Name: Coherente Anti-Stokes Raman Spectroscopie (CARS) Toepassing voor Imaging Myelinisatie in Brain Slices (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 8 s
Description: Leer CARS-beeldvorming voor myeline in hersenweefsel van Mongoolse gerbils en muizen. Deze lichtmicroscopietechniek combineert immunofluorescentie om neurologische aandoeningen zoals multiple sclerose te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ondersteund door NIH R01 DC 17924, R01 DC 18401 (Klug) en NIH 1R15HD105231-01, T32DC012280 en FRAXA (McCullagh). De CARS-beeldvorming werd uitgevoerd in het Advanced Light Microscopy Core-deel van het NeuroTechnology Center aan de University of Colorado Anschutz Medical Campus, gedeeltelijk ondersteund door NIH P30 NS048154 en NIH P30 DK116073.

Alle experimenten voldeden aan alle toepasselijke wetten, richtlijnen van de National Institutes of Health en werden goedgekeurd door de University of Colorado Anschutz Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Dieren
<ol><li>Gebruik C57BL/6J (stock #000664) muizen (Mus musculus) verkregen van The Jackson Laboratory of Mongoolse gerbils (Meriones unguiculatus) oorspronkelijk verkregen uit Charles River.</li>
</ol>2. Weefselvoorbereiding
<ol><li>Voor transcardiale perfusie, overdosering knaagdiersoorten van belang met pentobarbital (120 mg / kg lichaamsgewicht) en transcardiaal perfuseren met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,76 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4), gevolgd door 4% paraformaldehyde (PFA)24.<ol><li>Open in het bijzonder de buik en de ribbenkast met een schaar en houd de ribbenkast op zijn plaats met Kelly hemostatische tang om het hart bloot te stellen.</li>
		<li>Steek een 23 GA-naald aangesloten op een perfusiepomp in de linker ventrikel en knip snel het rechter atrium met een fijne schaar.</li>
		<li>Dien PBS toe via de perfusiepomp en de naald in het hart gedurende 10 minuten om de hersenen en het lichaam van bloed te zuiveren.</li>
		<li>Schakel de perfusiepomp gedurende 10 minuten over op 4% PFA en controleer op stijfheid van ledematen en staart om een succesvolle perfusie te bevestigen.</li>
	</ol></li>
	<li>Onthoofd de dieren na perfusie en verwijder hun hersenen uit de schedel. Houd de hersenen 's nachts in 4% PFA voordat ze overgaan op PBS. Integreer hersenstamen in 4% agarose (in PBS) en snijd coronaal met behulp van een vibratoom met een dikte van 200 μm.</li>
</ol>3. Vlekken
<ol><li>Vlekvrije zwevende secties voor Nissl, om cellichamen (1:100) te visualiseren, in antilichaammedia (AB media: 0,1 M fosfaatbuffer (PB: 50 mM KH2PO4, 150 mM Na2HPO4), 150 mM NaCl, 3 mM Triton-X, 1% runderserumalbumine (BSA)) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een standaard laboratoriumschudder25.<ol><li>Bescherm secties tegen licht met aluminiumfolie en/of een deksel. Golflengten van 550 nm of lager zijn compatibel met CARS-beeldvorming (figuur 1). OPMERKING: Hoewel we niet verwachten dat Triton-X of andere reagentia een impact hebben op cars beeldvorming van lipiden, kunnen aanvullende controles met specifieke antilichaammedia gerechtvaardigd zijn.</li>
	</ol></li>
	<li>PAUZEPUNT: Bewaar vrij zwevende secties (terwijl ze beschermd zijn tegen licht) in PBS totdat u beeld krijgt. Eenmaal gesneden, beeld hersenen secties binnen 2 weken.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64013/64013fig01.jpg"> Figuur 1: CARS-beeldvorming kan worden gecombineerd met immunofluorescente beeldvorming. De grafieken laten zien dat CARS-beeldvorming plaatsvindt bij 660/640 nm rood signaalspectrum26. Deze golflengte is voldoende ver verwijderd van het groene, blauwe of UV-bereik, waardoor het CARS-signaal kan worden gecombineerd met immunofluorescentie in deze bereiken. In het bijzonder geeft de grafiek ook de excitatie en emissie aan voor Nissl gelabeld met blauwe fluorofoor, die werd gecombineerd met CARS tijdens het verzamelen van representatieve resultaten voor deze publicatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64013/64013fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
4. Beeldvorming
OPMERKING: De CARS-laseropstelling bevat een fiberlaser die de 80 MHz-klok levert, en een OPO-laser (Optical Parametric Oscillator) met een afstembaar bereik van 770-990 nm met de Stokes-straal gefixeerd op 1031 nm, die nodig zijn voor het verzamelen van het CARS-signaal. Er is één diafragma voor beide bundels.
<ol><li>Voordat u monsters naar de microscoop brengt, schakelt u de CARS-laser gedurende ten minste 1 uur in en warmt u de CARS-laser uit en koehler de condensoroptiek en het diafragma van de microscoop voor voorwaartse CARS-beeldvorming. OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang voor de goede werking van CARS-microscopie.<ol><li>Voor ruimtelijke uitlijning van de twee laserstralen (pomp en stokes) heeft u toegang tot de twee interne PSD's (positiegevoelige detectoren) via de CARS-laser-GUI.</li>
		<li>Bereik temporele uitlijning door gebruik te maken van de vertragingsfunctie in de CARS-laser-GUI, die kan helpen de pulsen van de twee lasers (pomp en stokes) te overlappen die verschillende dispersies hebben vanwege hun verschillende golflengten. Daarom worden zowel de temporele als ruimtelijke overlapping van de pomp en stokes-balken gedaan met de gebruikersinvoer via de GUI.</li>
		<li>Pas de externe periscoop (laatste twee spiegels van de opstelling) aan om de ruimtelijk overlappende twee lasers te centreren op de scannende hoofdspiegels van de microscoop.</li>
		<li>Voor de beste forward CARS niet-gedescande detectie, zorg ervoor dat de condensor Koehler-ed is (wat betekent dat de condensor gecentreerd en gericht is op het membraan om een uniforme verlichting te bereiken)</li>
	</ol></li>
	<li>Voor immunofluorescentie confocale beeldvorming en CARS-beeldvorming, monteer de CARS-laser, met zowel voorwaartse als epi CARS niet-gedescande detectoren (NDD's), door een confocale microscoop te integreren die is uitgerust met zichtbare lasers voor fluorescentiebeeldvorming (figuur 2).</li>
	<li>Plaats secties in een kweekschaal met coverslip (voor omgekeerde microscopie), PBS om te voorkomen dat het weefsel uitdroogt en een glasgewicht om weefsel in de buurt van coverslip te houden.</li>
	<li>Neem z-stacks of enkele beelden met een 60X, 1,2 NA infrarood gecorrigeerd waterobjectief, dat dient voor het verzamelen van het CARS-signaal in de epirichting en door een 0,55 NA-condensor in de voorwaartse richting voor het in beeld brengen van hersengebieden zoals de mediale kern van het trapeziumlichaam (MNTB).<ol><li>Maak de CARS-beelden met ongeveer 600 mW pomp/sonde en 300 mW Stokes, met behulp van de CARS laser GUI. Deze laservermogenswaarden worden intern gemeten door het systeem. De vermogens van beide lasers op de monsterlocatie zijn minder dan 25 mW en veilig voor het weefselmonster.</li>
		<li>Overlap de pomp en Stokes balken ruimtelijk en temporeel. Stem de OPO af op 797,2 nm. Dit levert een CARS-golflengte op van 650 nm. Vanwege het hogere energieniveau is de resulterende terugkeer naar de grondtoestand anti-Stokes (blauw verschoven) naar de excitatie.</li>
		<li>Vang het CARS-signaal op in epi- of voorwaartse niet-gedescande detectoren met behulp van bandpassfilters (640-680 nm), gevolgd door sequentiële detectie van het immunofluorescentielabel (in dit geval fluorescerend gelabeld Nissl). OPMERKING: De Nissl neuronale soma marker wordt niet gevangen in het CARS 640-680 nm bandpass filter, waardoor de combinatie van fluorescentie en CARS beeldvorming in de onderstaande afbeeldingen mogelijk is.</li>
		<li>De CARS en fluorescentie delen geen PMT's. Gebruik deze instellingen voor een optimaal lipidensignaal om myelinisatie in het hersengebied selectief in beeld te brengen. LET OP: Bescherm de gebruiker tegen de laserstraal</li>
	</ol></li>
	<li>Sla de afbeeldingen op als .oib-bestanden, die kunnen worden geïmporteerd in een beeldanalyseprogramma voor verdere kwantificering (figuur 3).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64013/64013fig02.jpg"> Figuur 2: CARS-instrumentdiagram met CARS-lasers (rode pijlen) en niet-gedescande (NDD) epi- en voorwaartse detectie die is opgenomen in een confocale laserscanning. In forward NDD verwerven we CARS voor C-H bindingen (donkerrode pijlen) en SHG (tweede harmonische generatioïne) op 515 nm (oranje pijl). In epi NDD verwerven we CARS voor C-H-bindingen (donkerrode pijlen) en 2PE (twee-fotonenemissie) autofluorescentie (lichtblauwe pijl). Achtereenvolgens kunnen fluorescentie confocale beelden worden verkregen (groene pijlen voor zichtbare laser, blauwe pijlen voor confocale detectie). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64013/64013fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64013/64013fig03v2.jpg"> Figuur 3: CARS kunnen myeline (magenta) in hersenweefsel (hersenstam) verlichten en tegelijkertijd Nissl (cyaan) of fluorescerende markers in beeld brengen. De twee panelen tonen representatieve resultaten van een Mongools gerbil (enkele afbeelding M. unguiculatus, Figuur 3A, C, E) en muis (z-stack max projectie M. musculus, Figuur 2B, D, F) hersenen, wat aangeeft dat deze techniek kan worden gebruikt voor verschillende soorten. Figuur 3A,B met Nissl in cyaan, C,D toont het CARS-signaal in magenta, E,F combineert de Nissl- en CARS-signalen met elk paneel voor respectievelijk gerbil of muis. Beide sets afbeeldingen tonen een deel van de mediale kern van het trapeziumlichaam (MNTB) in de hersenstam. Neuronen in de MNTB ontvangen input van zwaar gemyeliniseerde axonen, die eindigen in de kelk van held, een soort gigantische synaps27. Schaalbalk is 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64013/64013fig03largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<ol><li>Cole, K., Curtis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+impedance+of+the+squid+giant+axon+during+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Electric impedance of the squid giant axon during activity.</a> The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).</li>
<li>Cole, K. S., Curtis, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+potential+of+the+squid+giant+axon+during+current+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Membrane potential of the squid giant axon during current flow.</a> Journal of General Physiology. 24 (4), 551-563 (1941).</li>
<li>Alcami, P., El Hady, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+computations%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Axonal computations.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 413(2019).</li>
<li>Neumann, E., Nachmansohn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+excitability-Toward+an+integrating+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Aharon+Katzir+Memorial+Volume%22%5BJournal%5D)">Nerve excitability-Toward an integrating concept.</a> Aharon Katzir Memorial Volume. , 99-166 (1975).</li>
<li>Waxman, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+properties+and+design+principles+of+axons%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Integrative properties and design principles of axons.</a> International Review of Neurobiology. 18, 1-40 (1975).</li>
<li>Fitzhugh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computation+of+impulse+initiation+and+saltatory+conduction+in+a+myelinated+nerve+fiber%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Computation of impulse initiation and saltatory conduction in a myelinated nerve fiber.</a> Biophysical Journal. 2 (1), 11-21 (1962).</li>
<li>Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acquisition+of+myelin%3A+a+success+story%5BTitle%5D)+AND+%22Novartis+Foundation+Symposium%22%5BJournal%5D)">The acquisition of myelin: a success story.</a> Novartis Foundation Symposium. 276, 275-281 (2006).</li>
<li>Salzer, J. L., Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Myelination.</a> Current Biology. 26 (20), 971-975 (2016).</li>
<li>Boullerne, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+of+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">The history of myelin.</a> Experimental Neurology. 283, 431-445 (2016).</li>
<li>Kuhn, S., Gritti, L., Crooks, D., Dombrowski, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocytes+in+development%2C+myelin+generation+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocytes in development, myelin generation and beyond.</a> Cells. 8 (11), 1424(2019).</li>
<li>Saab, A. S., Nave, K. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+dynamics%3A+protecting+and+shaping+neuronal+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Myelin dynamics: protecting and shaping neuronal functions.</a> Current Opinion in Neurobiology. 47, 104-112 (2017).</li>
<li>Chomiak, T., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+optimal+value+of+the+g-Ratio+for+myelinated+fibers+in+the+rat+CNS%3F+A+theoretical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">What is the optimal value of the g-Ratio for myelinated fibers in the rat CNS? A theoretical approach.</a> PLOS ONE. 4 (11), 7754(2009).</li>
<li>Ford, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+of+Ranvier+node+and+internode+properties+in+myelinated+axons+to+adjust+action+potential+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tuning of Ranvier node and internode properties in myelinated axons to adjust action potential timing.</a> Nature Communications. 6, 8073(2015).</li>
<li>Stange-Marten, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Input+timing+for+spatial+processing+is+precisely+tuned+via+constant+synaptic+delays+and+myelination+patterns+in+the+auditory+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Input timing for spatial processing is precisely tuned via constant synaptic delays and myelination patterns in the auditory brainstem.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), 4851-4858 (2017).</li>
<li>Bu, J., Banki, A., Wu, Q., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+NG2%2B+glial+cell+proliferation+and+oligodendrocyte+generation+in+the+hypomyelinating+mutant+shiverer%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Increased NG2+ glial cell proliferation and oligodendrocyte generation in the hypomyelinating mutant shiverer.</a> Glia. 48 (1), 51-63 (2004).</li>
<li>Pacey, L. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+myelination+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Delayed myelination in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Human Molecular Genetics. 22 (19), 3920-3930 (2013).</li>
<li>Green, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clemastine+fumarate+as+a+remyelinating+therapy+for+multiple+sclerosis+%28ReBUILD%29%3A+a+randomised%2C+controlled%2C+double-blind%2C+crossover+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Clemastine fumarate as a remyelinating therapy for multiple sclerosis (ReBUILD): a randomised, controlled, double-blind, crossover trial.</a> Lancet. 390 (10111), London, England. 2481-2489 (2017).</li>
<li>Jeon, S. J., Ryu, J. H., Bahn, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+translational+control+of+fragile+X+mental+retardation+protein+on+myelin+proteins+in+neuropsychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Altered translational control of fragile X mental retardation protein on myelin proteins in neuropsychiatric disorders.</a> Biomolecules & Therapeutics. 25 (3), 231-238 (2017).</li>
<li>Barak, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+deletion+of+Gtf2i%2C+associated+with+Williams+syndrome%2C+causes+behavioral+and+myelin+alterations+rescuable+by+a+remyelinating+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal deletion of Gtf2i, associated with Williams syndrome, causes behavioral and myelin alterations rescuable by a remyelinating drug.</a> Nature Neuroscience. 22 (5), 700-708 (2019).</li>
<li>Phan, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myelin-related+transcriptomic+profile+is+shared+by+Pitt-Hopkins+syndrome+models+and+human+autism+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A myelin-related transcriptomic profile is shared by Pitt-Hopkins syndrome models and human autism spectrum disorder.</a> Nature Neuroscience. 23 (3), 375-385 (2020).</li>
<li>Lucas, A., Poleg, S., Klug, A., McCullagh, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+deficits+in+the+auditory+brainstem+of+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelination deficits in the auditory brainstem of a mouse model of fragile X syndrome.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 1536(2021).</li>
<li>Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-stokes+raman+scattering+imaging+of+axonal+myelin+in+live+spinal+ttissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-stokes raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal ttissues.</a> Biophysical Journal. 89 (1), 581-591 (2005).</li>
<li>Kim, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+coherent+anti-stokes+raman+spectroscopy+images+intact+atheromatous+lesions+and+concomitantly+identifies+distinct+chemical+profiles+of+atherosclerotic+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Multiplex coherent anti-stokes raman spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids.</a> Circulation Research. 106 (8), 1332-1341 (2010).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Tu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free-floating+Immunostaining+of+Mouse+Brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Free-floating Immunostaining of Mouse Brains.</a> Journal of Visualized Experiments. (176), e62876(2021).</li>
<li>Fluorescence SpectraViewer. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer">https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer</a> (2022).</li>
<li>Held, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Die+centrale+geh%C3%B6rleitung%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Anat+Physiol+Anat+Abt%22%5BJournal%5D)">Die centrale gehörleitung.</a> Arch Anat Physiol Anat Abt. 17, 201-248 (1893).</li>
<li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).</li>
<li>Gruchot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+for+remyelination+failure+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The molecular basis for remyelination failure in multiple sclerosis.</a> Cells. 8 (8), 825(2019).</li>
<li>Rivera, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+pathway+in+the+age-related+decline+of+oligodendrocyte+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor pathway in the age-related decline of oligodendrocyte regeneration.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 838007(2022).</li>
<li>Kútna, V., O'Leary, V. B., Hoschl, C., Ovsepian, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+demyelination+and+neurodegeneration+associated+with+mTORC1+hyperactivity+may+contribute+to+the+developmental+onset+of+autism-like+neurobehavioral+phenotype+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Autism+Research%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+for+Autism+Research%22%5BJournal%5D)">Cerebellar demyelination and neurodegeneration associated with mTORC1 hyperactivity may contribute to the developmental onset of autism-like neurobehavioral phenotype in a rat model.</a> Autism Research: Official Journal of the International Society for Autism Research. 15 (5), 791-805 (2022).</li>
<li>Ozsvár, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+lipid+debris+accumulation+caused+by+cuprizone+induced+myelin+degradation+in+different+CNS+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of lipid debris accumulation caused by cuprizone induced myelin degradation in different CNS areas.</a> Brain Research Bulletin. 137, 277-284 (2018).</li>
<li>Prineas, J. W., Graham, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+capping+of+surface+immunoglobulin+G+on+macrophages+engaged+in+myelin+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: capping of surface immunoglobulin G on macrophages engaged in myelin breakdown.</a> Annals of Neurology. 10 (2), 149-158 (1981).</li>
<li>Bégin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+method+for+the+segmentation+and+morphometry+of+nerve+fibers+in+large-scale+CARS+images+of+spinal+cord+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Automated method for the segmentation and morphometry of nerve fibers in large-scale CARS images of spinal cord tissue.</a> Biomedical Optics Express. 5 (12), 4145-4161 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Een groeiende hoeveelheid literatuur benadrukt de rol van myeline in de hersenfunctie 13,16,21,28. Bovendien weten we dat myelinisatiedikte en myelinisatiepatroon kunnen veranderen in verschillende neurologische aandoeningen zoals multiple sclerose (beoordeeld in29), veroudering (beoordeeld in30), autisme20,31<su...

Actiepotentialen zijn de basiseenheid van informatie in de hersenen en actiepotentiale voortplanting door axonen vormt een pijler van informatieverwerking 1,2,3. Neuronen ontvangen meestal afferente inputs van meerdere andere neuronen en integreren deze inputs binnen een bepaald smal tijdvenster 4,5. Daarom hebben de mechanismen van actiepotentiaalvoortplanting in axonen een aanzienlijke hoeveelheid aandacht gekregen van onderzoekers.
Bij vermeerdering door een axon wordt een actiepotentiaal herhaaldelijk langs het axon geregenereerd om een betrouwbare voortplanting te garanderen6. In de meeste neuronen van kaakgewervelde dieren (gnathostomen) zijn axonen omgeven door een omhulsel van myeline, een lipiderijke stof die wordt geproduceerd door nabijgelegen oligodendrocyten of Schwann-cellen, die soorten gliacellen zijn (besproken in 7,8). Deze myelineschede isoleert het axon elektrisch, vermindert de capaciteit en maakt een efficiënte, snelle en met een lager energieverbruik mogelijk. Myeline bedekt het axon niet uniform, maar het omhult het axon in segmenten met korte openingen ertussen, de knooppunten van Ranvier genoemd (besproken in 9,10). Zowel de myelinisatiedikte, die het niveau van elektrische isolatie van een axon regelt, als de afstand van de knooppunten van Ranvier, die de frequentie regelen waarmee actiepotentialen langs een axon worden geregenereerd, beïnvloeden de snelheid van de voortplanting van actiepotentialen (besproken in11).
Er is een grote hoeveelheid literatuur die suggereert dat de dikte van de myelinisatie de snelheid van actiepotentiaalvoortplanting in axonen beïnvloedt 12,13,14. Bovendien kunnen veranderingen in axonmyelinisatie resulteren in een aantal CZS-tekorten 15,16,17,18,19,20,21. Het is daarom niet verwonderlijk dat de focus van veel onderzoeksinspanningen ligt op het meten en karakteriseren van axonmyelinisatie. Metingen van myelinedikte zijn meestal gedaan met elektronenmicroscopie, een techniek die een aanzienlijke hoeveelheid weefselvoorbereiding vereist en een uitdaging is om te gebruiken in combinatie met immunohistochemie. Er is echter ook een snellere en eenvoudigere techniek om axonmyelinisatie te meten die is gebaseerd op Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS). Een CARS-laser kan worden afgestemd op verschillende frequenties en wanneer afgestemd op frequenties die geschikt zijn om lipiden te exciteren, kan myeline worden afgebeeld zonder dat er extra labels nodig zijn22. De lipide beeldvorming kan worden gecombineerd met standaard immunohistochemie, zodat lipiden samen met verschillende fluorescerende kanalen kunnen worden afgebeeld23. Beeldvorming van myelinisatie met CARS is aanzienlijk sneller dan elektronenmicroscopie en heeft een resolutie die, zij het lager dan EM, voldoende is om zelfs kleine verschillen in myelinisatie in hetzelfde type axonen te detecteren.

<table><tbody><tr><td>Verdoving:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL wegwerpspuit met naald 27 GA x 0,5"</td><td>Exel int</td><td>260040</td><td></td></tr><tr><td>Fatal +</td><td>Vortech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chirurgie:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spring Scissors - 8mm snijrand</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Standaard pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Perfusie:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>Fisher Chemical</td><td>SF994 (CS)</td><td></td></tr><tr><td>Fijne schaar - scherp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14063-11</td><td></td></tr><tr><td>Kelly hemostaat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13019-14</td><td></td></tr><tr><td>Millipore H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naaldpunt, 23 GA x 1"</td><td>BD precision glide</td><td>305193</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat monobasale</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>pomp met variabele stroom of equivalent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Fisher Chemical</td><td>s271-1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat dibasisch</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>Dissectie:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL fles met 4% PFA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bochem Chemical Spoon 180mm</td><td>Bochem</td><td>230331000</td><td></td></tr><tr><td>Fijne schaar - scherp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14063-11</td><td></td></tr><tr><td>Noyes Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15011-12</td><td></td></tr><tr><td>Een paar fijne (Graefe) pincetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Ondiepe glazen of plastic lade, ongeveer 10" x 10"</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standaard pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische schaar - bot</td><td>Fine Science Tools</td><td>14000-20</td><td></td></tr><tr><td>Snijden:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar, plant</td><td>RPI</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000s</td><td></td></tr><tr><td>welplate</td><td>Alkali Sci.</td><td>TPN1048-NT</td><td></td></tr><tr><td>Kleuren:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AB Media:</td><td></td><td></td><td>1n 1.000 mL van Millipore H2O</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferd (PB):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat Monobasale</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Fosfaat Dibasisch</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Bovine serum albumine)</td><td>Sigma life science</td><td>A2153-100g</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Fisher Chemical</td><td>s271-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>x100-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Nissl 435/455</td><td>Invitrogen</td><td>N21479</td><td></td></tr><tr><td>CARS:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>APE&nbsp;picoemerald laser</td><td>Angewandte Physik &amp; Elektronik&nbsp;GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bandpass filter (420-520 nm)</td><td>Chroma Technology</td><td>HQ470/100m-2P</td><td></td></tr><tr><td>bandpass filter (500-530 nm)</td><td>Chroma Technology</td><td>HQ515/30m-2P</td><td></td></tr><tr><td>bandpass filters (640-680 nm)</td><td>Chroma Technology</td><td>HQ660/40m-2P</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscoop</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Cut Transfer pipet</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>dichroic longpass 565 nm</td><td>Chroma Technology</td><td>565dcxr</td><td></td></tr><tr><td>dichroic longpass 585 nm</td><td>Chroma Technology</td><td>585dcxr</td><td></td></tr><tr><td>dichroic shortpass 750 nm</td><td>Chroma Technology</td><td>T750spxrxt</td><td></td></tr><tr><td>glasbodem kweekschaal</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>glasgewicht (10 mm x 10 mm boro staaf)</td><td>Allen Scientific Glass Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>multifoton shortpass emissie filter 680 nm</td><td>Chroma Technology</td><td>ET680sp-2p8</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

coherente anti-stokes raman spectroscopie (cars) toepassing voor imaging myelinisatie in brain slices

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Coherente anti-Stokes Raman spectroscopie (CARS) is een techniek die klassiek wordt gebruikt door chemici en natuurkundigen om een coherent signaal van kenmerkende trillingen van moleculen te produceren. Deze vibrationele handtekeningen zijn echter ook kenmerkend voor moleculen in anatomisch weefsel zoals de hersenen, waardoor het steeds nuttiger en toepasbaarder wordt voor neurowetenschappelijke toepassingen. CARS kan bijvoorbeeld lipiden meten door specifiek opwindende chemische bindingen binnen deze moleculen, waardoor verschillende aspecten van weefsel kunnen worden gekwantificeerd, zoals myeline die betrokken is bij neurotransmissie. Bovendien kan CARS, in vergelijking met andere technieken die doorgaans worden gebruikt om myeline te kwantificeren, ook worden ingesteld om compatibel te zijn met immunofluorescentietechnieken, waardoor co-labeling met andere markers zoals natriumkanalen of andere componenten van synaptische transmissie mogelijk is. Myelinisatieveranderingen zijn een inherent belangrijk mechanisme bij het demyeliniseren van ziekten zoals multiple sclerose of andere neurologische aandoeningen zoals het Fragiele X-syndroom of autismespectrumstoornissen is een opkomend onderzoeksgebied. Kortom, CARS kan op innovatieve manieren worden gebruikt om prangende vragen in de neurowetenschappen te beantwoorden en bewijs te leveren voor onderliggende mechanismen die verband houden met veel verschillende neurologische aandoeningen.

Een van de grootste voordelen van CARS-microscopie ten opzichte van andere technieken is de compatibiliteit met fluorescerende beeldvorming23. Figuur 1 toont de CARS-spectra in vergelijking met Nissl gelabeld met immunofluorescente marker die weinig /geen overlap in spectra vertoont. Figuur 2 illustreert de laseropstelling voor CARS in combinatie met confocale microscopie. Figuur 3 toont twee representatieve ...

Het visualiseren van myelinisatie is een belangrijk doel voor veel onderzoekers die het zenuwstelsel bestuderen. CARS is een techniek die compatibel is met immunofluorescentie die lipiden in weefsel zoals de hersenen die gespecialiseerde structuren zoals myeline verlichten, native in beeld kan brengen.

Coherente Anti-Stokes Raman Spectroscopie (CARS) Toepassing voor Imaging Myelinisatie in Brain Slices

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...

Deze techniek kan myeline in hersenweefselsecties in beeld brengen. myelinisatie speelt een belangrijke rol bij de geleiding van actiepotentialen en het begrijpen van myeline zal ons helpen de hersenfunctie te begrijpen. Het grote voordeel van de CARS-techniek ten opzichte van bijvoorbeeld elektronenmicroscopie is dat CARS een lichtmicroscopietechniek is en gemakkelijk kan worden gecombineerd met andere fluorescentiebeelden, zoals gebruikt in de immunohistochemie.Verschillende medische aandoeningen zijn te wijten aan veranderingen in myelinisatie, bijvoorbeeld multiple sclerose, veroudering en autisme. Het begrijpen van deze veranderingen zal ons helpen de onderliggende medische aandoeningen te begrijpen. In dit geval is de CARS-laser afgestemd op beeldlipiden of, specifiek, CH2-bindingen.In de hersenen is myeline de grootste bron van lipiden. Dit is dus een techniek om myeline in hersenweefsel in beeld te brengen. Het moet mogelijk zijn om dezelfde methode te gebruiken voor andere soorten weefsel wanneer beeldvorming van lipiden van belang is.Het afstemmen en uitlijnen van de CARS-laser vereist aanzienlijke expertise en kan het beste worden uitgevoerd door een laser- of lichtmicro

coherent-anti-stokes-raman-spectroscopy-cars-application-for-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een combinatie van drie enkele golflengte korte gepulste lasers wordt gebruikt om coherent anti-Stokes Raman scattering (auto's) en dubbel-resonante CARS (DR-CARS) te genereren. Het verschil tussen deze signalen zorgt voor een verbeterde gevoeligheid voor anders moeilijk te coherent Raman signalen te detecteren, waardoor beeldvorming van zwakke Raman scatterers.

Differentiële beeldvorming van biologische structuren met dubbel-resonante Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS)

Source: Espinoza, R., et al. Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis. J. Vis. Exp. (2022). The video demonstrates two-color stimulated Raman scattering (SRS) imaging of mouse brain tissue sections. Two synchronized laser beams are directed onto the tissue section to excite molecular vibrations, resulting in a relative intensity change in the beams. Lipids and proteins in the tissue are detected using distinct frequency pairs of the laser...

Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain Tissue

Source: McCullagh, E. A., et al. Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices. J. Vis. Exp. (2022)The video demonstrates fluorescence and Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) imaging to visualize neuronal architecture in rodent brain tissue. Nissl staining labels cell bodies by binding to ribosomal RNA, while CARS imaging targets lipid-rich myelin through laser-induced signals. Overlaying the fluorescence and CARS images provides a...

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy to Visualize Myelinated Neurons in Mouse Brain Tissue

Coherente anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopie gebaseerd op inherente trilling van molecuul obligaties maakt label-free chemisch selectieve live cell imaging. Dit werk toont de uitvoering van een aanvullende microscopietechniek op een standaard multifoton laser scanning microscoop gebaseerd op een femtoseconde Ti: saffier laser en een OPO laser.

Implementatie van een Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System op een Ti: Sapphire en OPO laser gebaseerde Standard laser scanning microscoop

Hier presenteren we een methode ter voorbereiding organotypic segment culturen van muis cerebellum en myelineschede kleuring door immunohistochemistry geschikt voor onderzoek naar mechanismen van myelinisering en remyelination in het centrale zenuwstelsel.

Voorbereiding en immunokleuring van Myelinating Organotypic cerebellaire segment culturen

Gestimuleerde Raman scattering (SRS) microscopie maakt selectieve, labelvrije beeldvorming van specifieke chemische moieties mogelijk en het is effectief gebruikt om lipidemoleculen in vivo in beeld te brengen. Hier geven we een korte inleiding tot het principe van SRS-microscopie en beschrijven we methoden voor het gebruik ervan bij de opslag van beeldvormende lipiden in Caenorhabditis elegans.

Labelvrije beeldvorming van lipideopslagdynamiek bij Caenorhabditis elegans met behulp van gestimuleerde Raman-verstrooiingscopie

Gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie (SRS) is een krachtige, niet-destructieve en labelvrije beeldvormingstechniek. Een opkomende toepassing is gestimuleerde Raman-histologie, waarbij tweekleurige SRS-beeldvorming bij de eiwit- en lipide Raman-overgangen wordt gebruikt om pseudo-hematoxyline- en eosinebeelden te genereren. Hier demonstreren we een protocol voor real-time, tweekleurige SRS-beeldvorming voor weefseldiagnose.

Real-time, tweekleurige gestimuleerde Raman-verstrooiingsbeeldvorming van muizenhersenen voor weefseldiagnose

Dit artikel vergelijkt direct de resolutie, gevoeligheid en beeldcontrasten van gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) en coherente anti-Stokes Raman-verstrooiing (CARS) geïntegreerd in hetzelfde microscoopplatform. De resultaten laten zien dat CARS een betere ruimtelijke resolutie heeft, SRS betere contrasten en spectrale resolutie geeft, en beide methoden hebben een vergelijkbare gevoeligheid.

Directe vergelijking van hyperspectrale gestimuleerde Raman-verstrooiing en coherente anti-stokes Raman-verstrooiingsmicroscopie voor chemische beeldvorming

We presenteren een protocol om chemische beelden te verkrijgen met breedband gestimuleerde Raman scattering (SRS) microscopie. Gebaseerd op een SRS-microscoop die werkt met differentiële meerkanaals-lock-in detectie, beschrijft het protocol de monstervoorbereiding, aanpassing van het SRS-apparaat en chemometrie om verschillende bestanddelen van chemisch heterogene monsters te ontwarren.

Multiplex chemische beeldvorming op basis van breedband gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie

Door gebruik te maken van een multimodaal platform dat labelvrije optische beeldvormingsmodaliteiten combineert, hebben we een protocol ontwikkeld voor het visualiseren en kwantificeren van cellulaire dynamiek en metabolisme. Door middel van beeldvorming via multifotonfluorescentie, tweede harmonische generatie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie kunnen we een holistisch overzicht van de cellulaire en moleculaire omgeving genereren.

Multimodaal optisch beeldvormingsplatform voor het bestuderen van cellulair metabolisme

Leer CARS-beeldvorming voor myeline in hersenweefsel van Mongoolse gerbils en muizen. Deze lichtmicroscopietechniek combineert immunofluorescentie om neurologische aandoeningen zoals multiple sclerose te bestuderen.

Coherente Anti-Stokes Raman Spectroscopie (CARS) Toepassing voor Imaging Myelinisatie in Brain Slices

Meer video's verkennen