Gegevens met één worm gebruiken om heterogeniteit in caenorhabditis elegans-bacteriële interacties te kwantificeren

Dit protocol demonstreert mechanische verstoring van zee-elegans. In een 96-well-formaat dat medium throughput kwantificering van bacteriële belasting in individuele wormen mogelijk maakt. Deze techniek verhoogt de snelheid en uniformiteit van mechanische verstoring in vergelijking met op Pasel gebaseerde methoden, waardoor onderzoekers gemakkelijk grotere datasets van hoogwaardige enkele wormmetingen kunnen produceren.

Deze techniek omvat veel bewegende delen en het is gemakkelijk om je plaats te verliezen. Zorg ervoor dat u alle materialen, gelabelde buizen, buffers en platen hebt ingesteld voordat u begint. Het demonstreren van de procedure zal Megan Taylor zijn, een onderzoeksspecialist uit mijn laboratorium.

Begin met het opnieuw suspenseren van het wormmonster in één milliliter M nine TX zero one in een microcentrifugebuis. Verzamel de volwassen wormen door centrifugeren en gooi het supernatant weg. Met dezelfde centrifugatieparameters.

Spoel de wormen twee keer met een milliliter M9TX01 en een keer met een milliliter M9-wormbuffer, om de externe bacteriën te minimaliseren. Vervolgens suspensiet u elk monster opnieuw in één milliliter S-medium plus twee x warmtedod OP50 in een kweekbuis. Incubeer de buizen bij 25 graden Celsius gedurende 20 tot 30 minuten om de niet-ad gehechte bacteriën uit de darm te halen.

Spoel na incubatie de gezuiverde wormen twee keer af met één milliliter koude M9TX01 en gooi de super natant weg. Zet de buisjes 10 minuten op ijs om de wormen te verlammen. Voeg vervolgens een milliliter ijskoude M negen-wormbuffer met ongeparfumeerd bleekmiddel toe aan elke buis.

Incubeer de buizen op ijs gedurende minimaal 10 minuten om externe bacteriën te doden. Gooi de bleekbuffer weg en breng de buizen terug naar het ijs om te voorkomen dat de wormen pompen. Voeg vervolgens een milliliter koude M9TX01 toe aan elke buis en centrifugeer gedurende vijf seconden.

In een minicentrifuge. Breng de buisjes terug naar het ijs en verwijder het supernatant. Herhaal deze stap eenmaal.

Voor chemische permeabilisatie van worm cuticula. Breng de buizen met de wormen in 20 microliter buffer over naar een buizenrek op kamertemperatuur. Voeg vervolgens 100 microliter SDS/DTT-oplossing toe aan elk warm monster.

Incubeer de buizen gedurende maximaal acht minuten op de bank om de cuticula van de volwassen wormen gedeeltelijk af te breken. Op dit punt zullen de wormen sterven en zich op de bodem van de buis vestigen. Gooi na incubatie het SDS/DTT-supernatant voorzichtig weg.

Voeg vervolgens een milliliter M9TX01 toe aan elke buis en centrifugeer kort om de wormen te pelleteren. Gooi het supernatant weg en suspensieer de wormen opnieuw in één milliliter M negen wormbuffer met 0,1% Triton x-100. Om u voor te bereiden op mechanische verstoring van wormen, krijgt u een steriele twee milliliter diepe put 96 putplaatplaat en een siliconenplaatafdekking.

Gebruik een steriele schepspatel om een kleine hoeveelheid steriel 36-rooster siliconencarbide aan elke put toe te voegen, zodat het rooster de bodem van de put nauwelijks bedekt. Voeg 180 microliter M negen wormbuffer toe aan elk putje. Label de kolommen en rijen en bedek de plaat vervolgens losjes met het siliconenplaatdeksel.

Breng vervolgens de doorgekajte wormen over naar een kleine petrischaal met M9TX01 gevuld tot een diepte van één centimeter. Met behulp van een ontleedmicroscoop pipette u individuele wormen in volumes van 20 microliter en breng ze over naar individuele putten van de 96 putplaat om eventuele wormen die aan de pipet vastzitten uit te werpen, 20 microliter M9TX01 uit een duidelijk gebied van de petrischaal te zuigen en terug in de schaal vrij te geven. Zodra alle wormen zijn overgebracht, bedekt u de 96 putplaat met een vel flexibele plafondfolie met de papieren achterkant naar beneden gericht op de monsterputten.

Plaats de siliconen plafondmat lichtjes bovenop de flexibele plafondfolie zonder de cover in de putjes te drukken. Plaats de plaat gedurende 30 tot 60 minuten op vier graden Celsius om oververhitting tijdens verstoring te voorkomen. Na het koelen van de plaat drukt u de siliconen plafondmat stevig in de putjes om ze af te dichten.

Zet vervolgens platen vast in de weefselverstoorder. Schud de borden gedurende één minuut op 30 hertz. Draai vervolgens de platen 180 graden en herhaal het schudden gedurende een minuut.

Tik de platen twee of drie keer stevig op de bank om eventuele gruis van de flexibele plafondfolie los te maken. Centrifugeer de plaatset 2, 400 maal G gedurende twee minuten om de monsters op de bodem van de putten te verzamelen. Verwijder vervolgens het siliconen deksel en trek de plafondfolie eraf.

Om een tienvoudige seriële verdunning van de wormen te bereiden, vult u 180 microliter van één X PBS in rijen B tot D van een 96 putplaat. Gebruik een pijptter met meerdere putten die is ingesteld op 200 microliter en meng de worm langzaam door te pipetteren. Breng de maximale hoeveelheid vloeistof over naar rij A van de 96 putplaat met PBS.

Verwijder met behulp van een meerkanaals pipet 20 microliter uit de bovenste rij en doseer in rij B.Gevolgd door mengen. Herhaal deze stap voor rij B tot C en vervolgens rij C tot D om een 1000-voudige verdunning te krijgen Voor bacteriële kwantificering van mono gekoloniseerde wormen. Plaat 10 tot 20 microliter van elke verdunning op massieve agarplaten.

Voor multi-species kolonisatie, plaat 100 microliter van elke verdunning op 10 centimeter agar platen. Met behulp van dit protocol werd effectieve externe ontsmetting waargenomen na oppervlaktebleking van koude verlamde wormen, zoals te zien is aan de afname van externe bacteriën in buffer. Zonder de darm geassocieerde bacteriën aan te tasten.

Handmatige verstoring van wormen resulteerde in meer heterogeniteit. Siliconencarbide grit was ideaal voor verstoring met of zonder Tri Andex. Bij de 96 putmethode waren grote glaskralen niet geschikt voor de 96 put techniek.

Kleine glaskralen leverden consistente resultaten op, maar verstopten de pijp aan de punt. Wormen gekoloniseerd op dezelfde pool van bacteriën vertoonden een hoge variatie in darmbelasting wanneer waargenomen voor individuele bacteriën en multi-species bacteriële gemeenschappen. Wormen gekoloniseerd met bacteriën die GFP tot expressie brengen, vertoonden heterogeniteit in individuele wormmetingen.

Voor deze GFP-expressie van bacteriestam wordt de kolonisatie van het wilde type Bristol Len twee wormen vergeleken. Aan DAF toonden twee IGF-mutanten aan dat de DAF 16-mutant grotere populaties bacteriën ondersteunt, terwijl DAF twee resistent is tegen kolonisatie. Deze heterogeniteit was kenmerkend en consistent over verschillende runs van hetzelfde experiment.

Het opnieuw bemonsteren van gegevens om batch-digesten te simuleren bleek de verdeling te veranderen in vergelijking met individuele wormgegevens. De batch geëxtrapoleerde CFU per worm was gecentreerd rond het rekenkundig gemiddelde van de individuele gegevens die leidden tot verlies van biologische variatie. In plaats van door te gaan met het verteren van levend oppervlaktebleekmiddel en spoelwormen kunnen worden gebruikt voor verdere experimenten.

Beweging zal snel hervatten zodra wormen uit de kou zijn verwijderd.