Microtransplantatie van synaptische membranen om menselijke synaptische receptoren voor functionele studies te reactiveren

Neurodegeneratieve en psychische stoornissen zijn het gevolg van veranderingen in synaptische communicatie. Multifactoriële gebeurtenissen veranderen synaptische receptoren op manieren die we niet volledig begrijpen. Microtransplantatie van synaptische membranen geeft inzicht in deze veranderingen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om de activiteit van inheemse hersenreceptoren die in het menselijk brein werken te registreren en daarom de ziekten te vertegenwoordigen die we bestuderen. Synaptische receptoren zijn belangrijke doelen voor medicijnen die de elektrische activiteit van de hersenen reguleren, maar als je begrijpt hoe deze receptoren veranderen, kunnen betere therapieën worden ontwikkeld die hun functionaliteit herstellen. Deze methode is met succes toegepast op verschillende soorten, van insecten, vissen, zoogdieren, maar kan ook worden toegepast op membraanreceptoren buiten de hersenen, bijvoorbeeld spieren en tumoren.

De mogelijkheden zijn breed. Het trimmen van injectienaalden is lastig. Te klein kan eiwitinjectie voorkomen en twee grote kunnen de cel doden.

Het helpt bij het gebruik van een consistente meting, zoals de rand van een scheermesje. Begin met het drie keer soniceren van de geselecteerde monsters die zijn bereid uit het menselijke hersengebied van belang in een bad met drijvend nat ijs. Gebruik elke keer cycli van vijf seconden en wacht een minuut op nat ijs tussen de cycli door.

Plaats een microliter van het monster op de thermoplast en maak indien nodig een inkeping op het oppervlak voordat het monster wordt geplaatst om beweging van het monster te voorkomen. Gebruik de knoppen van de manipulator die de nanoinjector vasthoudt om de naald te positioneren en verplaats deze naar het te vullen monster. Zodra de punt van de naald zich in het monster bevindt, houdt u de vulknop ingedrukt totdat er voldoende monster is opgenomen.

Ongeveer 0,5 microliter monster is vereist voor 10 eicellen. Gebruik de knoppen om de naald van de nanoinjector terug in de hoogste positie te brengen. Penetreer de eicel net onder het oppervlak met een naald, niet dieper, en gebruik het voetpedaal om het monster te injecteren.

Wacht ongeveer twee tot drie seconden. Na een succesvolle injectie zal de cel uitzetten. Gebruik de knoppen op de manipulator om de cel te verlaten.

Beweeg de petrischaal zodat de volgende eicel is uitgelijnd met de naald. Herhaal het proces totdat het gewenste aantal eicellen in de schaal is geïnjecteerd, trek vervolgens de nanoinjector terug naar de oorspronkelijke positie en verwijder de naald. Zorg ervoor dat één putje eicellen niet wordt geïnjecteerd om als controle te worden gebruikt.

Schakel alle apparatuur in die wordt gebruikt voor het opnemen van ionenstromen, schakel vervolgens de desktopcomputer in en log in op WinEDR versie 3.9.1. Zorg ervoor dat het programma wordt uitgevoerd en dat de record is ingesteld op Schijf. Stel daarna de opnameduur in en wis de simulatoroptie uit.

Schakel voor het spanningselektrodegedeelte de negatieve capaciteitscompensatie uit. Stel de versterkingskeuzeschakelaar in op 10 voor het badelektrodegedeelte en stel vervolgens de schakelaar met drie posities, die de versterkingsvermenigvuldiging selecteert, in op x1. De LED-lampjes geven de selectie van de versterkingsmultiplicator aan.

Schakel de klemmoduskiezer uit, zet de DC-versterkingsregeling in en stel de versterkingsregeling in op ongeveer de helft van de volledige open-lus van de bandbreedte. Stel opdrachten in op 40 millivolt, de hold controls op negative en de scale multiplier op x2. Gebruik voor de huidige elektrode de VE-offset om een nulreferentie vast te stellen voordat u de eicel spietst.

Open vervolgens de WinEDR versie 3.9.1-software, ga naar het bovenste menu en selecteer Bestand, gevolgd door Nieuw. Maak uw eigen map en sla het bestand op. Selecteer in het hoofdmenu Record, gevolgd door Opnemen op schijf.

Plaats de agarbruggen in de respectieve ronde gaten achter de opnamekamer en verbind de putten voor de elektroden die als grondreferentie in de opnamekamer worden gebruikt. Voeg 1x Ringer's Working Solution toe aan de bijbehorende perfusieklep. Open de klep totdat de opnamekamer is gevuld met Ringer's Solution.

Gebruik de rechter- en linkermanipulatoren die de elektroden vasthouden en leid de elektrodenaalden naar de opnamekamer die is gevuld met Ringer's Solution. Controleer de weerstand van elke elektrode door de VM- en VE-offsetknoppen op nul te zetten en vervolgens op de elektrodetestknoppen te drukken. De weerstand zou tussen de 0,5 en drie megaohm moeten liggen.

Als de weerstand buiten het bereik ligt, vervang deze dan met behulp van nieuwe micro-elektroden. Vul vervolgens de opnamekamer met verse Ringer's Solution. Gebruik een glazen pipet om een niet-geïnjecteerde of een micro-getransplanteerde eicel in het midden van de opnamekamer te plaatsen.

Zorg ervoor dat de eicel duidelijk zichtbaar is onder de microscoop met de dierlijke kant naar boven. Leid de elektrode in de Ringer's Solution totdat ze het eicelmembraan raken. Doorprik voorzichtig het eicelmembraan aan de dierlijke kant met beide elektroden en noteer de rustmembraanpotentiaal.

Schakel de Beler's Solution-stroom in. Gebruik de Oocyte Clamp Amplifier om de modus te veranderen in spanningsklem langzaam en stel de houdspanning in op 80 millivolts. De stroom op de monitor moet negatief zijn, meestal tussen 0 en 0,4 microampères.

Ga naar Bestand, Nieuw en sla de opname op de software op om een nieuw bestand te maken en de opname op te slaan. Druk op Opnemen gevolgd door Opnemen op schijf om de opname te starten. Voeg relevante informatie toe aan het bestand met behulp van het dialoogvenster Markeringsdiagram.

Breng agonisten aan voor chemische stimulatie door de kleppen te openen en ze gedurende 15 seconden in de opnamekamer te laten doordringen. Zodra de opname is voltooid, zet u de spanningsklem in de uit-positie en schakelt u de Ringer's Solution-klep uit. Verwijder de eicel en gooi het institutioneel beleid voor menselijke hersenmonsters weg, stop vervolgens de opname en sla het bestand op.

Sla een kopie van de opnamen op een USB-station op. Open van daaruit het gewenste bestand dat moet worden geanalyseerd. Als u de maximale AMPA-respons en de GABA A-piekrespons wilt meten, stelt u eerst een 0-niveau of basislijn vast door de rode lijn te vinden en sleept u deze vervolgens naar de stroom die wordt gegenereerd door de Ringer-toepassing of basislijn.

Zodra het 0-niveau is ingesteld, bepaalt u de responsmetingen door de groene verticale uitleescursor naar het gewenste deel van de grafiektracer te slepen. Ionenstromen van de eicellen geïnjecteerd met de membranen van de menselijke synaptische receptoren werden geregistreerd. AMPA-receptoren werden geactiveerd met 100 micromolaire kaïnaat en GABA A-receptoren met één millimolaire GABA.

Co-injectie van de gefilterde membranen van het elektrische orgaan van torpedo, rijk aan acetylcholinereceptoren, en cDNA-codering voor de GABA-rij één-receptor in de dierenpool produceerde voornamelijk twee groepen eicellen, op basis van hun reacties. Eén groep eicellen had grote reacties op acetylcholine, maar geen reacties op één micromolaire GABA. Eicellen in een andere groep hadden nul of lage reacties op acetylcholine, maar grote reacties op GABA.

De grafische afbeelding toont de gemiddelde plus minus standaardfout van het gemiddelde van de piekstroom in groep één en groep twee. Eén eicel in groep twee had grote GABA- en acetylcholineresponsen, wat wijst op de breuk van de kern. Bijgevolg was de verdeling van de responsen scheefgetrokken naar lage waarden, zoals opgemerkt door het verschil tussen het gemiddelde en de mediaan van de verdeling van de membraanstroom.

Een van de oorzaken van de oöcyten met een lage respons is dat membranen worden geïnjecteerd en gevangen in de kern van de eicel. GABA- en kaïnaatreacties van eicellen geïnjecteerd in de dierlijke of plantaardige polen met ongefilterde membranen verkregen uit een niet-AD-brein en een AD-brein worden hier weergegeven. Eicellen die in de buurt van de dierlijke pool werden geïnjecteerd zonder zich op de kern te richten, gaven grotere reacties dan eicellen die in de plantaardige pool werden geïnjecteerd, waardoor weefselmonsters met zeer lage aantallen receptoren konden worden bestudeerd.

Houd tijdens het uitvoeren van deze procedure altijd uw Ringer-niveau in de gaten. Het is altijd tijdens de belangrijke opnames dat je opraakt, en dan zal het je resultaat gebruiken, en de dood van de eicel, en verlies van zeer waardevolle gegevens. Na deze procedure kunnen we westerse belastingen uitvoeren om de aanwezigheid van de synaptische receptoren of interessante eiwitten te valideren.

Het maakt het mogelijk om globale excitatie tot remming synaptische verhoudingen in verschillende hersengebieden en verschillende hersenaandoeningen te meten, waardoor directe test kan worden uitgevoerd op theoretische voorspelling over de oorzaken van ziekte.