Niet-destructieve evaluatie van regionale celdichtheid binnen tumoraggregaten na medicamenteuze behandeling

Dit protocol geeft informatie over de progressie van tumormodellen op een niet-destructieve manier. Het geeft ook aanwijzingen voor therapeutische respons door hele medicijnregimes binnen enkelvoudige aggregaten in plaats van te vertrouwen op leeftijdsmatchmonsters. Conventionele methoden voor het verkrijgen van celdichtheid en levensvatbaarheid binnen aggregaten vereisen monsterfixatie en secties, terwijl de onze gegevens niet-destructief levert.

Wijzigingen kunnen dus in de loop van de tijd binnen één aggregaat worden bijgehouden. Deze techniek zal naar verwachting ons begrip van geneesmiddelrespons binnen discrete regio's van geaggregeerde modellen verbeteren, met implicaties voor hoe goed deze modellen in vivo reacties en medicijnscreeningtoepassingen weerspiegelen. Bereid om te beginnen 70 tot 90% confluentiecelculturen van de gewenste cellijnen voor in standaardomstandigheden.

Maak celmonolagen los van hun kweekkolven volgens de standaard trypsinisatiemethode en voeg de celsuspensie toe aan een centrifugebuis. Voeg 10 microliter van de celsuspensie toe aan een hemocytometer en tel via microscopie om het aantal cellen in de suspensie te bepalen. Pelletcellen via centrifugatie en resuspensiecellen in media in de gewenste concentratie van 2,5 maal 10 tot de vijfde cellen per milliliter.

Voor suspensies bereid met de keldermembraanmatrix, verwijdert u de matrixflacon uit min 20 graden Celsius-opslag en plaatst u deze in de koelkast om een nacht te ontdooien. Bereid een container met groeimedia en laat 10 minuten in de koelkast afkoelen. Voeg met behulp van een bevroren pipetpunt de matrix toe aan gekoelde media, zodat de uiteindelijke concentratie van deze oplossing 5% is Voeg 50 microliter van dit medium toe aan elke put van een ronde bodem, niet-hechtende 96-well plaat, zodat de uiteindelijke concentratie van matrix in deze putten 2,5% zal zijn na toevoeging van celsuspensie.

Voeg voor suspensies bereid zonder matrix 50 microliter gewone groeimedia toe aan elk putje. Doseer 50 microliter celsuspensie in elke put. Centrifugeer de platen bij 123 G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur onmiddellijk na het zaaien om ervoor te zorgen dat een celpellet op de bodem van elke put wordt verzameld.

Gebruik een OCT-systeem voor structurele beeldvorming. Stel de A-scansnelheid in op 5,5 kilohertz voor het verzamelen van afbeeldingen met een hoge resolutie. Stel de brekingsindex in op 1,33 voor monsters in een vloeibaar medium.

Stel in het venster met afbeeldingsparameters aan de rechterkant van het scherm het gezichtsveld in door X-, Y- en Z-waarden in te voeren, zodat het voorbeeld binnen dit interessegebied valt. Klik op 3D-acquisitiemodus en klik vervolgens op Opnemen om de 3D-volumescan van het monster te verzamelen. Als u een volumereconstructie wilt maken, opent u Imaris en navigeert u naar het geconverteerde TIF-bestand in hun arena.

Ga naar bewerken, klik vervolgens op Afbeeldingseigenschappen en voer de voxelgrootte van de OCT-afbeelding in de overeenkomstige XYZ-vakken in. Klik vervolgens op OK. Klik op Nieuwe oppervlakken toevoegen boven de objectenstructuur. Klik in het menu onder de boomstructuur op Automatisch maken overslaan en handmatig bewerken.

Schuif in het weergaveaanpassingsvenster handmatig met de rode en zwarte pijlen om het contrast tussen het voorbeeld en de achtergrond te verbeteren en de voorbeeldvisualisatie te verbeteren. Pas de segmentpositie aan op het segment aan de ene rand van het monster. Gebruik de escape-toets om de muis van de navigatiemodus naar de selectiemodus te wijzigen en klik vervolgens op Tekenen.

Traceer handmatig de omtrek van het gebied waarin het signaal wordt weergegeven. Vervroeg de segmentpositie door de volgende positie in het invoervak in te voeren. Deze volgende positie moet kleiner zijn dan of gelijk zijn aan 100 plakjes verder in het monster dan de vorige.

Traceer handmatig het gebied waarin het signaal wordt weergegeven. Herhaal deze stap door de dikte van het monster totdat de tegenoverliggende rand van het monster is bereikt. Klik vervolgens op Surface maken en het linkermenu om deze segmenten samen te voegen.

Klik ten slotte op Bewerken, klik vervolgens op Maskerselectie en klik vervolgens op OK om de volumereconstructie te voltooien. Als u de totale celdichtheid van het monster wilt verkrijgen, selecteert u Nieuwe vlekken toevoegen. Schakel in het menu algoritme-instellingen alle vakken uit.

Klik op de blauwe pijl om naar het bronkanaalscherm te gaan. Selecteer in het vervolgkeuzemenu dat verschijnt het gemaskeerde kanaal. Voer de gemiddelde celdiameter voor het monster in het vak XY-diameter in.

Zorg ervoor dat achtergrondaftrek is aangevinkt. Klik op de blauwe pijl om naar het scherm van de classify spot te gaan. Klik in de grafiek onder aan het menu op de linkerrand van de gele drempel en sleep deze naar de linkerrand van de grafiek, zodat alle objecten worden opgenomen in de geel gearceerde drempel.

Klik vervolgens op de groene pijl om de spotcreatie te voltooien. Verkrijg het aantal geïdentificeerde objecten door op Statistieken te klikken. Klik vervolgens op Algemeen en klik ten slotte op Totaal aantal vlekken.

Klik op het gemaakte oppervlak en navigeer naar het tabblad Opmaakkwaliteit van oppervlakken. Wijzig de selectie in middelpunt en wijzig de pixelbreedte in minder dan gelijk aan 20 voor de beste zichtbaarheid. Navigeer naar Statistieken.

Klik vervolgens op Gedetailleerd, gevolgd door Positie en noteer de locatie op de middelste plek. Selecteer Nieuw referentiekader toevoegen in het menu boven de objectstructuur. Vink de zichtbare en vaste vakjes aan naast de X, Y in het menu.

Klik en sleep het midden van het referentiekaderpictogram zodanig dat het in lijn is met de middelste plek. Schakel de selectievakjes XY zichtbaar en fix uit en selecteer deze voor XZ. Klik nogmaals op het midden van het referentiekaderpictogram en sleep het zodanig dat het in lijn is met de middelste plek. Herhaal dit ten slotte voor het YZ-vlak, afwisselend tussen deze drie vaste vlakken totdat het referentiekader perfect uitlijnt met de middelste plek.

Dubbelklik op het referentiekader in de objectstructuur en wijzig de naam van het referentiekader of iets dergelijks. Klik op de gemaakte spots en navigeer naar Statistieken. Klik vervolgens op Gedetailleerd, gevolgd door Positie referentiekader.

Klik op positie X referentiekader totdat het sorteert van de hoogste naar de laagste waarde. Noteer de hoogste waarde om de straal van de aggregaten te verkrijgen. Voer handmatige berekeningen uit om extra interessante locaties te bepalen.

Voeg hiervoor 100 micrometer toe aan de X-centrumwaarde en gebruik vervolgens de Y- en Z-waarden van het middelpunt om de eerste locatie langs de middenas te definiëren. Selecteer Nieuwe spots toevoegen. Selecteer vervolgens Automatisch handmatig maken overslaan.

Houd de Shift-knop op het toetsenbord ingedrukt en klik ergens op het scherm om een nieuwe plek te plaatsen. Voer de XYZ-positiewaarden in voor de eerste interessante locatie. Selecteer vervolgens Nieuw referentiekader toevoegen en lijn het uit op de plek.

Voeg 100 micrometer toe aan elke opeenvolgende X-locatie. Plaats het laatste referentiekader op minder dan 50 micrometer afstand van de buitenradius van het monster. Klik op de gemaakte spots en navigeer naar Statistieken.

Klik in de rechterbenedenhoek van het menu op Alle statistieken exporteren naar bestand en sla gegevens op in een spreadsheet. Open de spreadsheet. Navigeer naar het tabblad Van het referentiekader voor oorsprong.

Gebruik de mod-functie om elke afstand numeriek toe te wijzen aan het bijbehorende referentiekader. Filter de waarden in deze kolom om te werken met de afstanden in elk referentiekader. Bereken voor elk van de referentiekaders het aantal objecten binnen 50 micrometer van het frame met behulp van de functie COUNTIF.

De resulterende waarde komt overeen met het aantal cellen in die regionale plug. Deel deze waarde door het volume van de 100 micrometer plug om de celdichtheid te verkrijgen. De T-tests van studenten onthulden een significant hogere celdichtheid in de sferoïde kern dan in de overgangs- en buitenlagen voor MDA-MB-231 sferoïde modellen.

Het resultaat duidt op verdichting in deze sferoïde kern na vier dagen. Binnen zowel AU565 als MDA-MB-231 aggregaatmodellen lijkt de toevoeging van de matrix geen invloed te hebben op het volume of het celgetal en lijkt dus een verwaarloosbare invloed te hebben op de celproliferatie. Integendeel, matrixtoevoeging lijkt de celdichtheid te herverdelen, waardoor een significante kernverdichting en afnemende celdichtheid in de buitenste lagen wordt bevorderd.

Deze bevindingen geven waardevol inzicht in de fysische mechanismen waarmee de matrix celaggregatie in verschillende borstkankercellijnen mogelijk maakt. Vervolgens kijkend naar AU565-tumoren sferoïde bereid met matrix, werden gerijpte aggregaten behandeld met trastuzumab en regionale celdichtheid werd geëvalueerd via een vijfdaags medicijnregime. Pluggen werden om de 100 micrometer geplaatst over de dikte van de aggregaten.

Kleine fluctuaties in celdichtheid werden in de loop van de tijd waargenomen binnen de binnenste 500 micrometer van elk aggregaat, wat wijst op minimale celdood. De visualisatie van celdood als indicatieve geneesmiddelrespons, meestal in de buitenste lagen van tumorsferoïden, is consistent met geneesmiddelenpenetratieproblemen van trastuzumab. We kunnen nu niet-destructief de levensvatbaarheid van cellen in aggregaten meten zonder de structuur op te offeren.

Dit maakt de beoordeling van longitudinale geneesmiddelrespons in enkelvoudige tumoraggregaten mogelijk om temporele en penetratiekwaliteiten van kandidaat-geneesmiddelen tegen kanker te identificeren.