Name: In vitro Apiical-Out Enteroid Model van Necrotiserende Enterocolitis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Leer een apical-out enteroid model voor necrotiserende enterocolitis met omgekeerde polariteit. Deze methode biedt toegang tot het apicale oppervlak voor het testen van orale therapeutica in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. HC wordt ondersteund door subsidie P20GM134973 van de National Institutes of Health. KB wordt ondersteund door een Children's Hospital Foundation (CHF) en Presbyterian Health Foundation (PHF) subsidie. We bedanken het Laboratorium voor Moleculaire Biologie en Cytometrie onderzoek van OUHSC voor het gebruik van de Core Facility, die confocale beeldvorming leverde.

Alle dierprocedures in deze studie werden goedgekeurd door het University of Oklahoma Health Sciences Center Institutional Animal Care and Use Committee. Dunne darm gemaksmonsters van een premature niet-menselijke primaat (NHP, 90% dracht, olijfbaviaan, Papio anubis) werden verkregen na euthanasie voor een afzonderlijke studie (Protocol #101523-16-039-I).
1. Opstelling van het apicale-uit enteroïde NEC-in-een-schotelmodel
<ol><li>Voorbereiding van media- en enteroïde behandelingen OPMERKING: Eenmaal bereid volgens de standaard aseptische techniek, kunnen de media maximaal 1 week bij 4 °C worden bewaard.<ol><li>Bereid antibioticavrije media (AFM) door 50 ml menselijke organoïde groeimedia te mengen met 50 ml organoïde supplement (zie materiaaltabel). Bereid 5 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur/1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (EDTA/PBS) door 100 μL van 0,5 M EDTA toe te voegen aan 9.900 μL PBS.</li>
		<li>Koel Dulbecco's gemodificeerde eagle's medium/nutriënt Ham's mengsel F12 + 15 mM HEPES Buffer (DMEM/F12) bij 2-8 °C.</li>
		<li>Bereid TNF-α stamoplossing door 100 μg TNF-α poeder in 1 ml 1x PBS te suspenseren. Verdun de TNF-α voorraad verder tot concentraties van 20 ng/ml en 50 ng/ml met AFM als oplosmiddel. Bereid LPS-stamoplossing door 2 mg LPS in 1 ml 1x PBS te suspenseren. Verdun de voorraad LPS verder tot 100 μg/ml en 200 μg/ml met AFM als oplosmiddel.</li>
	</ol></li>
	<li>De polariteit van 3D-enteroïden omkeren OPMERKING: De volgende procedure is bedoeld voor het omkeren van een enkele 24-well flat-bottom weefselkweekplaat in twee 24-well ultra-low attachment weefselkweekplaten. De weefselkweekplaten moeten gedurende ten minste 30 minuten vóór gebruik worden opgewarmd tot 37 °C. De afleiding van basolaterale 3D-enteroïden werd bereikt zoals eerder beschreven door vele groepen35,36, met kleine aanpassingen voor media (hierboven beschreven). De algemene enteroïde afleidingsprocedure verschilt niet van die van mensen. Kortom, weggesneden weefsel wordt gewassen, in kleine fragmenten gesneden en geïncubeerd in celverstoringsbuffer. De celoplossing wordt vervolgens door een celzeef van 70 μM geleid, wat resulteert in crypten die met een hoge dichtheid worden verguld.<ol><li>Aspirate media uit elke put van een 24-well plaat van gevestigde 3D basolaterale enteroïden.</li>
		<li>Voeg 500 μL 5 mM ijskoude EDTA/PBS toe aan elke put van de 24-well plaat en verstoor voorzichtig mechanisch het keldermembraanextract/ECM dome door minimaal 5x-6x op en neer te pipetteren met een p200 pipet.</li>
		<li>Breng de inhoud van vier putten over in een conische buis van 15 ml en voeg 8 ml ijskoude EDTA / PBS toe aan de conische buis. Breng de resterende 20 putten op dezelfde manier over.</li>
		<li>Incubeer 15 ml conische buizen bij 4 °C gedurende 1 uur op een roterend platform of schudder bij 330 tpm. Na de incubatie van 1 uur centrifugeert u de conische buizen bij 300 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant uit elke buis en gooi het weg.</li>
		<li>Combineer en was de celpellets met 5 ml DMEM/F12 en verdeel de celsuspensie in twee conische buizen van 15 ml.</li>
		<li>Pelleteer de cellen door centrifugeren bij 300 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant en voeg 12 ml AFM toe aan elke buis, zodat de celpellets worden geresuspendeerd.</li>
		<li>Pipetteer 500 μL van de enteroïde suspensie in elk putje van twee 24-well ultralage bevestigingsplaten.</li>
		<li>Incubeer de platen bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 2-5 dagen of totdat enteroïden de polariteit hebben omgekeerd.</li>
		<li>Om enteroïde omkering te controleren, stelt u eerst de bevestigende immunofluorescente kleuring en de gemiddelde tijd tot omkering (~ 3 dagen) vast en bevestigt u vervolgens de omkering van de polariteit met behulp van een eenvoudige lichtmicroscoopvisualisatie. Apicale enteroïden zien er zeer cellulair uit, terwijl basolaterale enteroïden vaak worden gedomineerd door de aanwezigheid van een groot centraal lumen of ontluikende (zie aanvullende figuur 1). OPMERKING: Zodra de procedure is gestandaardiseerd, is de conversieratio naar apiical-out meestal hoger dan 95%. Het gebruik van apiical-out enteroïden is bedoeld als een terminaal experiment, hoewel het theoretisch mogelijk is om apiical-out enteroïden door te geven aan een klein aantal basolaterale enteroïden.</li>
	</ol></li>
	<li>Apicale-uit NEC-in-een-gerecht OPMERKING: Zodra de enteroïden de polariteit hebben omgekeerd, gebruikt u de culturen snel in volgende experimenten, omdat hun levensduur in apicale conformatie niet langer dan 3-4 dagen is bevestigd. Voor het volgende NEC-in-a-dish-model werden de enteroïden gedurende 24 uur behandeld, onmiddellijk daarna verzameld en bewaard voor downstream-experimenten.<ol><li>Zodra de enteroïden de polariteit visueel hebben omgekeerd met ten minste 95% efficiëntie, verwijdert u de platen uit de incubator en verzamelt u acht putten van een 24-well plaat in een conische buis van 15 ml. Omdat de apicale enteroïden in suspensie zijn, pipetteer u eenvoudig de enteroïde / media-oplossing. Centrifugeer de buis van 15 ml bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
		<li>Zodra de cellen zijn gepelletiseerd, verwijdert u het supernatant en resuspendeert u de celpellet in 4 ml AFM gemengd met het gewenste volume (10 μL hier om overeen te komen met het hoogste toegevoegde behandelingsvolume) van 1x PBS (controle).</li>
		<li>Pipetteer 500 μL enteroïde/PBS/AFM-suspensie in acht putjes van een 24-well ultralage bevestigingsplaat en incubeer de plaat bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24 uur.</li>
		<li>Herhaal stap 1.3.1.-1.3.3. voor TNF-α (20 ng/ml en 50 ng/ml) en LPS (100 μg/ml en 200 μg/ml) behandelingen bij normoxie. Herhaal voor alle hypoxiebehandelingen stap 1.3.1.-1.3.3., maar plaats de plaat in een aparte couveuse bij 37 °C, 5% CO2 en 1% O2 gedurende 24 uur. OPMERKING: Stap 1.3.4. kan gelijktijdig met stap 1.3.1.-1.3.3 worden uitgevoerd, maar voor de duidelijkheid werd de bovenstaande procedure gescheiden door behandeling om de complexiteit te verminderen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Immunofluorescente kleuring en confocale microscopie
<ol><li>Bereiding van kleuringsoplossingen<ol><li>Bereid 0,1% Triton X-100 door 7 μL Triton X-100 in 1x PBS te mengen tot een eindvolume van 7 ml. Bereid PBST (PBS-Tween) voor door 30 μL Tween-20 tot 1x PBS toe te voegen aan een eindvolume van 30 ml.</li>
		<li>Bereid 10% normaal ezelsserum (NDS)/PBST door 700 μL NDS toe te voegen aan 6,3 ml PBST. Bereid 1% NDS/PBST door 70 μL NDS toe te voegen aan PBST aan een eindvolume van 7 ml. OPMERKING: Donkey serum werd hier gebruikt om te correleren met de secundaire antilichaamgastheer. De blokkerende serumsoorten moeten echter overeenkomen met de secundaire antilichaamsoorten om niet-specifieke binding goed te blokkeren.</li>
	</ol></li>
	<li>Kleuring (Dag 1)<ol><li>Breng de inhoud van vier putten van een 24-wells plaat over naar een 1,5 ml microcentrifugebuis. Herhaal dit voor alle gewenste putten/behandelingen, met elke behandeling in een aparte tube. Centrifugeer de buizen bij 300 x g gedurende 4 minuten bij 4 °C. Zodra de enteroïden zijn gepelleteerd, verwijdert u het supernatant.</li>
		<li>Resuspendeer de celpellets in 300 μL van 4% formaldehydefixatiemiddel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT). Na 30 minuten centrifugeer je de buizen bij 300 x g gedurende 4 minuten bij 4 °C, verwijder je het supernatant en was je de pellet met 500 μL steriel, RT 1x PBS.</li>
		<li>Centrifugeer de buizen bij 300 x g gedurende 4 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant en voeg 500 μL van 0,1% Triton X-100 toe en laat 1 uur op RT zitten.</li>
		<li>Na 1 uur centrifugeer je de buizen bij 300 x g gedurende 4 min bij 4 °C en verwijder je het supernatant. Wassen met 500 μL 1x PBS en plaats de buizen op een rotator of shaker bij 200 rpm gedurende 15 min bij 2-8 °C. Herhaal dit in totaal 4x.</li>
		<li>Centrifugeer de buizen bij 300 x g gedurende 4 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant. Voeg 500 μL 10% NDS/PBST toe en incubeer bij RT gedurende 45 min. Bereid tijdens de incubatie primaire antilichaamoplossingen door 20 μL recombinant anti-villine-antilichaam, 10 μL E-cadherine-antilichaam en 1970 μL van 1% NDS / PBST te combineren voor acht putten van een 24-wellsplaat.</li>
		<li>Na de incubatie van 45 minuten centrifugeert u de buizen bij 300 x g gedurende 4 minuten bij 4 °C. Plaats de buisjes op ijs. Verwijder het supernatant en vervang door 250 μL primaire antilichaamoplossing. Incubeer de buizen een nacht bij 2-8 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Kleuring (Dag 2)<ol><li>Centrifugeer de buizen bij 300 x g gedurende 4 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant. Voeg 250-500 μL PBST toe aan elke buis, afhankelijk van de grootte van de pellet, en plaats op de rotator of shaker bij 200 tpm gedurende 1 uur bij 2-8 °C. Herhaal de PBST was 4x.</li>
		<li>Bereid secundaire antilichaamoplossing door 52 μL Cy3 ezel anti-konijn IgG (H + L) toe te voegen aan 50% glycerol en 5,2 μL ezel anti-muis fluorescerend groen 488 secundaire antilichamen tegen 5142,8 μL van 1% NDS/PBST.</li>
		<li>Na de laatste PBST-wasbeurt en centrifugatie verwijdert u het supernatant uit de buizen. Doseer 200 μL secundaire antilichaamoplossing aan elke buis en incubeer in het donker een nacht bij 2-8 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Montage van bevlekte apicale enteroïden (dag 1)<ol><li>Breng mountant op basis van glycerol met blauwe kernkleurstof gedurende 1 uur aan op RT.</li>
		<li>Centrifugeer de buizen bij 300 x g gedurende 4 minuten bij 4 °C. Verwijder 100 μL van het supernatant en resuspensieer de cellen in de resterende ~100 μL supernatant. Breng de celsuspensie over op buizen van 0,5 ml.</li>
		<li>Centrifugeer de buizen in een minicentrifuge gedurende 20 s om de cellen te pelleteren. Verwijder het supernatant en resuspenseer de celkorrels in 100 μL verrode nucleïnezuurvlek. Incubeer de buizen bij RT gedurende 10 min.</li>
		<li>Centrifugeer de buizen in een minicentrifuge gedurende 20 s om de cellen te pelleteren. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellets in 100 μL 1x PBS. Herhaal dit voor een tweede wasbeurt.</li>
		<li>Centrifugeer de buizen in een minicentrifuge gedurende 20 s om de cellen te pelleteren en verwijder 70 μL van het supernatant. Resuspendeer de cellen in het resterende volume PBS en breng de inhoud over naar een gelabelde coverslip (24 mm x 60 mm).</li>
		<li>Breng 75 μL mountant rechtstreeks op het monster aan en verwijder eventuele bubbels met een pipetpunt. Laat de coverslips 's nachts (18-24 uur) bij RT in het donker uitharden.</li>
	</ol></li>
	<li>Montage van bevlekte apicale enteroïden (dag 2)<ol><li>Breng na een nacht uitharden een dunne laag (~ 15 μL) glycerol aan op de coverslips. Monteer de coverslip op de glasschuif en druk zachtjes op zijn plaats. Tik om eventuele luchtbellen tussen de coverslip en de dia te verwijderen.</li>
		<li>Laat de coverslip minimaal 2 uur in het donker op RT zetten, voordat u met een confocale microscoop bij 20x vergroting beeld krijgt. Voor microscopische visualisatie van enteroïden met behulp van verschillende confocale acquisitiemethoden, zie Lallemant et al.37.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunofluorescente kwantificering OPMERKING: Deze methode bepaalt de gecorrigeerde totale fluorescentie door het achtergrondsignaal te verwijderen met behulp van ImageJ-software (https://imagej.nih.gov/ij/).<ol><li>Open de confocale afbeeldingen in ImageJ en schets het gewenste gebied met de tool region of interest (ROI).</li>
		<li>Stel door de gebruiker gedefinieerde parameters in door te navigeren naar Analyseren > Metingen instellen. Selecteer Gebied > Geïntegreerde dichtheid > Gemiddelde grijze waarde onder het tabblad Instellingen.</li>
		<li>Navigeer naar Analyseren > Meten. Er verschijnt een pop-upvenster met de metingen. Kopieer en plak deze metingen in een spreadsheet.</li>
		<li>Als u het achtergrondsignaal wilt aftrekken, selecteert u een klein niet-fluorescerend gebied van de afbeelding. Navigeer naar Analyseren > Meten voor die regio. Er verschijnt een pop-upvenster met de metingen. Kopieer en plak de uitvoer in een spreadsheet.</li>
		<li>Vermenigvuldig de oppervlakte van de geselecteerde cel met de gemiddelde fluorescentie van achtergrondmetingen en trek de som af van de geïntegreerde dichtheid om de gecorrigeerde totale celfluorescentie (CTCF) te berekenen. Herhaal de bovenstaande stappen voor alle interessante afbeeldingen, terwijl u records bijhoudt in een spreadsheet of statistisch softwarepakket (zie Materiaaltabel).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Apicale-out NEC-in-een-schotelcel levensvatbaarheid
<ol><li>Enteroïde behandelingen<ol><li>Stel een apical-out NEC-in-a-dish-model vast gedurende 24 uur, zoals in stap 1.</li>
		<li>Ontdooi de levensvatbaarheid van het reagens van de cel gedurende een nacht bij 4 °C. Breng het reagens op de dag van de test 30 minuten voor gebruik op RT. Keer het reagens om om te mengen.</li>
		<li>Verwijder voordat u de test uitvoert 100 μL media uit elke put en laat de resterende 400 μL over. Voeg 400 μL cel levensvatbaarheidstestreagens toe aan elke put.</li>
		<li>Meng de inhoud krachtig goed op een platenschudder op RT gedurende 5 minuten bij 200 tpm om cellyse te induceren. Na het schudden incubeer je de plaat bij RT nog eens 25 minuten.</li>
		<li>Meng na 25 minuten incubatie de inhoud van een put via pipetteren en breng 200 μL van de 800 μL over naar een enkele put van een 96-well, ondoorzichtige, polystyreen, heldere bodemplaat. Herhaal dit voor de resterende 600 μL en maak vier technische replicaties per put. Breng de resterende inhoud van elke put van de 24-well plaat op deze manier over in een 96-well plaat.</li>
		<li>Met behulp van een plaatlezer die in staat is tot luminescentie, registreer waarden bij 0,25 ms integratie en vergelijk de relatieve waarden tussen behandelingen. U kunt ook de luminescentie van de behandeling vergelijken met een adenosinetrifosfaat (ATP) -standaard.</li>
	</ol></li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen en hebben geen belangenconflicten.

De recente ontwikkeling van enteroïde modellen afgeleid van intestinale epitheliale crypten zorgt voor een meer fysiologisch relevant in vitro weefsel om necrotiserende enterocolitis pathogenese te bestuderen. Ondanks het feit dat alle belangrijke gedifferentieerde celtypen van het darmepitheel zijn opgenomen, zijn 3D-enteroïden nog steeds onderhevig aan verschillende significante beperkingen. De conventionele, basolaterale enteroïden worden gesuspendeerd in 3D ECM-hydrogelkoepels, waarvan de samenstelling en di...

Necrotiserende enterocolitis (NEC), een ernstige ontstekingsziekte van de dunne darm die voorkomt bij maximaal 10% van de te vroeg geboren baby's, wordt vaak geassocieerd met hoge morbiditeit en mortaliteit 1,2. Sterftecijfers van bijna 50% bij baby's met een zeer laag geboortegewicht (<1500 g), die chirurgische ingrepen vereisen, zijn niet ongewoon3. Hoewel de exacte etiologie van NEC momenteel niet wordt begrepen, wordt gedacht dat risicofactoren, zoals kunstvoeding, zich vermengen met fysiologische anomalieën, zoals dysbiose, een onrijp darmepitheel en een disfunctionele darmbarrière, bij de ontwikkeling van de ziekte 2,4. Ondanks aanzienlijke inspanningen is er de afgelopen tien jaar weinig vooruitgang geboekt in de preventie of behandeling van NEC5. Een nieuwe in vitro methode om NEC en geassocieerde intestinale epitheliale barrièredisfunctie te bestuderen, is vereist om het begrip van de pathogenese van de ziekte te bevorderen, omdat bevindingen van diermodellen tot nu toe slecht zijn vertaald naar het bed6.
Een aantal in vitro modellen zijn gebruikt om de mechanismen die spelen tijdens NEC te onderzoeken. De menselijke intestinale epitheelcellijn, Caco-2, is een van de meest gebruikte in vitro modellen van NEC 7,8. Caco-2-cellen emuleren morfologische kenmerken van de dunne darm, maar differentiëren als cellijn niet in de grote verscheidenheid aan in vivo celtypen, waaronder slijmproducerende bokaalcellen, die nodig zijn voor een zeer vertaalbaar model. HT-29-MTX, menselijke colon adenocarcinoom cellen, omvatten een gemengd enterocyten- en bokaalcelfenotype, maar missen nog steeds op crypten gebaseerde celtypen van het darmepitheel9. IEC-6 en IEC-18 zijn niet-getransformeerde cellijnen met een onrijpe ileale crypte-achtige morfologie, maar zijn niet afgeleid van menselijk weefsel, waardoor hun translationele capaciteit wordt beperkt. FHs 74-Int en H4 darmcellijnen zijn afgeleid van menselijk foetaal weefsel en vormen geen tight junctions of gepolariseerde monolagen 10,11, en zijn dus onvolgroeid in vergelijking met zelfs de meest premature baby's die vatbaar zijn voor NEC. Meestal gebruiken NEC in vitro modellen lipopolysaccharide (LPS) behandelingen om toll-like receptor 4 (TLR4) te induceren, een belangrijke receptor die darmontsteking in NEC12 initieert. Schade gemedieerd door reactieve zuurstofsoorten (ROS) behandeling, meestal via waterstofperoxide, wordt vaak gebruikt om NEC-achtige oxidatieve schade en apoptose 13,14 te induceren. Als de belangrijkste aanjager van darmontsteking wordt tumornecrosefactor-alfa (TNF-α), een stroomafwaartse component van de inflammatoire TLR4-signalering, ook vaak gebruikt in deze in vitro modellen om in vivo pathogenese na te bootsen15.
Organoïden, gegenereerd uit induceerbare pluripotente stamcellen (iPSC's), zijn in populariteit gegroeid als een in vitro model van de darm vanwege hun vermogen om de complexe in vivo architectuur en celachtige samenstelling van het weefsel waaruit ze zijn afgeleid te recapituleren16,17. Een verwant in vitro systeem, enteroïden, zijn organoïden afgeleid van gereseceerde darmcrypten die gemakkelijker kunnen worden vastgesteld en onderhouden dan van iPSC afgeleide organoïden. Enteroïden worden meestal gekweekt in een driedimensionale (3D) extracellulaire matrix (ECM) met experimentele toegang beperkt tot het basolaterale celoppervlak. Methoden, zoals micro-injectie18,19, zijn ontwikkeld om deze barrière naar het apicale oppervlak te overwinnen, maar de opbouw van afgesleten cellulair puin en slijm in het lumen maakt micro-injectie zowel technisch moeilijk als inconsistent. Aangezien aangepaste robotische micro-injectieplatforms niet breed toegankelijk zijn20, worden lab-to-lab variabiliteit in technische vaardigheden en algemene techniek belangrijke variabelen die moeten worden overwonnen met micro-injectieprotocollen. Tweedimensionale (2D) monolagen afgeleid van gedissocieerde 3D-enteroïden, die nog steeds alle belangrijke celtypen van het darmepitheel omvatten, bieden toegang tot het apicale oppervlak, maar zijn traditioneel moeilijk te onderhouden zonder een feederlaag van mesenchymale myofibroblasten21. Hoewel celkweekdoorlatende steunen kunnen worden gebruikt om toegang te krijgen tot zowel de apicale als de basolaterale zijden van enteroïde monolagen zonder het gebruik van onderliggende myofibroblasten, vereisen deze inserts excisie en montage van het membraan voor gebruik met modaliteiten zoals confocale microscopie, wat resulteert in een technisch veeleisender en moeilijker proces bij gebruik van traditionele microscopiemethoden22. NEC is in vitro gemodelleerd met behulp van traditionele 3D-enteroïden 23,24,25 en permeabele ondersteunt26,27, en darmontsteking is onlangs gerepliceerd met darm-op-een-chip modellen28,29. Hoewel gut-on-a-chip-modellen met microfluïdica verreweg de meest geavanceerde en vertaalbare modellen zijn, is deze technologie duur, complex en ontoegankelijk voor de meeste onderzoekers30.
Recente ontwikkelingen in apiical-out enteroïde technieken hebben gemakkelijker toegang tot het apicale oppervlak van 3D-enteroïden mogelijk gemaakt zonder het risico te lopen de structurele integriteit van het in vitro epitheel te beschadigen 31,32,33. Apicale enteroïden delen de celtypesamenstelling en barrièrefunctie van in vivo darmepitheel, maar, in tegenstelling tot typische 3D-enteroïden, worden de apicale oppervlakken van deze cellen geconfronteerd met het kweekmedium, waardoor meer fysiologisch relevante studies mogelijk zijn over de absorptie van voedingsstoffen, microbiële infectie en luminale secretie31. Een bijkomend voordeel van apicale enteroïden is het vermogen om experimentele middelen homogeen te verdelen over enteroïden. Het variëren van behandelingsvolumes op basis van enteroïde grootte is niet vereist, zoals bij micro-injectie, en het vermogen om deze enteroïden in suspensiecultuur te houden, ontkent elke ECM-interferentie op experimentele agentdiffusie32.
Necrotiserende enterocolitis is een multifactoriële ziekte waarbij meerdere intestinale epitheelceltypen en een verscheidenheid aan omgevings- en pathofysiologische factorenbetrokken zijn 34. De gevarieerde celsamenstelling van intestinale enteroïden is een duidelijke verbetering ten opzichte van monoculturen bij het modelleren van een complexe ziekte zoals NEC. Interessant is dat, terwijl een enkele inflammatoire blootstelling vaak voldoende is om schade te veroorzaken in in vitro monoculturen, enteroïden, zoals bij muismodellen23, minimaal twee ontstekingscomponenten nodig lijken te hebben om NEC-achtige schade te induceren6. Hier presenteren we een apicale NEC-in-een-schotelmodel, met behulp van apicale enteroïden in combinatie met hypoxie (een belangrijk klinisch kenmerk van NEC6) en LPS- of TNF-α, als een verbeterd en meer fysiologisch relevant in vitro model om epitheliale reacties op NEC-achtige ontsteking te bestuderen en mogelijk therapeutische doelen te identificeren. We beschrijven een protocol voor het omkeren van de polariteit van dunne darm 3D-enteroïden, evenals een immunofluorescent kleuringsprotocol om epitheliale barrièreverstoring en junctionele eiwitexpressieveranderingen te identificeren. Ten slotte demonstreren we verder een eenvoudige enteroïde levensvatbaarheidstest om de impact van ons dual-hit, apiical-out NEC-in-a-dish-model te bepalen.

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Fisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conical tube</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-602</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass 24 mm x 60 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>102460</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AP182C</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>E-cadherin antibody (7H12)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-19051</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9</td><td>Millipore Sigma</td><td>1004960700</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Fiji</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>06010</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 Confocal Microscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography</td><td>Millipore Sigma</td><td>L3012-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>566460</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td><td>Thermo Scientific</td><td>136101</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36983</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]</td><td>Abcam</td><td>ab130751</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human TNF-&alpha; protein 100 &micro;g</td><td>Bio-Techne</td><td>210-TA-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L</td><td>Fisher Scientific</td><td>3140</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3 Iodide (642/661)</td><td>Thermo Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Tubes, 0.5 mL, flat cap</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0350</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro apiical-out enteroid model van necrotiserende enterocolitis

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotiserende enterocolitis (NEC) is een verwoestende ziekte die premature baby's treft, gekenmerkt door darmontsteking en necrose. Enteroïden zijn onlangs naar voren gekomen als een veelbelovend systeem om gastro-intestinale pathologieën te modelleren. Momenteel gebruikte methoden voor enteroïde manipulatie hebben echter geen toegang tot het apicale oppervlak van het epitheel (driedimensionaal [3D]) of zijn tijdrovend en resource-intensief (tweedimensionale [2D] monolagen). Deze methoden vereisen vaak extra stappen, zoals micro-injectie, om het model fysiologisch vertaalbaar te maken. Hier beschrijven we een fysiologisch relevant en goedkoop protocol voor het bestuderen van NEC in vitro door enteroïde polariteit om te keren, wat resulteert in het apicale oppervlak naar buiten gericht (apiical-out). Een immunofluorescentiekleuringsprotocol om de integriteit van de enteroïde barrière en junctionele eiwitexpressie na blootstelling aan tumornecrosefactor-alfa (TNF-α) of lipopolysaccharide (LPS) onder normoxische of hypoxische omstandigheden te onderzoeken, wordt ook verstrekt. De levensvatbaarheid van 3D apiical-out enteroïden blootgesteld aan normoxische of hypoxische LPS of TNF-α gedurende 24 uur wordt ook geëvalueerd. Enteroïden blootgesteld aan LPS of TNF-α vertoonden, in combinatie met hypoxie, verstoring van de epitheliale architectuur, een verlies van adherens junction eiwitexpressie en een vermindering van de levensvatbaarheid van cellen. Dit protocol beschrijft een nieuw apicale NEC-in-een-schotelmodel dat een fysiologisch relevant en kosteneffectief platform presenteert om potentiële epitheliale doelen voor NEC-therapieën te identificeren en de premature intestinale respons op therapeutica te bestuderen.

Het gebruik van enteroïden om darmontsteking te modelleren, zelfs binnen de context van necrotiserende enterocolitis, is nu gebruikelijk. De meeste methoden die momenteel worden gebruikt, hebben echter geen toegang tot het apicale oppervlak van enteroïden, waardoor de fysiologische relevantie van verbindingen die bedoeld zijn voor uiteindelijk gebruik als orale therapieën wordt ontkend, of zijn technisch moeilijk en tijdrovend, zoals bij enteroïde-afgeleide monolagen. Om het nut van de huidige in vitro enteroïde...

Dit protocol beschrijft een apicale necrotiserende enterocolitis (NEC)-in-een-schotelmodel met behulp van enteroïden in de dunne darm met omgekeerde polariteit, waardoor toegang tot het apicale oppervlak mogelijk is. We bieden een immunofluorescentiekleuringsprotocol om NEC-gerelateerde epitheliale verstoring te detecteren en een methode om de levensvatbaarheid te bepalen van apicale enteroïden die zijn onderworpen aan het NEC-in-a-dish-protocol.

In vitro Apiical-Out Enteroid Model van Necrotiserende Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

Dit protocol beschrijft het eerste apicale-out in-een-schotelmodel en is een kritische verbetering ten opzichte van basale laterale enteroïde in-een-schotelmodellen bij het vaststellen van in vitro modellering van potentiële therapieën bedoeld voor orale toediening. Deze methode geeft toegang tot het apicale oppervlak van enteroïden. Verbindingen kunnen worden toegevoegd aan celmedia en de verbindingen worden apisch opgenomen zoals ze in vivo zouden zijn.Onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het opzetten van een in vitro systeem van darmontsteking om potentiële orale therapieën te testen, kunnen deze techniek bijzonder nuttig vinden. Weefsel afkomstig van verschillende leeftijden en soorten kan verdere standaardisatie vereisen. Dus patiënten kunnen bij het vaststellen van polariteitsomkeringstijden nodig zijn.Voor het omkeren van de polariteit van 3D-enteroïden aspirateert u media uit elke put van een 24 putplaat van gevestigde 3D-basolaterale enteroïden. Voeg 500 microliter van vijf millimolaire ijskoude, EDTA of PBS toe aan elke put van een 24 putplaat en verstoor voorzichtig mechanisch het keldermembraanextract of de extracellulaire matrixkoepel door vijf tot zes keer op en neer te pipetteren met een P 200-pipet. Breng de inhoud van vier putjes over in een buis van 15 milliliter.Voeg vervolgens acht milliliter ijskoude EDTA slash PBS toe aan de buis. Breng de resterende 20 putten op dezelfde manier over. Incubeer de buizen bij vier graden Celsius gedurende een uur op een roterend platform of shaker bij 330 RPM.Na incubatiecentrifugeer je de buizen en gooi je het supernatant uit elke buis. Combineer en was de pellets met vijf milliliter DMEM F12. Centrifugeer vervolgens de cellensuspensie en verwijder het supernatant voordat u 12 milliliter antibioticumvrij medium aan de buis toevoegt, zodat de celpellets worden geresuspendeerd.Pippet 500 microliter van de enteroïde suspensie in elke put van een 24-well ultra-low bevestigingsplaat. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende twee tot vijf dagen of totdat de enteroïden de polariteit hebben omgekeerd. Breng op de eerste dag de inhoud van vier putten van een 24 putplaat over naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.Herhaal dit voor alle gewenste putten met elke behandeling in een aparte buis. Centrifugeer de buizen en resuspeneer de pellet in 300 microliter van 4% uit aldehydefixatiemiddel bij kamertemperatuur. Was de pellets na 30 minuten met 500 microliter PBS.Voeg 500 microliter van 0,1% Triton X 100 toe aan de buizen. Incubeer de buizen gedurende een uur bij kamertemperatuur. Plaats vervolgens de buizen op een rotator of shaker bij 200 RPM gedurende 15 minuten bij twee tot acht graden Celsius.Voeg na de laatste incubatie 500 microliter 10% NDS toe aan PBS T en incubeer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Bereid tijdens incubatie primaire antilichaamoplossing voor. Voeg de volgende dag 250 tot 500 microliter PBS T toe aan de buizen, afhankelijk van de grootte van de pellet, en plaats ze op de rotator of shaker bij 200 RPM gedurende een uur bij twee tot acht graden Celsius.Voeg 200 microliter van de secundaire antilichaamoplossing toe en incubeer de buisjes bij twee tot acht graden Celsius in het donker. Ga de volgende dag verder met het monteren van gekleurde apicale enteroïden door de buizen te draaien en 100 microliter supernatant te verwijderen. Resuspensie de cellen in de resterende 100 microliter supernatant en breng de celsuspensie over naar 500 microliterbuizen.Centrifugeer de buizen gedurende 20 seconden in een minicentrifuge. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellets in 100 microliter kamertemperatuur verrode nucleïnezuurvlek. Na 20 minuten incubatie centrifugeer je de cellen en resuspensieer je de pellets in 100 microliter PBS.Verwijder na de tweede wasbeurt en centrifugatie 70 microliter van het supernatant en resuspenseer de pellets in het resterende volume PBS. Breng vervolgens de celsuspensie over op een gelabelde afdekslip van 24 bij 60 millimeter. Breng 75 microliter mountant rechtstreeks op het monster aan en verwijder eventuele bubbels met een pipetpunt.Breng na een nacht uitharden in het donker een dun laagje glycerol aan op de afdekslips, monteer vervolgens de dekselglijders op de glazen schuif en druk deze voorzichtig op zijn plaats. Tik om eventuele luchtbellen tussen de afdeksleuf en de schuif te verwijderen. Laat de cover slip twee uur op kamertemperatuur in het donker instellen voordat je de enteroïden met 20 keer vergroting in beeld brengt met een confocale microscoop.Voor enteroïde behandelingen, stel een apicale necrotiserende enterocolitis vast in een schotelmodel gedurende 24 uur zoals beschreven in het tekstmanuscript. Voordat u de test uitvoert, verwijdert u 100 microliter media uit elke put en laat u de resterende 400 microliter over. Voeg 400 microliter cel levensvatbaarheidstestreagens toe aan elk putje.Meng de inhoud krachtig op een platenschudder gedurende vijf minuten bij 200 RPM om cellyse te induceren. Breng vervolgens 200 microliter over op een enkele put van een 96 goed heldere bodemplaat. Herhaal dit voor de resterende 600 microliter en maak vier technische replica's per put.Met behulp van een plaatlezer die in staat is tot luminescentie, registreer waarden bij 0,25 milliseconden integratie en vergelijk de relatieve waarden tussen behandelingen. De representatieve immunofluorescentiekleuring van de controle bevestigde de apicale lokalisatie van kernen naar het lumen en de detectie van schurk aan de buitenrand van het epitheel. Vergeleken met de controle veroorzaakte blootstelling aan lipopolysaccharide, tumornecrose alfa of hypoxie alleen geen openlijke veranderingen in de bruto celmorfologie E-cadherine of schurkenlokalisatie of fluorescerende intensiteit.Behandeling met lipopolysaccharide of tumornecrose alfa in combinatie met hypoxie verstoorde de epitheliale architectuur en toonde een significant verlies van adherence junction en brush border protein expressie onthuld door het verlies van ECA-gehoor en schurkenkleuring. De levensvatbaarheid van de apicale uitcel werd bepaald onder normoxische of hypoxische omstandigheden. Onder normoxische omstandigheden in vergelijking met de controle lipo polysaccharide of tumornecrose had alfa geen significante invloed op de levensvatbaarheid van de cellen van enteroïden.Er werden echter significante verminderingen van de levensvatbaarheid waargenomen bij lipopolysaccharide of tumornecrose alfa in combinatie met hypoxie in vergelijking met hypoxie alleen. Tijdens het opzetten van apicale out-in-a-dish model. Vergeet niet om EDTA in de cel suspensie ijskoud te houden.Dit zal de omkering van de polariteit verbeteren en ervoor zorgen dat alle ECU op de juiste manier vloeibaar wordt gemaakt en verwijderd. Andere downstream-toepassingen zoals QPCR, RNA-seq, western blotting of functionele evaluaties van barrièrepermeabiliteit kunnen verder worden uitgevoerd om de reactie op inflammatoire signalering bij hypoxie te karakteriseren.

in-vitro-apical-out-enteroid-model-of-necrotizing-enterocolitis

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video demonstrates the development of necrotizing enterocolitis disease in a human-derived neonatal enteroid model induced by lipopolysaccharides treatment. This model helps to study intestinal pathophysiology.

Induction of Necrotizing Enterocolitis in Human Epithelial Enteroid Model

Enteroids ontstaan als een nieuwe model in de studie van ziekten bij de mens. Het protocol wordt beschreven hoe een enteroid model van menselijke necrotizing enterocolitis met behulp van lipopolysaccharide (LPS) behandeling van enteroids gegenereerd op basis van neonatale weefsel te simuleren. Verzamelde enteroids tonen ontstekingsreactie verwant aan degenen gezien in menselijke necrotizing enterocolitis.

Een nieuwe menselijke epitheliale Enteroid Model van Necrotiserende Enterocolitis

Necrotiserende enterocolitis (NEC) is de ernstigste gastro-intestinale (GI) ziekte die vaak voorkomt bij premature baby's, vooral baby's met een zeer laag geboortegewicht, met een hoge mortaliteit en onduidelijke pathogenese. De oorzaak van NEC kan verband houden met inflammatoire immuunregulerende systeemafwijkingen. Een NEC-diermodel is een onmisbaar hulpmiddel voor nec-ziekte-immuunonderzoek. NEC-diermodellen gebruiken meestal C57BL / 6J neonatale muizen; BALB/c neonatale muizen worden...

Een neonatale BALB / c muismodel van necrotiserende enterocolitis

Dit protocol beschrijft een methode om een kraswondtest vast te stellen en uit te voeren op tweedimensionale (2D) monolagen afgeleid van driedimensionale (3D) enteroïden geïsoleerd uit niet-menselijke primatenileum.

Effect van hyaluronzuur 35 kDa op een in vitro model van te vroeg geboren darmletsel en genezing met behulp van enteroïde-afgeleide monolagen

Dit protocol beschrijft de oprichting van enteroïden, een driedimensionaal darmmodel, uit foetaal darmweefsel. Immunofluorescente beeldvorming van epitheliale biomarkers werd gebruikt voor modelkarakterisering. Apicale blootstelling van lipopolysacchariden, een bacterieel endotoxine, met behulp van micro-injectietechniek geïnduceerde epitheliale permeabiliteit op een dosisafhankelijke manier gemeten door de lekkage van fluorescerende dextran.

Testen van epitheliale permeabiliteit bij foetale weefsel-afgeleide enteroïden

Het huidige protocol schetst een methode die lucifergeel gebruikt in een apicale enteroïde model om de darmdoorlaatbaarheid te bepalen. Deze methode kan worden gebruikt om paracellulaire permeabiliteit te bepalen bij enteroïden die inflammatoire darmziekten modelleren, zoals necrotiserende enterocolitis.

Intestinale permeabiliteit bepalen met lucifergeel in een apical-out enteroïde model

Escherichia coli veroorzaakt sepsis bij pasgeborenen die de bacteriën rond het moment van geboorte binnenkrijgen. Het proces dat betrokken is bij het vermogen van E. coli om van het enterische kanaal naar de bloedbaan te reizen, is slecht begrepen. Dit in vitro model beoordeelt het vermogen van E. coli stammen om door de darmepitheelcellen te reizen.

Beoordeling van intestinale transcytose van neonatale Escherichia coli bacteriëmie-isolaten

Dit protocol beschrijft een in vitro model van necrotiserende enterocolitis (NEC), dat kan worden gebruikt voor mechanistisch onderzoek naar de pathogenese van ziekten. Het beschikt over een microfluïdische chip bezaaid met darmenteroïden die zijn afgeleid van de menselijke neonatale darm, endotheelcellen en het darmmicrobioom van een pasgeborene met ernstige NEC.

Microfluïdisch model van necrotiserende enterocolitis met menselijke neonatale darmenteroïden en een dysbiotisch microbioom

Dit protocol schetst een neonataal muismodel van necrotiserende enterocolitis (NEC) en daaropvolgende isolatie van lamina propria-immuuncellen uit de neonatale muizendunne darm.

Een neonataal muismodel van necrotiserende enterocolitis en lamina propria-isolatie voor profilering van immuuncellen

Stamceltransplantatie in een In vitro Gesimuleerde ischemie / reperfusie model

Leer een apical-out enteroid model voor necrotiserende enterocolitis met omgekeerde polariteit. Deze methode biedt toegang tot het apicale oppervlak voor het testen van orale therapeutica in vitro.

In vitro Apiical-Out Enteroid Model van Necrotiserende Enterocolitis

Meer video's verkennen