Chromosoomconformatie vastleggen over lengteschalen

Dit protocol detecteert nauwkeurig chromosoomvouwingsfuncties over meerdere lengteschalen met een laag achtergrondsignaal. Promotor enhancer interacties kunnen bijvoorbeeld worden geanalyseerd in de context van chromosoomcompartimenten. Het gebruik van restrictie-endonucleasen omzeilt het optimaliseren van het verteringsniveau van inputmateriaal.

Er is geen selectie door gelisolatie vereist om ligatieproducten te vangen. Het meest voorkomende probleem is het verlies van cellen na DSG-fixatie en het vastleggen van voldoende DNA om bibliotheken van hoge kwaliteit te produceren. Om te beginnen, aspirateer het medium met een Pasteur-pipet gekoppeld aan een vacuümval van de 150-millimeterplaat met 5 bij 10 tot de zesde cellen.

Was de cellen twee keer met 10 milliliter HBSS. Om de cellen te kruisen, giet 23,125 milliliter van de 1% formaldehyde-oplossing in de 15-centimeterplaat. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en schud de plaat elke twee minuten voorzichtig met de hand.

Voeg vervolgens 1,25 milliliter 2,5 molaire glycine toe en draai de plaat voorzichtig rond om de cross-linking reactie te doven, voordat je gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur broedt. Ga door met incuberen op ijs gedurende 15 minuten om cross-linking te stoppen. Schraap de cellen van de plaat met een celschraper of rubberen politieagent en breng de celsuspensie over op een conische buis van 50 milliliter met een pipet.

Centrifugeer de suspensie op 1.000 maal G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant door aspiratie weg. Was de pellet eenmaal met 10 milliliter dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing, of DPBS. Centrifugeer vervolgens opnieuw voordat u doorgaat naar DSG-crosslinking.

Voor cross-linking met DSG, resuspendeer de gepelletiseerde cellen in 9,9 milliliter DPBS. Voeg vervolgens 100 microliter DSG van 300 millimol toe. Meng de buis door inversie en koppel de cellen bij kamertemperatuur gedurende 40 minuten aan een rotator.

Voeg na cross-linking 1,925 milliliter 2,5-molaire glycine toe, keer om om te mengen en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer vervolgens de cellen op 2.000 keer G gedurende 15 minuten en resuspenseer de pellet in één milliliter van 0,05% runderserumalbumine DPBS voordat u het overbrengt naar een buis van 1,7 milliliter. Centrifugeer de cellen op 2.000 maal G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg.

Vries de pellet in vloeibare stikstof voordat u doorgaat naar de chromosoombevestigingsvangst. Resuspenseer de verknoopte cel aliquot in één milliliter ijskoude lysisbuffer met 10 microliter proteaseremmercocktail en breng over naar een Dounce-homogenisator gedurende 15 minuten incubatie op ijs. Beweeg stamper A langzaam 30 keer op en neer om de cellen te homogeniseren en incubeer gedurende één minuut om de cellen te laten afkoelen voor nog eens 30 slagen.

Breng na de laatste slag het lysaat over in een buis van 1,7 milliliter. Centrifugeer de gelyseerde suspensie gedurende vijf minuten op 2.500 maal G. Gooi het supernatant weg en veeg of vortex om de natte pellet te resuspenderen.

Verwijder zoveel mogelijk van het supernatant om een yoghurtachtige substantie te verkrijgen met minimale klonten. Resuspensie de pellet in 500 microliter ijskoude restrictiebuffer voor centrifugatie. Na de tweede wasbeurt resuspenseert u de pellet in 360 microliter restrictiebuffer door te pipetteren na toevoeging van ongeveer 340 microliter aan het overdrachtsvolume van de pellet, afhankelijk van de celgrootte.

Zet 18 microliter lysaat opzij voor het testen van de chromatine-integriteit, of CI.To het resterende lysaat, voeg 38 microliter 1% natriumdodecylsulfaat toe aan de hi-C-buis om een totaal volume van 380 microliter te maken en meng zorgvuldig door te pipetteren zonder bubbels te introduceren. Incubeer de monsters op 65 graden Celsius zonder 10 minuten te schudden om het chromatine te openen. Plaats de buis vervolgens onmiddellijk op ijs.

Voeg na het bereiden van het digestiemengsel met Triton X-100 107 microliter van dit mengsel toe aan de hi-C-buis om een totaal volume van 487 microliter te maken en verteerbaar het chromatine een nacht bij 37 graden Celsius in een thermomixer met intervalschudden. Breng de monsters de volgende dag gedurende 20 minuten over naar 65 graden Celsius om de resterende endonuclease-activiteit te deactiveren. Nadat u het monster op ijs hebt geplaatst, zet u 10 microliter digestiecontrole of DC opzij en bewaart u ze bij vier graden Celsius.

Verwijder de condens van het deksel met een pipet of door te draaien. Voeg vervolgens 58 microliter biotine fill-in mix toe om een totaal volume van 535 microliter te maken. Pipetteer voorzichtig zonder bellen te vormen voordat je vier uur lang bij 23 graden Celsius in een thermomixer broedt.

Voeg na incubatie 665 microliter ligatiemengsel toe, waardoor het monstervolume 1.200 microliter wordt. Meng het monster door te pipetteren en incubeer op 16 graden Celsius gedurende vier uur in een thermomixer. Voeg vervolgens 50 microliter proteïnase-K in twee fracties toe aan de hi-C-monsterbuis en incubeer 's nachts bij 65 graden Celsius met interval schudden.

Voeg voor DNA-zuivering 100% ijskoude ethanol toe en centrifugeer de buizen op 18.000 keer G gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant volledig van de niet-pelletzijde en droog het monster aan de lucht gedurende 10 minuten of totdat de pellets zichtbaar droog zijn. Zodra de pellets droog zijn, solubilileer ze in 450 microliter Tris low-EDTA door te pipetteren of te wervelen.

Breng de opgeloste suspensie over naar een centrifugaalfiltereenheid van 0,5 millimeter, of CFU, met een afsnijding van drie kilodalton molecuulgewicht. Centrifugeer de CFU op maximale snelheid gedurende 10 minuten en gooi de doorstroom weg. Voeg na de tweede wasbeurt 80 microliter Tris low-EDTA toe aan de kolom.

Verander de kolom in een nieuwe opvangbuis voor twee minuten centrifugatie op maximale snelheid. Laad ten slotte de monsters op een 0,8% agarose-gel. Agarose-gel met PCR-titratieresultaten toonde aan dat de meeste bibliotheken vijf tot acht cycli van uiteindelijke PCR-versterking vereisen.

Celvertering van de uiteindelijke versterkte PCR-bibliotheek, zoals waargenomen door kleinere fragmenten op een agarose-gel, bevestigt de aanwezigheid van de juiste ligatieknooppunten en dient als een kwaliteitscontrole voordat de volgorde wordt aangebracht. Na sequencing toonden de in kaart gebrachte gegevens aan dat de combinatie van DpnII en DdeI de korteafstandscontacten aanzienlijk verhoogt, omdat DSG wordt toegevoegd aan de conventionele formaldehyde-crosslinking. Een verbeterd signaal kon ook worden waargenomen op lange en korte afstanden rechtstreeks van 2D-interactiematrices.

Compartimentsignalen zijn CRISPR op lange afstanden en stippen gevormd door chromatinelussen zijn prominenter aanwezig op korte afstanden. Naast formaldehyde vermindert cross-linking met DSG willekeurige ligaties, waardoor de relatieve dekking in cis verbetert. Het is belangrijk om geen cellen te verliezen tijdens en na crosslinking.

Celpellets kunnen los of onzichtbaar zijn en cellen kunnen in sommige buffers aan pipetpunten blijven plakken.