Isolatie en identificatie van vasculaire endotheelcellen uit verschillende vetdepots voor downstreamtoepassingen

Dit protocol stelt de onderzoeker in staat om slagaders van belang te ontleden en vasculaire cellen te isoleren om een breed scala aan functionele tests uit te voeren. Onderzoeker kan verschillende vasculaire bedden en celtypen onderzoeken om de kennis van vasculaire celbiologie en het mechanisme van vasculaire disfunctie uit te breiden. Deze methode is het meest toepasbaar op onderzoekers die onderzoek doen naar elementaire vasculaire celbiologie, evenals vasculaire celdisfunctie in diermodellen van ziekten.

Speciale zorg moet worden besteed aan het optimaliseren van het spijsverteringsprotocol, vooral wanneer vasculaire bedden van belang verschillen van die hier gepresenteerd. Om te beginnen bevestigt u de muis met dissectiepennen en spuit u het ventrale oppervlak met 70% ethanol. Gebruik een tang om de huid recht boven de geslachtsdelen te liften en maak een kleine incisie van ongeveer twee millimeter in de huid.

Steek de punt van de schaar in de incisieplaats en maak een vier tot vijf centimeter lange middellijnincisie die begint bij de eerste incisie en craniaal ontleedt naar de basis van het borstbeen. Maak een incisie van een centimeter die zich zijdelings uitstrekt vanaf de middellijn direct onder de voorpoot. Maak een diagonale incisie van één centimeter tussen de achterpoot en geslachtsdelen.

Maak kleine sneden langs de middellijn huidincisies om het bijbehorende bindweefsel weg te pellen en het onderhuidse vetdepot bloot te leggen. Identificeer het C-vormige onderhuidse vetweefsel en de slagader of ader die loodrecht op de buikholte loopt. Begin vanaf de onderkant van de C-vorm in de buurt van de geslachtsorganen en pak voorzichtig het vetweefsel vast om de bindweefsels bloot te leggen.

Maak kleine sneden in het bindweefsel om het vet van de huid te scheiden en vermijd het verstoren van de blootgestelde vasculatuur. Ga door met het ontleden van het bindweefsel totdat het onderhuidse vetweefsel intact kan worden verwijderd. Scheid de blootgestelde slagader zorgvuldig van het omliggende bindweefsel.

Bewaar het geïsoleerde onderhuidse vet in de HEPES-buffer op ijs. Herhaal de dissectie voor het resterende posterieure subcutane vetdepot. Om het mesenteriale vetdepot te isoleren, gebruikt u de Graefe-tang om de dunne peritoneale spouwwand boven de urineblaas op te tillen en een kleine incisie te maken met een rechte schaar.

Til langzaam de peritoneale spouwwand op en steek de rechte irisschaar in de incisieplaats. Maak een incisie van vier tot vijf centimeter van de urineblaas naar het borstbeen. Maak vervolgens twee horizontale incisies van een centimeter met de rechte irisschaar die zich zijdelings uitstrekt van de middellijn tot direct boven de achterpoot en onder de voorpoot.

Gebruik de Graefe-tang om de buikspieren af te pellen en de peritoneale ingewanden bloot te leggen. Gebruik een paar nummer vijf tangen om de darmen uit de viscerale holte te tillen om het mesenteriale vet te onthullen. Gebruik de gebogen schaar en nummer vijf tang om de vett langs de dikke darm te scheiden, beginnend bij de blindedarm tot waar de dikke darm uit het zicht afdaalt.

Scheid vervolgens de vetstof langs de dunne darm naar de alvleesklier. Verwijder een klein deel van de alvleesklier om het mesenteriale vet volledig te isoleren. Bewaar de geïsoleerde mesenteriale vetstof in HEPES-buffer op ijs.

Om de slagaders te isoleren, breng je eerst het vetweefsel over naar een ontleedschaal met 10 milliliter koude HEPES-buffer. Plaats onder een stereomicroscoop het onderhuidse vetweefsel om het aderpaar van de slagader bloot te leggen. Plaats het viscerale vetweefsel om de bloemkoolvorm en het respectievelijke slagaderaderpaar bloot te leggen.

Gebruik een tang nummer 55 om het parenchymale vet uit de slagader te verwijderen. Verwijder kleine stukjes vet per keer zonder de vasculatuur van belang te beschadigen. Ga door totdat de slagaders volledig vrij zijn van parenchymaal vetweefsel.

Gebruik nummer vijf tang om de gereinigde slagaders over te brengen naar een nieuwe buis met verse HEPES-buffer en blijf op ijs totdat het klaar is voor de spijsvertering. Voeg eerst één milligram dispase en elastase toe aan een microcentrifugebuis van twee milliliter. Voeg twee milliliter dissociatieoplossing, vortex en incubeer bij 37 graden Celsius totdat het volledig is opgelost.

Gebruik nummer vijf tang om de gereinigde slagaders over te brengen naar de respectieve monsterbuizen. Incubeer de buizen bij 37 graden Celsius gedurende een uur met zachte agitatie door inversie om de 10 tot 15 minuten. Voeg in de tussentijd één milligram collagenase type één per monster toe aan nieuwe buizen.

Laat na incubatie de slagaders zich aan de onderkant van de buis nestelen en breng 500 microliter van de buffer van boven naar de buizen met collagenase. Vortex en retourneer deze oplossing naar de respectievelijke monsterbuizen. Incubeer de monsters bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten.

Zorg ervoor dat de slagaders in stukken scheiden bij het schudden van de monsterbuis. Gebruik een glazen pipet om het verteerde weefsel 10 tot 15 keer krachtig te tritureren om de cellen mechanisch te dissociëren. Voer de verteerde monsters door een 70 micron celzeef of een flowcytometriebuiszeef om eencellige suspensies te verkrijgen.

Centrifugeer de eencellige suspensie en verwijder het supernatant. Suspensie de celpellet opnieuw in één milliliter PBS met 5% BSA gedurende 30 minuten. Voeg een microliter cel levensvatbaarheidsvlek toe en incubeer in het donker gedurende 30 minuten.

Centrifugeer de celsuspensie en suspensie de celpellet opnieuw in 200 microliter PBS met 1% BSA. Voeg primaire antilichamen toe die zijn geconjugeerd aan CD31 en CD45 en incubeer gedurende 15 minuten op een rocker in de koelkast. Was de cellen door een milliliter PBS met 1% BSA rechtstreeks aan de celsuspensie toe te voegen.

Centrifugeer de celsuspensie en suspensie de pellet opnieuw in 200 microliter 1% formaldehyde met 0,1% BSA. Dek de buizen af met aluminiumfolie en bewaar in de koelkast tot het klaar is voor flowcytometrie. Celpreparaten verkregen uit verteerde subcutane vetslagaders werden gebruikt om de endotheelcelpopulaties te identificeren met behulp van flowcytometrie.

CD31-positieve CD45-negatieve cellen werden geïdentificeerd als endotheelcellen. De levensvatbaarheidsvlek van de cel maakte de identificatie mogelijk van alleen die levensvatbare cellen die het isolatie- en spijsverteringsprotocol overleefden voorafgaand aan de fixatie. Om de verschillen in membraaneiwitexpressie en endotheelcellen uit verschillende vetdepotvasculatuur te identificeren, werden de geïsoleerde cellen onderzocht op vetzuurtranslocase CD36.

CD36-positieve endotheelcellen werden geïdentificeerd in subcutaan en mesenterieel vet. Kwantificering van CD36-expressie en subcutane en mesenteriale endotheelcellen onthulde dat zowel het percentage endotheelcellen dat CD36 tot expressie bracht als de intensiteit van CD36-expressie groter waren in subcutane endotheelcellen. Het is cruciaal om de slagaders zorgvuldig te ontleden, te identificeren en schoon te maken.

Het belangrijkste is dat het verteringsprotocol een voldoende opbrengst van levensvatbare cellen moet produceren voor downstream-toepassingen. Na deze procedure kan de geïsoleerde celpopulatie worden gebruikt voor toepassingen, waaronder maar niet beperkt tot elektrofysiologie, moleculaire profilering en het genereren van primaire cellijn voor geneesmiddelenscreening in vitro.