra een vacuüm is bereikt, wacht u 5 minuten om alle bellen te verwijderen die aanwezig zijn op het grensvlak tussen het matrijsoppervlak en het polydimethylsiloxaanprepolymeer. Hard het PDMS prepolymeer een nacht uit in de oven op 65 graden Celsius.

Gebruik na het uitharden een spatel om de randen van het PDMS op te tillen. Verwijder de nieuw uitgeharde positieve PDMS-chip uit de negatieve glasvorm en als de positieve PDMS-chip de neiging heeft om aan de negatieve glasvorm te kleven, voeg dan ethanol of water toe aan de randen van de afdruk tijdens het tillen. Plaats vervolgens de positieve polydimethylsiloxaanchip in een exsiccator naast een kleine injectieflacon met een druppel silanisatiemiddel en laat de chip een nacht onder vacuüm.

Giet PDMS pre-polymeer in de negatieve PDMS-mal om meerdere celkweekchips van 5 millimeter dikte te produceren. Verwijder vervolgens de bubbels met behulp van de exsiccator en laat drie uur uitharden bij 65 graden Celsius. Gebruik een scheermesje om de chip tot de uiteindelijke grootte te snijden en bewaar de chips op kamertemperatuur Voor substraatpassivering met een pincet, plaats de chip in de mand van de plasma-Asher.

Gebruik vervolgens zuurstofplasma om de hydroxylgroepen op het oppervlak van de chip te activeren en de askamer te ontluchten met behulp van stikstof. Haal de chip uit de mand en plaats deze in een kleine Polydimethylsiloxaan container. Gebruik nu een pasteurpipet om 500 microliter Poly-L-lysine aan de bovenkant van de chip toe te voegen, om het oppervlak volledig in de oplossing onder te dompelen en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur te incuberen.

Verwijder vervolgens 450 microliter poly-L-lysine uit de celkweekchip met een pipet. Spoel vervolgens het chipoppervlak trice met 500 microliter 0,1 molaire HEPES-buffer. Behoud de uiteindelijke patroonkwaliteit door een klein volume vloeistof op de Polydimethylsiloxaanchip achter te laten, om uitdroging van het monster te voorkomen.

Bereid vlak voor gebruik 500 microliter 50 milligram per milliliter methoxyethyleenglycole glycosische cyanamidale valeraatoplossing in 0,1 molaire hopen buffer per celkweekchip en incubeer het monster erin gedurende 60 minuten. Verwijder met behulp van een micropipet 450 microliter van de methoxypolyethyleenglycolcyanamidale valeraatoplossing. Was het chipoppervlak vijf keer met PBS door in en uit te pipetteren.

Alle niet-afhankelijke mPEG-SVA verwijderen. Plaats de glasplaat met een fluorescerende markeerstift in het optische pad van de microscoop. Schakel over naar de fluorescerende modus op de microscoop en stel het primo-beeld zorgvuldig scherp, zodat zowel het logo als de tekst scherp zijn.

Klik op Volgende om de kalibratiegegevens en het patroon te bekijken om de kalibratieprocedure te voltooien. Noteer de Z-locatie van het werkgebied bij het kalibreren en gebruik deze locatie als referentie verderop in het protocol. Nadat u de kalibratieschuif uit het werkgebied hebt verwijderd, plaatst u een glazen dia met een druppel van de foto-initiator op het podium en plaatst u het PDMS-celcultuursubstraat ondersteboven in de druppel van de foto-initiator.

Zorg ervoor dat de 3D-functies op het oppervlak van het celcultuursubstraat naar de glasschuif zijn gericht en volledig zijn ondergedompeld in de foto-initiator, om een goed patroon te garanderen. Focus op respectievelijk de boven- of onderkant van bolle of concave structuren en focus op het gebied van de chip op de juiste locatie zoals beschreven in het manuscript. Pas de patrooninstellingen aan volgens de functie en selecteer een dosis van 1000 millijullen per milliliter.

Klik op de afspeelknop rechtsonder in het scherm om het patroon te starten. Als u klaar bent, ziet u het patroon dat in het groen wordt weergegeven. Voeg met behulp van een micropipet twee milliliter PBS toe aan een injectieflacon van 20 microgram rhodamine met het label fibronectine, om een concentratie van 10 microgram per milliliter te verkrijgen.

Pipetteer voorzichtig om de eiwitklonters te vermijden en te beschermen tegen licht. Voeg met behulp van een micropipet 200 tot 500 microliter eiwitoplossing toe aan de celkweekchip. Pas de incubatietijd en temperatuur aan, afhankelijk van het eiwit van keuze, en zorg ervoor dat u het monster bedekt.

Verwijder de eiwitoplossing en was de chip vijf keer met 500 microliter steriel PBS. Zorg ervoor dat u de PBS meerdere keren op en neer pipetteert, vooral met alle relevante kenmerken van de celkweekchip, om elk ongebonden eiwit te verwijderen. Zodra de celsuspensie is voorbereid, verwijdert u PBS en voegt u 1 milliliter van de celsuspensie toe aan de chip.

Incubeer het vervolgens gedurende 60 minuten bij 37 graden Celsius. Controleer de hechting van de cellen op de patrooncelkweekchip onder een heldere veldmicroscoop. Zoek naar langwerpige celmorfologieën in het geval van lijnpatronen.

En als cellen buiten het patroongebied zijn gaan hechten, verwijder deze dan door het medium direct boven de cellen op het substraat op en neer te pipetteren. Plaats na het beitsen het gekleurde monster ondersteboven in een druppel PBS op een glazen glijbaan. Maak vervolgens, afhankelijk van het vereiste detailniveau, Z-stapels met een geschikt objectief en Z-afstand om de juiste beeldacquisitie te garanderen.

Maak een 3D-render van Z-stack met 3D-renderingsoftware. Een concave put werd gemodelleerd met behulp van door licht geïnduceerde moleculaire absorptie van eiwitten en de maximale intensiteitsprojectie en orthogonale weergave werden gevisualiseerd. Het intensiteitsprofiel toonde scherpe overgangen met een hoge patroonresolutie tussen gebieden met patronen en gebieden zonder patronen en een consistente eiwitintensiteit.

De patronen met behulp van het enkele brandpuntsvlak en de methode met twee en drie brandpuntsvlakken toonden een perfecte uitlijning van de patronen bovenop de kenmerken. De concave semi-cilinders, bolle semi-cilinders, zadeloppervlak en PID werden gedessineerd met behulp van lijnen of concentrische cirkels van verschillende breedtes. Het effect in het skelet van de menselijke keratocyten wordt gekleurd met behulp van foliden en gevisualiseerd.

De dermale fibroblasten werden gekweekt op een concave halve cilinder met patroon en gevisualiseerd. De cellen voelden en hechtten zich aan het multi cue celcultuursubstraat en bleven levensvatbaar in de loop van de tijd zoals gevisualiseerd door F-actine, Vinculin en Nuclei. Ook vormden de cellen focale verklevingen voornamelijk op de fibronectinelijnen.

De menselijke dermale fibroblasten gekweekt op een patroon concave cilinder in de aanwezigheid van rhodamine fibronectine hechtten zich aan het multi cue substraat en vertoonden een uitlijningsrespons, volgens het contactgeleidingspatroon. De uitlijningsrespons en de levensvatbaarheid van de cellen blijven gedurende de gehele kweekduur behouden. Het belangrijkste bij het uitvoeren van dit protocol is om te voorkomen dat het oppervlak van de celkweekchip uitdroogt.

Het gebruik van verschillende substraatmaterialen, eiwitcoatings en celtypen kan extra optimalisatie vereisen. Het verstrekken van meerdere omgevingssignalen in 3D kan nieuwe mogelijkheden openen om cellulaire organisatie in complexe ingenieursweefsels te sturen.