Een gids voor het onderzoeken van intramusculaire vetvorming en de cellulaire oorsprong ervan in skeletspieren

Een belangrijke barrière bij het bestuderen van intramusculair vet, een kenmerk van sarcopenie en neuromusculaire ziekten, is effectieve conservering en daaropvolgende visualisatie van adipocyten, vooral in bevroren weefselsecties. Het protocol behoudt adipocytenmorfologie en skeletspiersecties uitgelijnd voor robuuste, rigoureuze en reproduceerbare visualisatie en kwantificering van intramusculair vet. Onze analysepijplijn biedt een kader om nieuwe interventies te valideren om vetvorming bij ziekten zoals Duchenne spierdystrofie te voorkomen De procedure wordt aangetoond door Connor Johnson, een onderzoekstechnicus uit mijn laboratorium.

Reinig om te beginnen het been dat moet worden geïnjecteerd met een vers alcoholdoekje om te desinfecteren. Zuig 30 tot 50 microliter 50%glycerol op in de insulinespuit. Borstel voorzichtig het haar op het scheenbeen om de locatie van de TA bloot te leggen. Nadat u de TA hebt gelokaliseerd, steekt u de naald distaal in de TA in de buurt van de enkel.

Steek de naald volledig in de spier en injecteer langzaam glycerol, terwijl de naald geleidelijk wordt teruggetrokken, wat helpt om het grootste deel van de spier te verwonden. Besproei royaal alle delen van de muis die moeten worden gesneden met 70% ethanol om haar van het ontledende gebied en instrumenten te houden. Gebruik een schaar om de huid rond de bovenkant van het been bij het bekken te knippen.

Trek de huid van het been voorzichtig van de bovenkant naar beneden naar de enkel. Verwijder eerst de buitenste bindweefsellaag met een scherp pincet voordat u de TA oogst. Schuif het pincet onder de TA vanaf de onderkant van de spier, beginnend bij de distale pees en trek voorzichtig omhoog richting de knie. Stop aan het einde van de spier.

Duw niet voorbij de weerstand die bij de onderknie wordt gevoeld. Als er een significante weerstand is voordat u de onderste knie bereikt, stop dan en ga door met het verwijderen van overgebleven lagen bindweefsel. Zodra de TA gedeeltelijk van het been is opgetild met het pincet, gebruikt u dezelfde beweging met een scalpel om de verbinding van de TA met de onderste knie te verbreken.

Guts de pees bij de enkel met een schaar om de TA volledig te verwijderen. Behandel alleen de spier bij de pees om beschadiging van de vezels te voorkomen. Snijd een derde van de TA aan het einde, tegenover de pees. Doe het in de microcentrifugebuis en vries het in door het in vloeibare stikstof te laten vallen.

Dompel de andere twee derde van het weefsel onder in een gelabelde put met 4% PFA voor histologie. Zorg ervoor dat u bijhoudt wanneer het eerste en laatste weefsel in fixatief is geplaatst. Leg op een nutator gedurende twee tot tweeënhalf uur bij vier graden Celsius.

Verwijder na fixatie PFA uit de putjes. Spoel de tissues twee tot drie keer af met koude X PBS en was vervolgens twee tot drie keer met koud 1X PBS gedurende vijf minuten per wasbeurt. Verwijder de PBS uit de putjes en voeg voldoende 30% sucrose toe in 1X PBS om het weefsel te laten zweven.

Plaats de notenmaker op vier graden Celsius 's nachts. Schakel de microscoop in en start de beeldbewerkingssoftware. Zet de dia op het podium vast.

Gebruik een willekeurig kanaal om het gebied te identificeren dat moet worden afgebeeld. Pas in de beeldvormingssoftware de versterking en belichtingstijd voor elk kanaal aan. Maak afbeeldingen van het hele weefsel in elk kanaal en voeg afzonderlijke tegels samen tot een samenstelling van de volledige TA-doorsnede.

Voordat u begint, verwarm rnase vrij water voor op 45 graden Celsius en bereid verse 70% ethanol. Voeg 1000 microliter guanidiniumthiocyanaat toe aan elke buis die het monster bevat. Het is belangrijk dat er bead beater goedgekeurde buizen worden gebruikt.

Voeg drie middelgrote kralen, of een grote en een kleine kraal, toe aan elke buis. Homogeniseer het weefsel op 50 Hertz gedurende twee tot vier minuten met behulp van een Bead Beater. Afhankelijk van het weefseltype en de monstergrootte kan het tot 10 minuten duren.

voeg 200 microliter chloroform toe. Schud de monsters gedurende 15 seconden. Incubeer gedurende twee tot drie minuten bij kamertemperatuur.

Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 12.000 keer G.Pipetteer 350 microliter van het heldere supernatant en voeg toe aan een nieuwe microcentrifugebuis met 350 microliter 70% ethanol. Pas op dat u de onderste eiwit- en/of DNA-lagen niet aanzuigt. Breng tot 700 microliter van dit mengsel over naar een mini-spinkolom in een verzamelbuis van twee milliliter.

Ga verder met RNA-isolatie volgens de instructies van de fabrikant. Elute met 30 tot 50 microliter RNase-vrij water, afhankelijk van de verwachte opbrengst. Houd RNA op ijs en meet de opbrengst met behulp van een spectrofotometer.

Bewaar het RNA op min 80 graden Celsius. Gebruik maximaal één microgram RNA om cDNA te synthetiseren met een cDNA-synthesekit, volgens de instructies van de fabrikant. Nadat de run is voltooid, voegt u 80 microliter RNase-vrij water toe.

Bewaar de monsters bij min 20 graden Celsius. Gebruik een 384-putformaat en voeg een microliter primer toe aan de onderkant van elke put. Vrij drogende primers resulteren in strakkere technische replica's.

Laat afgedekt totdat de primers volledig zijn verdampt. Stel steekproefreacties in met vier tot acht technische replicaties. Nadat de PCR-run is voltooid, normaliseert u de drempelwaarden van de ruwe cyclus naar huishoudelijke genniveaus en bepaalt u vouwveranderingen door delta-delta Ct.Perilipin en positieve adipocyten van de niet-gefixeerde TA's hebben de morfologie aanzienlijk veranderd in vergelijking met vaste secties, waardoor hun identificatie, visualisatie en een daaropvolgende kwantificering veel moeilijker en mogelijk onnauwkeuriger zijn.

PFA-fixatie daarentegen behoudt de morfologie van adipocyten, waardoor een nauwkeurige detectie van intramusculair vet mogelijk is. In vergelijking met niet-gewonde TA-spieren induceert glycerolletsel de expressie van vroege adipogene markers, zoals PPAR-gamma en CEBP-alfa zodra drie dagen na het letsel. Rijpe markers zoals adiponectine en perilipin kunnen al vijf dagen na glycerolbeschadiging worden gedetecteerd.

Met behulp van genetische afstammingstracering drukt de meerderheid van de PDGF-receptor alfa-FAPs de afstammingsmarker EYFP uit. Zeven dagen na glycerolletsel zijn EYFP-positieve FAPs veranderd in EYFP-positieve perilipin die adipocyten tot expressie brengt, wat aantoont dat FAPs inderdaad de cellulaire oorsprong zijn van intramusculair vet. Het protocol kan ook worden aangepast om het myogene compartiment te visualiseren.

Met behulp van antilichamen tegen PAX7 en MYOD1 kunnen respectievelijk spierstamcel- en myoblastmarkers vijf dagen na glycerolletsel gemakkelijk worden gedetecteerd, zelfs in PFA-vaste spierweefselsecties. Dit protocol kan ook worden aangepast om adipocyten en andere volwassen weefsels te visualiseren en te kwantificeren. Bovendien is onze weefselconserveringstechniek compatibel met de verscheidenheid aan verschillende staande technieken.