Name: High-Speed Human Temporal Bone Sectioning voor de beoordeling van COVID-19-geassocieerde middenoorpathologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 42 s
Description: Leer een snelle sectiemethode voor het menselijk temporele bot met een microzaag met dubbele diamantbladen. Deze techniek verkort de verwerkingstijd van 9-10 maanden naar 10-14 dagen voor snelle otopathologische analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Mohamed Lehar voor zijn hulp bij dit project. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (T32DC000027, NSA).

Dit protocol is ontwikkeld met goedkeuring van de IRB (IRB00250002) en in overeenstemming met het institutionele beleid voor het gebruik van menselijk weefsel en infectieus materiaal. Elke temporale botdonor gaf schriftelijke toestemming voor het overlijden, of toestemming werd postuum verkregen van de familie van de donor. Zie de tabel met materialen voor meer informatie over alle materialen, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt.
1. Tijdelijke botoogst
<ol><li>Verkrijg de goedkeuring van de lokale institutionele beoordelingsraad (IRB), beoordeel het institutionele beleid voor het gebruik van menselijk en infectieus materiaal en verkrijg toestemming voor weefseldonatie voordat u dit protocol gebruikt.</li>
	<li>Trek de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) aan voordat u werkt met weefsel van COVID-19-positieve temporale botdonoren. Zorg ervoor dat het PBM bestaat uit een N-95 gasmasker en gezichtsscherm (of als alternatief een positieve druk luchtzuiveringssysteem), een toga en twee paar handschoenen. Bekijk technieken voor het correct aantrekken en doseren van PBM's voordat u met dit protocol begint10.</li>
	<li>Oogst tijdelijk botweefsel binnen 12-24 uur na donordood. Als het lichaam niet wordt gekoeld, zorg er dan voor dat de oogst binnen 8 uur na overlijden plaatsvindt.<ol>
<li>Oogst temporale botten tijdens autopsie met behulp van de vier-incisie, blokmethode door osteotome7.<ol>
<li>Verwijder na craniotomie de hersenen en verdeel de hersenzenuwen scherp naar de interne gehoorgang.</li>
			<li>Maak de eerste benige incisie met de osteotome parallel aan en net mediaal aan het plaveiselgedeelte van het temporale bot.</li>
			<li>Voer de tweede benige incisie parallel aan de eerste uit aan de mediale rand van het temporale bot.</li>
			<li>Maak vervolgens de derde incisie 3-4 cm voor en parallel aan de petrousrug.</li>
			<li>Maak de vierde incisie ongeveer evenwijdig aan de derde, 2 cm na de petrousrug. OPMERKING: Zorg ervoor dat alle incisies zich door de schedelbasis uitstrekken.</li>
			<li>Verwijder vervolgens het temporale bot met behulp van scherpe dissectie om de aanhechting van zacht weefsel langs de inferieure rand van het monster te bevrijden. Als balseming moet worden uitgevoerd na de tijdelijke botoogst, bindt u de stronk van de halsslagader af.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Weefselfixatie, ontkalking en secties
<ol><li>Plaats het weefsel onmiddellijk in 200-300 ml 10% gebufferd formaline (formaldehyde) zodat het weefsel volledig wordt ondergedompeld. Laat het weefsel minimaal 72 uur in formaldehyde bij kamertemperatuur en verander de oplossingen dagelijks. Bewaar het weefsel in een luchtdichte container en voer oplossingsveranderingen uit onder een zuurkast terwijl u de juiste PBM's draagt om verspreiding van het virus te voorkomen. OPMERKING: Na de fixatieperiode van 72 uur hoeven de monsters niet langer als besmettelijk te worden beschouwd.</li>
	<li>Gebruik een precisiemicrozaag met dubbele diamantbladen om elk monster in drie "dikke" secties te snijden om een snellere weefselontkalking mogelijk te maken. Zet de dubbele diamantbladen op een afstand van 5 mm, zodat het centrale deel van het temporale bot 5 mm dik is. Zorg ervoor dat de delen van het weefsel aan beide uiteinden 3-5 mm dik zijn.</li>
	<li>Plaats de dikke delen in 200-300 ml van 23% w / w mierenzuur ontkalkende oplossing gedurende 7-10 dagen bij kamertemperatuur, totdat het weefsel zacht genoeg is voor paraffine-inbedding. Verander de oplossingen dagelijks. Controleer op voldoende weefselontkalking door het monster te palperen, dat zacht moet aanvoelen. OPMERKING: Ontkalking kan ook worden geverifieerd door middel van röntgenfoto's.</li>
	<li>Spoel de monsters gedurende 24 uur in stromend leidingwater door ze in een grote beker onder een lopende kraan te plaatsen.</li>
	<li>Droog het weefsel uit in een reeks alcoholen met toenemende concentratie7. Dompel het weefsel onder in 100-200 ml 70% ethanol gedurende 1,5 uur, gevolgd door drie wasbeurten in respectievelijk 95% en 100% ethanol gedurende 1,5 uur. Was vervolgens de tissue 3 x 1,5 uur in Xyleen.</li>
	<li>Integreer de dikke delen in paraffine, met vier behandelingen van elk 45 minuten.</li>
	<li>Gebruik een cryotoom om dunne (10 μm) secties te snijden. Plaats het weefsel zo dat het weefsel in het axiale vlak wordt gesneden. Snijd indien gewenst dikkere (20 μm) secties.</li>
</ol>3. Immunohistochemie en beeldvorming
<ol><li>Als traditionele hematoxyline- en eosinekleuring gewenst is (hier niet beschreven), voer dan vlekken uit voordat u de secties op glasplatenmonteert 7.</li>
	<li>Monteer de secties op positief geladen glazen dia's.</li>
	<li>Bak de glaasjes op een hete plaat op 60 °C gedurende 20 min.</li>
	<li>Plaats de dia's in een houder en dompel ze onder in een commerciële voorbehandelingsoplossing die een organisch oplosmiddel (diethanolamine in dit geval) en ethanol bevat om het weefsel te deparaffiniseren, rehydrateren en ontmaskeren. OPMERKING: Deze stap is nodig om bevredigende resultaten te bereiken met immunohistochemie voor formaline-gefixeerd en paraffine-ingebed weefsel.</li>
	<li>Verwarm de glaasjes in een snelkookpan op hoge druk gedurende 20 min.</li>
	<li>Plaats de dia's in een bevochtigde kamer en blokkeer het weefsel met een commerciële blokkeringsoplossing.</li>
	<li>Onderzoek de weefselsecties met het primaire antilichaam tegen angiotensine-converterend enzym 2 (ACE2; 1:50), transmembraanprotease serine 2 (TMPRSS2, 1:1.000) en het Furin-protease (1:250). OPMERKING: De ACE2-, TMPRSS2- en Furin-antilichamen worden gebruikt omdat wordt aangenomen dat deze eiwitten een rol spelen bij SARS-CoV-2-infectiviteit11,12, en dit protocol probeerde de mogelijke mechanismen te onderzoeken waarmee SARS-CoV-2 het middenoor kan infecteren13.</li>
	<li>Behandelen met HRP-geconjugeerd anti-konijn secundair antilichaam (ACE2, Furin; 1:100 verdunning) of anti-geit (TMPRSS2, 1:100 verdunning) secundair antilichaam.</li>
	<li>Bedek de dia's met 70% hematoxyline in water.</li>
	<li>Verkrijg beelden op een lichtmicroscoop met een gemonteerde digitale camera. Verkrijg afbeeldingen van het middenoorslijmvlies en de buis van Eustachius met respectievelijk 20x en 10x vergroting.</li>
</ol>

<ol><li>Nogueira, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+otorhinolaryngology%3A+Otology%2C+laryngology+and+rhinology%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Otorhinolaryngology%22%5BJournal%5D)">A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology.</a> Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).</li>
<li>Pappas, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otology+through+the+ages%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngology-Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Otology through the ages.</a> Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 114 (2), 173-196 (1996).</li>
<li>Schuknecht, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otopathology%3A+The+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Auris+Nasus+Larynx%22%5BJournal%5D)">Otopathology: The past, present, and future.</a> Auris Nasus Larynx. 23, 43-45 (1996).</li>
<li>Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otopathology+in+the+United+States%3A+History%2C+current+situation%2C+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Otology+%26+Neurotology%22%5BJournal%5D)">Otopathology in the United States: History, current situation, and future perspectives.</a> Otology & Neurotology. 39 (9), 1210-1214 (2018).</li>
<li>Crowe, S. J., Guild, S. R., Polvogt, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+pathology+of+high-tone+deafness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nervous+and+Mental+Disease%22%5BJournal%5D)">Observations on the pathology of high-tone deafness.</a> Journal of Nervous and Mental Disease. 80, 480(1934).</li>
<li>Andresen, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+presbycusis+from+the+first+temporal+bone+laboratory+within+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Otology+%26+Neurotology%22%5BJournal%5D)">Insights into presbycusis from the first temporal bone laboratory within the United States.</a> Otology & Neurotology. 43 (3), 400-408 (2022).</li>
<li>Schuknecht, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchuknecht%2C+H+%22Pathology+of+the+Ear%22">Pathology of the Ear</a>. , Lea and Febiger. Philadelphia, PA. (1993).</li>
<li>Chole, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labs+in+crisis%3A+Protecting+the+science--and+art--of+otopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Otology+%26+Neurotology%22%5BJournal%5D)">Labs in crisis: Protecting the science--and art--of otopathology.</a> Otology & Neurotology. 31 (4), 554-556 (2010).</li>
<li>Nager, G. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNager%2C+GT+%22Pathology+of+the+Ear+and+Temporal+Bone%22">Pathology of the Ear and Temporal Bone</a>. , Williams and Wilkins. Baltimore, MD. (1993).</li>
<li>COVID-19 Personal Protective Equipment (PPE). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html">https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html</a> (2022).</li>
<li>Essalmani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+roles+of+Furin+and+TMPRSS2+in+SARS-CoV-2+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Distinctive roles of Furin and TMPRSS2 in SARS-CoV-2 infectivity.</a> Journal of Virology. 96 (8), 0012822(2022).</li>
<li>Ueha, R., Kondo, K., Kagoya, R., Shichino, S., Yamasoba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACE2%2C+TMPRSS2%2C+and+Furin+expression+in+the+nose+and+olfactory+bulb+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Rhinology%22%5BJournal%5D)">ACE2, TMPRSS2, and Furin expression in the nose and olfactory bulb in mice and humans.</a> Rhinology. 59 (1), 105-109 (2021).</li>
<li>Frazier, K. M., Hooper, J. E., Mostafa, H. H., Stewart, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+virus+isolated+from+the+mastoid+and+middle+ear%3A+Implications+for+COVID-19+precautions+during+ear+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Otolaryngology+-+Head+%26+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 virus isolated from the mastoid and middle ear: Implications for COVID-19 precautions during ear surgery.</a> JAMA Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 146 (10), 964-966 (2020).</li>
<li>Cunningham, C. D., Schulte, B. A., Bianchi, L. M., Weber, P. C., Schmiedt, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave+decalcification+of+human+temporal+bones%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Microwave decalcification of human temporal bones.</a> Laryngoscope. 111 (2), 278-282 (2001).</li>
<li>Stephenson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+location+of+Na%2B%2C+K%2B-ATPase+%CE%B11+subunit+in+the+human+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical location of Na+, K+-ATPase α1 subunit in the human inner ear.</a> Hearing Research. 400, 108113(2021).</li>
<li>McCall, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extralabyrinthine+manifestations+of+DFNA9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Extralabyrinthine manifestations of DFNA9.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 12 (2), 141-149 (2011).</li>
<li>Wu, P. Z., O'Malley, J. T., de Gruttola, V., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+hearing+loss+is+dominated+by+damage+to+inner+ear+sensory+cells%2C+not+the+cellular+battery+that+powers+them%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Age-related hearing loss is dominated by damage to inner ear sensory cells, not the cellular battery that powers them.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (33), 6357-6366 (2020).</li>
<li>Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. H., Ishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+26+immunohistochemistry+in+temporal+bones+with+cochlear+otosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Otology%2C+Rhinology+%26+Laryngology%22%5BJournal%5D)">Connexin 26 immunohistochemistry in temporal bones with cochlear otosclerosis.</a> Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 127 (8), 536-542 (2018).</li>
<li>Lopez, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+techniques+for+the+human+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical techniques for the human inner ear.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (4), 367-387 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Menselijk temporeel botonderzoek is van cruciaal belang voor het bestuderen van binnen- en middenoorpathologie, maar blijft een tijd- en resource-intensieve onderneming. Dit artikel beschrijft een techniek die een diamantmicrozaag gebruikt om dikke temporale botsecties te genereren die snel kunnen worden ontkalkt voordat ze verder worden gesneden, zodat de tijd van weefseloogst tot studie kan worden teruggebracht van 9-10 maanden tot 10-14 dagen. Deze techniek kan de middelen die nodig zijn voor temporele botverwerking v...

Menselijk temporeel botonderzoek biedt een onschatbare bron om de pathologie en pathofysiologie van het binnen- en middenoor te bestuderen. Vóór de 19e eeuw was er weinig bekend over otologische ziekte 1,2,3. Om otologische ziekten beter te begrijpen en "auditieve chirurgie uit de handen van kwakzalvers te redden", ontwikkelde Joseph Toynbee (1815-1866) methoden om histologische delen van het menselijke temporale bot te bestuderen3. Dit werk werd bevorderd door Adam Politzer (1835-1920) in Wenen en anderen in heel Europa gedurende de rest van de 19e eeuw, die temporale botsecties gebruikte om de histopathologie van veel voorkomende aandoeningen van het oor te beschrijven 2,3,4.
Het eerste laboratorium voor menselijke temporale botten in de Verenigde Staten werd in 1927 geopend in het Johns Hopkins Hospital, waar Stacy Guild (1890-1966) methoden ontwikkelde voor temporale botsectie 5,6. De door Guild ontwikkelde methoden bestonden uit een proces van 9-10 maanden met postmortale oogst, fixatie, ontkalking in salpeterzuur, dehydratie in ethanol, celloidine-inbedding, sectie, kleuring en montage. Wijzigingen in deze techniek werden later aangebracht door Harold Schuknecht (1917-1996)7; de basiscomponenten van dit proces blijven echter in wezen ongewijzigd.
De aanzienlijke middelen die nodig zijn om een laboratorium voor temporale botten te onderhouden, hebben een uitdaging gevormd voor tijdelijk botonderzoek en hebben waarschijnlijk bijgedragen aan de afnemende populariteit ervan in de afgelopen 30 jaar 4,8. Een aanzienlijk deel van de temporale botlaboratoriumbronnen moet worden besteed aan het 9-10 maanden durende proces van temporele botvoorbereiding. Een van de meest tijdrovende stappen in de voorbereiding is de ontkalking van het temporale bot, het dichtste bot in het menselijk lichaam. Ontkalking wordt meestal uitgevoerd in salpeterzuur of ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) en duurt weken tot maanden, terwijl de frequente verandering van oplossingenvereist 7,9. Verder kunnen tijdgevoelige studies van het menselijk oor, zoals die met betrekking tot de COVID-19-pandemie, worden belemmerd door dit langzame voorbereidingsproces. Dit artikel beschrijft een techniek voor snelle temporele botsectie die een diamantmicrozaag gebruikt om dikke secties te genereren die snelle ontkalking en weefselanalyse mogelijk maken binnen 10-14 dagen na de tijdelijke botoogst.

<table><tbody><tr><td>Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution)</td><td>Novus Biologicals</td><td>SN0754</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Furin Antibody (1:250 dilution)</td><td>Abcam</td><td>EPR 14674</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-20984</td><td></td></tr><tr><td>BX43 Manual System Microscope</td><td>Olympus Life Science Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade</td><td>Pace Technologies</td><td>WB-007GP</td><td></td></tr><tr><td>Collin Mallet - 8''</td><td>Surgical Mart</td><td>SM1517</td><td></td></tr><tr><td>DS-Fi3 Microscope Camera</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution)</td><td>Dako</td><td>S2003</td><td></td></tr><tr><td>Eaosin Stain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>548-24-3</td><td></td></tr><tr><td>Formalin solution, neutral buffered 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution)</td><td>StatLab</td><td>1214-1 GAL</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin Stain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9627</td><td></td></tr><tr><td>HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution)</td><td>Leica Biosystems</td><td>PV6119</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution)</td><td>Vector Laboratories</td><td>MP-7405</td><td></td></tr><tr><td>Lambotte Osteotome</td><td>Surgical Mart</td><td>SM1553</td><td></td></tr><tr><td>Metallographic PICO 155P Precision Saw</td><td>Pace Technologies</td><td>PICO 155P</td><td>microsaw</td></tr><tr><td>NIS Elements Software Version 4.6</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3683</td><td>paraffin</td></tr><tr><td>Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End</td><td>Walter Products</td><td>1140B15</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome</td><td>New Life Scientific Inc.</td><td>A78900104</td><td>cryotome</td></tr><tr><td>Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>920P-05</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>920P-05</td><td></td></tr></tbody></table>

high-speed human temporal bone sectioning voor de beoordeling van covid-19-geassocieerde middenoorpathologie

High-Speed Human Temporal Bone Sectioning for the Assessment of COVID-19-Associated Middle Ear Pathology

Histopathologische analyse van menselijke temporale botsecties is een fundamentele techniek voor het bestuderen van binnen- en middenoorpathologie. Temporale botsecties worden voorbereid door postmortale temporale botoogst, fixatie, ontkalking, inbedding en kleuring. Vanwege de dichtheid van het temporale bot is ontkalking een tijdrovend en grondstofintensief proces; volledige weefselvoorbereiding kan gemiddeld 9-10 maanden duren. Dit vertraagt otopathologisch onderzoek en belemmert tijdgevoelige studies, zoals die relevant zijn voor de COVID-19-pandemie. Dit artikel beschrijft een techniek voor de snelle voorbereiding en ontkalking van temporale botsecties om de weefselverwerking te versnellen.
Temporale botten werden postmortaal geoogst met behulp van standaardtechnieken en gefixeerd in 10% formaline. Een precisie microzaag met dubbele diamantbladen werd gebruikt om elke sectie in drie dikke secties te snijden. Dikke temporale botsecties werden vervolgens gedurende 7-10 dagen ontkalkt in ontkalkingsoplossing voordat ze werden ingebed in paraffine, gesneden in dunne (10 μm) secties met behulp van een cryotoom en gemonteerd op niet-geladen dia's. Weefselmonsters werden vervolgens gedeparaffineerd en gerehydrateerd voor antilichaamkleuring (ACE2, TMPRSS2, Furin) en in beeld gebracht. Deze techniek verkortte de tijd van oogst tot weefselanalyse van 9-10 maanden tot 10-14 dagen. Snelle temporele botsectie kan de snelheid van otopathologisch onderzoek verhogen en de middelen verminderen die nodig zijn voor weefselvoorbereiding, terwijl ook tijdgevoelige studies zoals die met betrekking tot COVID-19 worden vergemakkelijkt.

Hematoxyline- en eosinekleuring van het middenoorslijmvlies en de buis van Eustachius toonde behoud van het middenoorslijmvlies en submucosaal middenoorweefsel na verwerking (figuur 1). Immunohistochemische beelden toonden expressie van de ACE2-, TMPRSS2- en Furin-eiwitten in het middenoorslijmvlies en de buis van Eustachius (figuur 1). De aanwezigheid van deze eiwitten in het middenoor biedt een mogelijke route waardoor SARS-CoV-2 het respiratoire epitheel in h...

Dit artikel beschrijft een techniek voor snelle menselijke temporale botsectie die een microzaag met dubbele diamantbladen gebruikt om dunne plakjes te genereren voor snelle ontkalking en analyse van temporale botimmunohistochemie.

High-Speed Human Temporal Bone Sectioning voor de beoordeling van COVID-19-geassocieerde middenoorpathologie

Histopathologic analysis of human temporal bone sections is a fundamental technique for studying inner and middle ear pathology. Temporal bone sections ...

Dit protocol verkort de tijd voor temporele botverwerking van 9 tot 10 maanden tot 10 tot 14 dagen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de snelle beoordeling van otopathologie mogelijk maakt, wat in ons geval relevant is voor de beoordeling van COVID-19-geassocieerde middenoorpathologie. Deze techniek kan bijzonder nuttig zijn voor tijdgevoelige studies van het temporale bot.In de toekomst kan het verder worden geoptimaliseerd voor gebruik bij het bestuderen van binnenoorpathologie. Begin de oogst tijdens de autopsie en verdeel de hersenzenuwen scherp naar de interne gehoorgang. Maak de eerste benige incisie met de osteotome parallel aan en net mediaal aan het plaveiselgedeelte van het temporale bot.Voer vervolgens de tweede benige incisie parallel aan de eerste uit aan de mediale rand van het temporale bot. Maak de derde incisie op drie tot vier centimeter voorste en evenwijdig aan de petrousrug. Maak vervolgens de vierde incisie ongeveer evenwijdig aan de derde op twee centimeter na de petrousrug.Gebruik scherpe dissectie om het zachte weefsel dat langs de inferieure rand van het monster is bevestigd te bevrijden en verwijder het temporale bot. Dompel na de oogst het weefsel onmiddellijk onder in 200 tot 300 milliliter van 10% gebufferd formaline. Zet vervolgens een precisiemicrozaag met dubbele diamantbladen op een afstand van vijf millimeter.Voor snelle weefselontkalking snijdt u elk monster in drie secties, zodat het centrale deel van het temporale bot vijf millimeter dik is en die aan beide uiteinden drie tot vijf millimeter dik zijn. Plaats de secties in 200 tot 300 milliliter 0,37-molaire EDTA gedurende zeven tot 10 dagen bij kamertemperatuur om te verzachten. Hematoxyline- en eosinekleuring van het middenoorslijmvlies en de buis van Eustachius toonde aan dat het weefsel bewaard blijft na verwerking met behulp van dit protocol.Immunohistochemische analyses toonden de aanwezigheid aan van ACE2, transmembraanprotease serine en furine-eiwitten in deze weefsels, die een mogelijke wortel vormen voor SARS-CoV2-infectie in het respiratoire epitheel van het middenoor. Het is belangrijk om het temporale botweefsel in de diamantzaag op de juiste manier te positioneren. Alternatieve technieken die met deze methode kunnen worden gecombineerd, zijn immunohistochemie voor verschillende eiwitten, verschillende weefselvlekken en transcriptomica.Deze techniek stelde ons in staat om snel te beoordelen op de aanwezigheid van de eiwitten die betrokken zijn bij SARS-CoV2-infectie in het middenoor tijdens de COVID-19-pandemie.

high-speed-human-temporal-bone-sectioning-for-assessment-covid-19

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een eenvoudige procedure van vibratome snijden het orgaan van Corti, gevolgd door immunohistochemie en confocale microscopie is beschreven. Deze procedure zorgt voor een betere conservering van de fijne cytoarchitecture van de zoogdieren orgaan van Corti, en dus zorgt voor accurate kwantificering van celtypen.

Vibratome Sectioning voor Enhanced Behoud van de Cytoarchitecture van de zoogdieren orgaan van Corti

Er bestaan verschillende methoden voor het introduceren van ototoxische middelen in de slakken van diermodellen. Hier wordt een chirurgisch protocol gepresenteerd voor het toedienen van ototoxische middelen in de ronde venster nis. De procedure is betrouwbaar, creëert gerichte intra-cochleaire laesies en voorkomt mechanische schade aan de microarchitectuur. Onderzoek naar zelfherstel/regeneratie van de cochlea is mogelijk.

De muis Round-window aanpak voor Ototoxische Agent Levering: een snelle en betrouwbare techniek voor het induceren van Cochlear celdegeneratie

We presenteren een methode om de volwassen orgaan van Corti isoleren drie intacte cochleaire windingen (apex, midden en base). We tonen ook een procedure voor immunokleuring met fluorescent gelabelde antilichamen. Samen technieken maken het bestuderen van haarcellen, steuncellen en andere celtypen in de cochlea.

Hele Mount Dissection en Immunofluorescentie van de Adult Mouse Cochlea

We presenteren een protocol om de auditieve bulla, capsule en gehoorbeentjes te isoleren van postnatale muizen voor gehele montage en histologische analyse.

Dissectie van de auditieve Bulla in postnatale muizen: Isolatie van het middenoor botten en histologische analyse

Het doel van dit artikel is voor het beschrijven van de methodologie van uitsluitend Endoscopische dode foetussen middenoor dissectie. Bovendien streven wij naar een uitvoerige gids voor Endoscopische middenoor anatomie.

Middenoor anatomie door Transcanal Endoscopische oor chirurgie te ontdekken: een handleiding dissectie

Het doel van dit protocol is om aan te tonen van een effectieve methode om decellularize en decalcify van muis cochleae voor gebruik als steigers voor weefsel waterbouwkundige toepassingen.

Een Protocol voor Decellularizing muis Cochleae voor binnenoor Tissue Engineering

Om een succesvolle en hoogwaardige ciliaire functionele analyse voor PCD-diagnose te garanderen, is een nauwkeurige en zorgvuldige methode voor respiratoire epitheelbemonstering en -verwerking essentieel. Om pcd-diagnostische service te blijven bieden tijdens de COVID-19-pandemie, is het ciliaire videomicroscopieprotocol bijgewerkt met passende infectiebeheersingsmaatregelen.

Nasale poetsbemonstering en -verwerking met behulp van digitale hoge snelheid ciliaire videomicroscopie - aanpassing aan de COVID-19-pandemie

Dit artikel presenteert een betrouwbare methode voor het extraheren van het menselijk slakkenhuis uit het slaapbeen van het kadaver door middel van een boring terwijl verschillende anatomische oriëntatiepunten worden gevolgd.

Het slakkenhuis extraheren uit een menselijk slaapbeen: een kadaverprotocol

Hierin presenteren we een gedetailleerd protocol voor het isoleren en kweken van primaire cochleaire haarcellen van muizen. Aanvankelijk werd het orgaan van Corti onder een microscoop ontleed uit neonatale (3-5 dagen oud) muizenslakkenhuis. Vervolgens werden cellen enzymatisch verteerd tot een eencellige suspensie en geïdentificeerd met behulp van immunofluorescentie na enkele dagen in kweek.

Isolatie en kweek van primaire cochleaire haarcellen van neonatale muizen

Hier beschrijven we een techniek voor het oogsten van menselijke vestibulaire eindorganen onder fysiologische omstandigheden tijdens labyrinthectomie en hun analyse met behulp van immunokleuring.

Oogst van vestibulaire eindorganen onder fysiologische omstandigheden tijdens labyrinthectomie

Leer een snelle sectiemethode voor het menselijk temporele bot met een microzaag met dubbele diamantbladen. Deze techniek verkort de verwerkingstijd van 9-10 maanden naar 10-14 dagen voor snelle otopathologische analyse.

High-Speed Human Temporal Bone Sectioning voor de beoordeling van COVID-19-geassocieerde middenoorpathologie

Meer video's verkennen