Gebruik van dual optische pincet en microfluïdica voor single-molecule studies

De bevestiging van poorten om te paren aan spuiten met slangen is van cruciaal belang omdat, wanneer het goed wordt gedaan, er geen lekken zijn, er geen bellen in de stroomcel zijn en experimenten herhaaldelijk kunnen worden gedaan met dezelfde stroomcel gedurende een periode van een jaar met zorgvuldig gebruik. Hier worden twee eenvoudige methoden gepresenteerd om de connectoren aan stroomcellen te bevestigen. Deze zijn eenvoudig, ze zijn reproduceerbaar en stellen de onderzoeker in staat om de stroomcel gemakkelijk aan te passen aan hun behoeften zonder al te veel moeite.

Het gebruik van deze flowcellen werd gedaan met experimenten met één molecuul in het achterhoofd. In het bijzonder wat we visuele biochemie noemen, maar ze kunnen worden gebruikt in elke studie waar microfluïdica vereist is en in situaties waarin lamina-vloeistofstroom moet worden gebruikt. Dus, om fouten te voorkomen, in plaats van waardevolle flowcellen te gebruiken om de technieken vast te stellen, zou ik aanraden om eerst op een glazen dia of een cover slip te oefenen.

Dit zal iemand in staat stellen om een gevoel te krijgen voor het glas of de PDMS-materialen om te weten hoe ze moeten worden behandeld en hoeveel kracht moet worden uitgeoefend bij het inbrengen van buizen of het verlijmen van de connectoren. Dit vereist het opofferen van enkele connectoren, maar ze zijn veel goedkoper dan de stroomcellen. Begin met het plaatsen van de stroomcel op een schoon vlak oppervlak.

Houd de PTFE-buis drie millimeter van het vrije uiteinde met een tang en duw de buis in de poort. Herhaal deze procedure voor elk van de resterende poorten. Sluit de inlaatpoorten aan op de spuitpomp en de uitlaat op een afvalfles.

Vul elke glazen spuit met een milliliter spectrofotometrische methanol van kwaliteit en bevestig ze aan een schakelklep. Zorg ervoor dat de uitlaat naar afval is gericht en spoel elke lijn met 50 microliter methanol. Schakel de uitlaatpositie naar de stroomcel en pomp 800 microliter methanol door de stroomcel met een stroomsnelheid van 100 microliter per uur om de oppervlakken nat te maken en bellen te elimineren.

Herhaal dit proces de volgende dag met behulp van 800 microliter ultrapuur water. De flowcel is nu klaar voor gebruik. Als u buisconnectoren voor persfitting wilt gebruiken, verwijdert u de plakband voorzichtig van één kant van de connector en plaatst u deze over het gat in de microscoopglaas.

Druk een paar seconden naar beneden. Herhaal het proces voor de resterende connectoren. Plaats de flowcel vervolgens op een schoon vlak oppervlak.

Houd de PTFE-buis drie millimeter van het vrije uiteinde en duw de buis in het gat in de poort. Herhaal deze procedure voor elk van de resterende poorten. Bevestig slangen van de inlaten aan de schakelkleppen.

Plaats het hulpstuk op een schoon, vlak oppervlak of op een speciaal gebouwd spruitstuk om de stroomcel en connectoren op hun plaats te houden terwijl de verlijming plaatsvindt. Plaats de stroomcel op het verzonken gedeelte van het spruitstuk en plaats vervolgens een kleine hoeveelheid glaslijm op de bodem van de assemblage en plaats de afdichting. Plaats de nanopoort boven een van de ingangsgaten op de microscoopglaasjes.

Duw zachtjes naar beneden en houd op zijn plaats zonder zijdelingse beweging. Herhaal het proces voor de resterende poorten. Laat drogen of klem op zijn plaats in het spruitstuk.

Verwijder de stroomcel voorzichtig uit het spruitstuk en zorg ervoor dat de assemblages goed zijn uitgelijnd met de ingangspoorten in de stroomcel. Plaats een flowcel op het microscooppodium en bevestig de slang met behulp van de vingerdichte connectoren. Vul elke glazen spuit met een milliliter spectrofotometrische methanol.

Bevestig elke spuit aan een schakelklep. Zorg ervoor dat de uitlaat naar afval is gericht en spoel elke lijn met 50 microliter methanol. Schakel de uitlaatpositie naar de stroomcel en pomp 800 microliter methanol door de stroomcel met een debiet van 100 microliter per uur.

Herhaal dit proces de volgende dag met behulp van 800 microliter ultrapuur water. Meting van het uitgangsvermogen wordt hier weergegeven. Het uitgangsvermogen van de laser wordt gemeten voordat de laserkop in de optische lay-out wordt geïnstalleerd.

Zodra de valuitlijning is voltooid, wordt het straalvermogen gemeten na het doel van 100 x voor elke val. De beelden tonen de stabiele optische vansluiting van één micrometer fluorescerende kralen. Hier is F een vaste val en M een mobiele valstrik.

Met de mobiele val in de scanmodus die door een kleine of grote cirkel beweegt bij 30 hertz. De vloeistofstroom in de stromingscel is laminair. Het schema toont de stroomcel van bovenaf om aan te tonen dat de interkanaaldiffusie de belangrijkste bron is van vermenging tussen de aangrenzende vloeistofstromen.

Blauwe pijlen geven de stroomrichting aan en de afzonderlijke stromen zijn gekleurd, wit, lichtgrijs en wit. De verbredingsgebieden van transversale diffusie tussen kanalen worden rood aangegeven. De inzet toont een fluorescentiebeeld van de aangrenzende vloeistofstromen bij 10 keer vergroting met fluorescerende gelabelde DNA-kraalcomplexen in de onderste stroom en buffers alleen in de bovenste stroom.

De witte vlekken in de bovenste stroom zijn geschoten ruis van de CCD-camera. Het stromingsprofiel en de laminaire stromingscellen zijn parabolisch. De stroomcel wordt vanaf de zijkant bekeken en de richting van de stroom wordt boven elke cel aangegeven.

Lineaire kraalsnelheid wordt beïnvloed door pompsnelheid en sucroseconcentratie. De tegengestelde kracht op een kraal wordt beïnvloed door de viscositeit van de oplossing. De diameter van de kraal beïnvloedt de kracht op kralen onder stroming.

Wanneer u deze procedure probeert, moet u ervoor zorgen dat het gebied waarin u werkt schoon is en dat u de glasoppervlakken hebt gereinigd met spectrometrische methanol of aceton. In dit stadium zou u een stroomcel moeten hebben die naar uw spuitpomp wordt gebracht en u bent nu klaar om uw oplossingen te introduceren en optische pincetexperimenten te starten. Het gebruik van flowcellen, die gedurende langere tijd kunnen worden gebruikt, heeft onderzoekers in staat gesteld om een verscheidenheid aan reacties van één molecuul te onderzoeken waarbij beide krachten worden gemeten, reacties worden gevisualiseerd door fluorescentie of een combinatie van beide.