Name: In vitro Reconstitutie van het Actin Cytoskelet Inside Giant Unilamellar Vesicles (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Leer de reconstitutie van het actine-cytoskelet in reuze unilamellaire vesikels voor celbiologisch onderzoek. Deze methode biedt hoge opbrengst en efficiënte inkapseling van eiwitten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We erkennen de financiering van ARO MURI W911NF-14-1-0403 aan M.P.M., de National Institutes of Health (NIH) R01 1R01GM126256 aan M.P.M., de National Institutes of Health (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, University of Michigan / Genentech, SUBK00016255 en Human Frontiers Science Program (HFSP) subsidienummer RGY0073/2018 aan M.P.M. Alle meningen, bevindingen, conclusies of aanbevelingen die in dit materiaal worden uitgedrukt, zijn die van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de ARO, NIH of HFSP. S.C. erkent vruchtbare gesprekken met V. Yadav, C. Muresan en S. Amiri.

1. Bereiding van buffers en eiwitoplossingen
<ol><li>Bereid de waterige Inwendige Niet-Polymerisatiebuffer (INP) in een totaal volume van 5 ml door 0,1 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 320 mM sucrose en 0,2 mM ATP te mengen.</li>
	<li>Bereid de Protein Mix (PM) door eiwitten toe te voegen aan de INP-buffer bij 4 °C met de volgende concentraties: 11,2 μM niet-fluorescerend G-actine, 2,8 μM fluorescerend gelabeld actine en 0,24 μM Arp2/3 (Tabel met materialen). Om een F-actinelaag te vormen, voegt u 100 nM gelsolin, 4 μM cofiline en 2,2 μM VCA-His toe aan de PM. Vervang PM als controle-experiment door 100 μg/ml fluorescerende kleurstof (materiaaltabel).</li>
	<li>Bereid de waterige binnenpolymerisatiebuffer (IP) (waterig) in een totaal volume van 5 ml door 100 mM KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 10 mM ATP en 80 mM sucrose te mengen.</li>
	<li>Bereid de eindbuffer (FB) voor door inp-buffer (met PM) en IP-buffer te mengen in een volumeverhouding van 1:1 om de binnenste waterige oplossing te verkrijgen in een totaal volume van 30 μL dat in het liposoom wordt ingekapseld.</li>
	<li>Bereid de waterige buitenbuffer (OB) in een totaal volume van 150 μL door 10 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM KCl, 2mM MgCl2, 0,2 mM CaCl2, 2mM ATP, 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 212 mM glucose en 0,1 mg/ml β-caseïne te mengen. OPMERKING: De osmolariteit van de OB kan worden aangepast met glucose om ervoor te zorgen dat de osmotische druk van de OB iets groter is dan die van de FB (20-60 mOsm). De dichtheid van de FB moet iets hoger zijn dan de OB.</li>
</ol>2. Bereiding van liposomen op basis van de omgekeerde emulsietechnieken
<ol><li>Bereid het lipide-oliemengsel<ol><li>Voeg 100 μL 25 mg/ml L-α-fosfatidylcholine (niet-fluorescerend Ei PC, ook wel EPC genoemd, inclusief 1% DHPE) toe aan een glazen injectieflacon. Verdamp chloroform met argongas en laat een droge vaste lipidenfilm (2,5 mg) achter op de bodem van de injectieflacon.<ol><li>Om een F-actinelaag te vormen, voegt u 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic acid] succinyl} nikkelzout (DOGS-NTA-Ni) toe aan een 10:1 verhouding van EPC tot DOGS-NTA-Ni en meng voor de verdamping van chloroform.</li>
		</ol></li>
		<li>Voeg 2 ml minerale olie toe en soniceer het lipide-oliemengsel bij kamertemperatuur in een bad gedurende 1 uur om de lipiden opnieuw op te schorten. OPMERKING: Het lipide-oliemengsel na ultrasoonapparaat kan gedurende 1 week bij 4 °C worden bewaard. Re-sonicatie wordt voorgesteld voor gebruik.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid een laatste buffer in olie (FB / olie) emulsie voor het bereiden van monolaag lipidedruppels die het eiwit van belang bevatten.<ol><li>Voeg aan 100 μL lipide-oliemengsel in een plastic buis 10 μL FB toe. Zorg ervoor dat FB zich in één druppel bevindt.</li>
		<li>Teken met behulp van een glazen spuit het lipide-olie-FB-mengsel en zuig meerdere keren voorzichtig op en neer om het te emulgeren; trek eerst een kleine hoeveelheid lipide-oliemengsel en vervolgens de FB-druppel door de punt van de spuit aan de rand van de druppel te plaatsen om deze in kleine druppeltjes te breken. Herhaal de op en neer gaande aspiratie totdat een witachtige en troebele emulsie wordt gevormd.</li>
	</ol></li>
	<li>Doe 30 μL OB in een aparte plastic buis. Plaats 30 μL van het lipide-oliemengsel bovenop OB en laat het ~ 10 minuten zitten om een lipide monolaag op het grensvlak te ontwikkelen. OPMERKING: Als de lipiden geladen zijn of het eiwit wordt opgenomen, moet de duur van deze stap worden verlengd38.</li>
	<li>Bereid de liposomen voor<ol><li>Voeg voorzichtig 50 μL van de FB/olie-emulsie (stap 2.2) toe aan de bovenste oliefase van de buis vanaf stap 2.3.</li>
		<li>Centrifugeer de plastic buis bij 100 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Varieer de tijd en centrifugatiesnelheid om te optimaliseren voor liposoomvorming. OPMERKING: Na centrifugatie moet de bovenste oliefase duidelijk zijn en moet de onderste OB (met liposomen) enigszins troebel zijn.</li>
		<li>Verwijder de oliefase voorzichtig met een pipet. Aspirateer extra volume indien nodig. Zorg ervoor dat u de pipetpunt niet aan de zijkant van de buis plaatst om te voorkomen dat er een meniscus van olie bovenop de liposoomfase ontstaat.</li>
		<li>Steek met een nieuwe pipet de pipetpunt langzaam in de resterende onderste fase en zuig het waterige volume aan om liposomen te verzamelen. OPMERKING: Het is beter om volume te verliezen dan om de olie op te nemen. De toevoeging van olie zal ervoor zorgen dat liposomen scheuren en de interne componenten worden vrijgegeven in de externe buffer. Snijd de punt van een pipet om afschuiving te verminderen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Microscopie observatie
<ol><li>Giet 100 μL OB in de put van een incubatiekamer (4-wells plaat met 12 mm ronde coverslips). Deponeer de verzamelde liposomen (stap 2.4.4) voorzichtig in OB en plaats vervolgens een andere coverslip bovenop de kamer. OPMERKING: De OB bevat de β-caseïne om het glasoppervlak te passiveren en het plakken tussen de liposomen te minimaliseren20.</li>
	<li>Observeer liposomen met een confocale microscoop met behulp van een 63x olie-immersie objectief. Gebruik laserlijnen van 488 nm, 647 nm en 561 nm om respectievelijk fluorescerend gelabeld lipide, ingekapselde fluorescerende kleurstof en ingekapselde fluorescerend gelabelde actine te observeren. Leg de interessante frames vast en sla de afbeeldingen op in TIFF-indeling.</li>
	<li>Verwerk en analyseer afbeeldingen in ImageJ/Fiji39. Voor nieuwe gebruikers van ImageJ/Fiji is een online tutorial beschikbaar (zie Materiaaltabel).<ol><li>Open het TIFF-bestand met behulp van ImageJ / Fiji-software.</li>
		<li>Ga naar Afbeelding > > helderheid / contrast aanpassen. Pas de helderheid en het contrast van de afbeelding aan de gewenste schaal aan door de instellingen Minimum en Maximum en de schuifregelaars Helderheid en Contrast aan te passen.</li>
		<li>Klik op het gereedschap Rechthoekselectie in de werkbalk en selecteer het interessante gebied (ROI). Ga naar Afbeelding > bijsnijden om de ROI bij te snijden.</li>
		<li>Ga naar Analyseren > Schaal instellen. Voer in het pop-upvenster 1.0 in het veld Pixelverhouding in en stel μm in als lengte-eenheid. Voer in het veld Afstand in pixels de afbeeldingsbreedte in pixels in. Voer in het veld Bekende afstand de werkelijke afbeeldingsbreedte in micron in.</li>
		<li>Als u de grootte van het liposoom wilt meten, tekent u met het gereedschap Ovaal selecteren in de werkbalk een cirkel langs de rand van het liposoom. Ga naar Analyseren > Meten om het oppervlak van de cirkel te meten, van waaruit de diameter van het liposoom kan worden berekend.</li>
	</ol></li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Verschillende belangrijke stappen bepalen het succes van een hoge opbrengst van liposomen tijdens het bereidingsproces. Om de lipidefilm in de olie volledig op te lossen, moet het monster worden gesoniseerd totdat de lipidefilm op de bodem van de glazen injectieflacon volledig verdwijnt. Na de ultrasoonapparaat moet het lipide-oliemengsel 's nachts bij kamertemperatuur onder donkere omstandigheden worden bewaard om de lipidemoleculen verder te laten dispergeren29. Het mengsel kan maximaal een week...

Het actinecytoskelet speelt een fundamentele rol bij het construeren van de intracellulaire architectuur van de cel door contractiliteit op moleculair niveau en krachtgeneratie 1,2,3 te coördineren. Als gevolg hiervan bemiddelt het tal van essentiële cellulaire activiteiten, waaronder celvervorming 4,5, deling6, migratie 7,8 en adhesie9. De in vitro reconstitutie van actinenetwerken heeft de afgelopen jaren enorme aandacht gekregen 10,11,12,13,14,15,16,17. Het doel van reconstitutie is om een minimaal model van de cel te bouwen zonder de complexe biochemische regulatie die bestaat in levende cellen. Dit biedt een controleerbare omgeving om specifieke intracellulaire activiteiten te onderzoeken en vergemakkelijkt de identificatie en analyse van verschillende componenten van het actinecytoskelet 18,19. Verder biedt de inkapseling van in vitro actinenetwerken in fosfolipide gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs, liposomen) een beperkte maar vervormbare ruimte met een semi-permeabele grens. Het bootst de fysiologische en mechanische micro-omgeving van de actinemachinerie na in de cel 9,20,21,22.
Onder verschillende methoden om liposomen te bereiden, is de lipidefilmhydratatiemethode (ook bekend als de zwellingsmethode) een van de vroegste technieken23. De droge lipidefilm hydrateert met de toevoeging van buffers en vormt vliezige bubbels die uiteindelijk blaasjes worden24. Om grotere blaasjes met een hogere opbrengst te produceren, past een verbeterde methode die voortgaat op de filmhydratatiemethode, bekend als de elektroformatiemethode25, een AC elektrisch veld toe om het hydratatieproces efficiënt te bevorderen26. De belangrijkste beperkingen van deze op hydratatie gebaseerde methoden voor actine-inkapseling zijn dat het een lage inkapselingsefficiëntie van sterk geconcentreerde eiwitten heeft en alleen compatibel is met specifieke lipidesamenstellingen24. De omgekeerde emulsietechniek heeft in vergelijking minder beperkingen voor lipidecomponenten en eiwitconcentraties 20,27,28,29. Bij deze methode wordt een mengsel van eiwitten voor inkapseling toegevoegd aan de binnenste waterige buffer, die later wordt geëmulgeerd in een lipidebevattende minerale olieoplossing, waarbij lipide-monolaagdruppeltjes worden gevormd. De monolaagse lipidedruppels kruisen vervolgens door een andere lipide / olie-water-interface door centrifugatie om bilayer lipide blaasjes (liposomen) te vormen. Deze techniek is een van de meest succesvolle strategieën gebleken voor actine-inkapseling24,30. Afzonderlijk zijn er enkele microfluïdische apparaatmethoden, waaronder gepulseerde jetting31,32, transiënte membraanuitwerping33 en de cDICE-methode34. De overeenkomsten tussen de omgekeerde emulsiemethode en de microfluïdische methode zijn het lipideoplosmiddel (olie) dat wordt gebruikt en de introductie van lipide / olie-water-interface voor de vorming van de buitenste folder van liposomen. Daarentegen vereist het genereren van liposomen door de microfluïdische methode een opstelling van microfluïdische apparaten en gaat gepaard met olie die tussen de twee blaadjes van de bilayer is opgesloten, wat een extra stap vereist voor olieverwijdering35.
In dit manuscript gebruikten we de omgekeerde emulsietechniek om liposomen te bereiden die een gepolymeriseerd F-actinenetwerk inkapselen zoals eerder gebruikt22. Het eiwitmengsel voor inkapseling werd eerst in een buffer met niet-polymeriserende omstandigheden geplaatst om actine in zijn bolvormige (G) vorm te behouden. Het hele proces werd uitgevoerd bij 4 °C om vroege actinepolymerisatie te voorkomen, die later werd geactiveerd door het monster te laten opwarmen tot kamertemperatuur. Eenmaal op kamertemperatuur polymeriseert de actine in zijn filamenteuze (F) vorm. Een verscheidenheid aan actinebindende eiwitten kan worden toegevoegd aan de binnenste waterige bufferoplossing om eiwitfunctionaliteiten en -eigenschappen te bestuderen, waardoor verdere inzichten worden verkregen in de interactie met het actinenetwerk en het membraanoppervlak. Deze methode kan ook worden toegepast op de inkapseling van verschillende eiwitten van belang36 en grote objecten (microdeeltjes, zelfrijdende microswimmers, enz.) dicht bij de grootte van de uiteindelijke liposomen28,37.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>231615773</td><td>Nickel Lipid</td></tr><tr><td>1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane</td><td>Sigma</td><td>D27802-25G</td><td>DABCO</td></tr><tr><td>Actineiwit (>99% puur): konijn skeletspier</td><td>Cytoskeleton, Inc</td><td>AKL99-D</td><td>niet-fluorescente G-actine</td></tr><tr><td>Actineiwit (rodamine): konijn skeletspier</td><td>Cytoskeleton, Inc</td><td>AR05</td><td>fluorescent gelabeld actine</td></tr><tr><td>Adenosine 5'-trifosfaat dinatriumzoutwatervrij</td><td>Sigma</td><td>A2383-10G</td><td>ATP</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 kleurstof</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>fluorescente kleurstof</td></tr><tr><td>Andor iQ3</td><td>Andor Technologies</td><td></td><td>besturings- en acquisitiesoftware voor confocale microscoop</td></tr><tr><td>Arp2/3-eiwitcomplex: varkenshersenen</td><td>Cytoskeleton, Inc</td><td>RP01P-A</td><td>Arp 2/3</td></tr><tr><td>Calciumchloridedihydraat</td><td>Sigma</td><td>10035048</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>Chamlide-kamers (4-putjes voor 12 mm ronde dekglas)</td><td>Quorum Technologies</td><td></td><td>incubatiekamer</td></tr><tr><td>Cofilineiwit: humaan recombinant</td><td>Cytoskeleton, Inc</td><td>CF01-C</td><td>cofilin</td></tr><tr><td>Confocale microscoop (63x olie-immersie objectief)</td><td>Andor Technologies</td><td>LEICA DMi8</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td>glucose</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>DOT Scientific&nbsp;</td><td>DSD11000-10</td><td>DTT</td></tr><tr><td>Gelsolin-eiwit: Homo Sapiens Recombinant</td><td>Cytoskeleton, Inc</td><td>HPG6</td><td>gelsolin</td></tr><tr><td>Hamilton 1750 Gastight-spuit, 500 &micro;L, verlijmde naald, 22 G, 2" conische punt</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-07940-53</td><td>glas-spuit</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AmericanBio</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/Fiji</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/tutorials/</td></tr><tr><td>L-alpha-Fosfatidylcholine</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>97281442</td><td>EPC</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Sigma</td><td>7786303</td><td>MgCl2</td></tr><tr><td>Mineralolie, BioReagent, voor moleculaire biologie, lichte olie</td><td>Sigma</td><td>8042475</td><td>minerale olie</td></tr><tr><td>N-WASP-fragment WWA (aa400&ndash;501, VCA-His)</td><td></td><td></td><td>VCA-His wordt gezuiverd volgens laboratoriumprotocol. Het protocol kan worden verstrekt op redelijk verzoek</td></tr><tr><td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Fosfoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE)</td><td>Thermo Fisher</td><td>O12650</td><td>DHPE</td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma</td><td>7447407</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>57-50-1</td><td>sucrose</td></tr><tr><td>&beta;-Caseïne van rundersmelk</td><td>Sigma</td><td>C6905-250MG</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro reconstitutie van het actin cytoskelet inside giant unilamellar vesicles

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

Het actinecytoskelet, de belangrijkste mechanische machinerie in de cel, bemiddelt tal van essentiële fysieke cellulaire activiteiten, waaronder celvervorming, deling, migratie en adhesie. Het bestuderen van de dynamiek en structuur van het actinenetwerk in vivo wordt echter bemoeilijkt door de biochemische en genetische regulatie in levende cellen. Om een minimaal model te bouwen zonder intracellulaire biochemische regulatie, wordt actine ingekapseld in gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs, ook wel liposomen genoemd). De biomimetische liposomen zijn celgroot en vergemakkelijken een kwantitatief inzicht in de mechanische en dynamische eigenschappen van het cytoskeletnetwerk, waardoor een levensvatbare route wordt geopend voor bottom-up synthetische biologie. Om liposomen voor inkapseling te genereren, wordt de omgekeerde emulsiemethode (ook wel de emulsieoverdrachtsmethode genoemd) gebruikt, wat een van de meest succesvolle technieken is voor het inkapselen van complexe oplossingen in liposomen om verschillende celnabootsingssystemen voor te bereiden. Met deze methode wordt een mengsel van interessante eiwitten toegevoegd aan de binnenbuffer, die later wordt geëmulgeerd in een fosfolipide-bevattende minerale olieoplossing om monolaagse lipidedruppeltjes te vormen. De gewenste liposomen worden gegenereerd uit monolaagse lipidedruppels die een lipide / olie-water-interface kruisen. Deze methode maakt de inkapseling van geconcentreerde actinepolymeren in de liposomen met gewenste lipidecomponenten mogelijk, waardoor de weg wordt vrijgemaakt voor in vitro reconstitutie van een biomimicking cytoskeletnetwerk.

De bereiding van liposomen op basis van de omgekeerde emulsietechniek wordt grafisch en schematisch geïllustreerd in figuur 1.
Eerst werden lege (kale) liposomen (~ 5-50 μm in diameter) bereid die waren samengesteld uit fosfolipide (EPC) en fluorescerend lipide (DHPE). Een heldere, verrode fluorescerende kleurstof werd ingekapseld in kale liposomen als een controle-experiment. Of een lipide monolaag zich met succes heeft gevormd in het perifere deel van de druppel...

In dit manuscript demonstreren we de experimentele technieken om het F-actinecytoskelet in te kapselen in gigantische unilamellaire lipideblaasjes (ook wel liposomen genoemd), en de methode om een cortex-biomimicking F-actinelaag te vormen aan de binnenste folder van het liposoommembraan.

In vitro Reconstitutie van het Actin Cytoskelet Inside Giant Unilamellar Vesicles

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

Deze maatregel bouwt een minimummodel van de cel zonder complexe biochemische voorschriften. De gebruikte techniek kan een hoge opbrengst van liposomen genereren en heeft een hoge inkapselingsefficiëntie voor cytoskeleteiwitten. Deze maatregel kan worden toegepast op inkapseling van verschillende eiwitten en grote objecten zoals microdeeltjes en zelfvoorbereidende microzwemmers.Een individu worstelt met het verhogen van de liposoomopbrengst voor de eerste paar pogingen. Het wordt aanbevolen om regelmatig een gedeelte van het manuscript te bespreken voor meer details om de opbrengst te verhogen. Bereid om te beginnen de waterige binnenste niet-polymerisatiebuffer in een totaal volume van vijf milliliter door 0,1 millimol CACL twee, 10 millimol HEPES, één millimolar DTT, 0,5 millimol DAPCO, 320 millimol sucrose en 0,2 millimol ATP te mengen.Bereid de eiwitmix voor door eiwitten toe te voegen aan de binnenste niet-polymerisatiebuffer bij vier graden Celsius. Om een actinelaag te vormen, voegt u 100 nanomolaire gellcaline, vier micromolaire coughaline en 2,2 micromolaire VCA HEZ toe aan de eiwitmix. Vervang als controle-experiment de eiwitmix door 100 microgram per milliliter fluoresce

in-vitro-reconstitution-actin-cytoskeleton-inside-giant-unilamellar

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

De reconstitutie van het transmembraan eiwit, KvAP, in grote unilamellaire vesicles (GUVs) is aangetoond voor twee dehydratatie-rehydratatie methode - electroformation en gel ondersteunde zwelling. In beide werkwijzen worden kleine unilamellaire blaasjes die het eiwit gefuseerd aan GUVs die vervolgens kan worden onderzocht door fluorescentie microscopie en patch-clamp elektrofysiologie vormen.

Reconstructie van een transmembraaneiwit, de Voltage-gated ionkanalen, KvAP, in Giant Unilamellaire Blaasjes voor Microscopie en Patch Clamp Studies

Reusachtige blaasjes die micrometergrote componenten bevatten, zijn nuttige celmodellen. De centrifugatiemethode voor water-in-olie-emulsie is een eenvoudige, krachtige tool voor de bereiding van reusachtige blaasjes met ingekapselde materialen.

Bereiding van Giant blaasjes inkapselen Microbolletjes door centrifugeren van een water-in-olie emulsie

Vroege endosome functies is afhankelijk van F-actine polymerisatie. Hier beschrijven we een microscopie gebaseerde in vitro -assay die reconstitutes de nucleatie en polymerisatie van de F-actine op vroege endosomal membranen in proefbuizen, waardoor deze complexe reeks reacties vatbaar voor biochemische en genetische manipulaties.

In Vitro Polymerisatie van F-actine op vroege Endosomen

Veel proteïnen in de cel zin en membraan kromming veroorzaken. Beschrijven we een methode om te halen membraan nanotubes van lipide blaasjes te bestuderen de interactie van proteïnen of elke kromming-actieve molecuul met gebogen membranen in vitro.

Membraan Nanotubes trekken van Giant Unilamellar blaasjes

Dit artikel introduceert een eenvoudige methode voor snelle productie van gigantische unilamellaire blaasjes met ingekapselde cytoskeletale eiwitten. De methode blijkt nuttig te zijn voor bottom-up reconstitutie van cytoskeletstructuren in opsluiting en cytoskelet-membraaninteracties.

Snelle inkapseling van gereconstitueerd cytoskelet in gigantische unilamellaire blaasjes

Dit protocol beschrijft de vorming van ondersteunde lipide bilayers en de toevoeging van cytoskeletale filamenten en motoreiwitten om de dynamiek van gereconstitueerde, membraangebonden cytoskeletale netwerken te bestuderen met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Reconstitutie van membraangebonden minimale actinecorticosterces op ondersteunde lipidebilagen

Dit protocol beschrijft de omgekeerde emulsiemethode die wordt gebruikt om een celvrije expressie (CFE) -systeem in te kapselen in een gigantisch unilamellair blaasje (GUV) voor het onderzoek naar de synthese en incorporatie van een modelmembraaneiwit in de lipidedubbellaag.

Reconstitutie van het bacteriële glutamaatreceptorkanaal door inkapseling van een celvrij expressiesysteem

Dit artikel presenteert een methode voor het bereiden van samengestelde Giant Unilamellaire blaasjes (cGUV's) met een blaasje-in-blaasjesstructuur, met aangepaste elektrische geleidbaarheid in binnenste, ringvormige en buitenste gebieden. Elektroformatie synthetiseert eenvoudige GUV's, die via osmotische shock worden omgezet in stomatocyten en cGUV's, wat een waardevol model biedt voor het bestuderen van de biofysica van cellen met kern.

Synthese van samengestelde reusachtige unilamellaire blaasjes: een biomimetisch model van nucleaatcellen

Dit artikel introduceert een eenvoudige reconstitutie in één pot van cytoskeletale netwerken in fasegescheiden reuzenblaasjes. De methode kan worden veralgemeend en toegepast op inkapseling of opsluiting van een breed scala aan biomoleculen.

In vitro Reconstitutie van cytoskeletale netwerken in fasegescheiden gigantische unilamellaire blaasjes (GUV's)

We hebben een oogirritatie test die een driedimensionaal gereconstrueerd menselijk hoornvlies-achtige epitheliale (RHCE) weefsel model maakt gebruik ontwikkeld. De test is in staat onderscheid te maken tussen oculaire irriterende en bijtende stoffen (GHS-categorieën 1 en 2 gecombineerd) en degenen die geen etikettering (GHS geen categorie) vereisen.

Test op oogirritatie (EIT) voor Risico oog irriterende stoffen met gereconstrueerde humane Cornea-achtige Epithelial (RHCE) Tissue Model

Leer de reconstitutie van het actine-cytoskelet in reuze unilamellaire vesikels voor celbiologisch onderzoek. Deze methode biedt hoge opbrengst en efficiënte inkapseling van eiwitten.

In vitro Reconstitutie van het Actin Cytoskelet Inside Giant Unilamellar Vesicles

Meer video's verkennen