Name: Fabricage en gebruik van droge macroporeuze alginaatsteigers voor virale transductie van T-cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Leer hoe je droge macroporeuze alginaatsteigers (Drydux) fabriceert en gebruikt voor efficiënte virale transductie van T-cellen. Deze methode biedt een eenvoudiger en goedkopere alternatief voor traditionele technieken in CAR-T celtherapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health via Grant Award Numbers R37-CA260223, R21CA246414. We danken de NCSU flowcytometriekern voor training en begeleiding bij flowcytometrie-analyse. Schema's zijn gemaakt met Biorender.com

Alle procedures met menselijke primaatcellen en retrovirale vectoren werden uitgevoerd in overeenstemming met de biologische veiligheidsrichtlijnen van de North Carolina State University en goedgekeurd door het Environmental Health and Safety Office. Menselijke perifere bloed mononucleaire cellen werden gekocht als buffy jassen van commerciële bronnen. Primaire menselijke cellen moeten worden geïsoleerd uit menselijke buffy vachtfracties en vereisen bioveiligheidsniveau 2-goedkeuring en gedetailleerde standaardwerkprocedures en goedkeuring van de instelling waar het werk zal plaatsvinden. Virale vectoren, met inbegrip van de retrovirale vectorsupernatanten die worden gebruikt voor de transductie die zijn bereid zoals eerder beschreven19, kunnen worden geclassificeerd als bioveiligheidsniveau 1 of bioveiligheidsniveau 2, afhankelijk van het gecodeerde eiwit en vereisen goedkeuring van het relevante institutionele bioveiligheidscomité.
1. Het maken van de macroporeuze alginaatsteigers
<ol><li>Bereid een stamoplossing van 0,4% (gewicht per volume) calcium D-gluconaat door steriel gefilterd gedeïoniseerd water toe te voegen aan calcium D-gluconaat in een bekerglas. Roer op gemiddelde snelheid totdat het calciumgluconaat is opgelost (~ 1,5 uur), steriel filter en bewaar bij kamertemperatuur. OPMERKING: Het is niet nodig om de pH van de oplossing te controleren.</li>
	<li>Bereid een oplossing van 2% (gewicht per volume) alginaat in een injectieflacon met schroefdop of bekerglas. Voeg voorzichtig het ultrazuivere alginaat toe aan het vat en voeg steriel gefilterd gedeïoniseerd water toe aan het alginaat. Kies de grootst mogelijke roerstaaf die het mengen niet belemmert en voeg deze toe aan het vat. OPMERKING: Informatie over het type ultrapuur alginaat dat voor dit protocol wordt gebruikt, is te vinden in de Tabel van Materialen en op de Novamatrix-website20. Verschillende alginaten werden niet onderzocht voor deze steigers, omdat ze kunnen leiden tot ongewenste veranderingen in porositeit en biocompatibiliteit van de steigers 9,10,11.</li>
	<li>Roer de oplossing op hoge snelheid totdat het alginaat oplost (~1 uur). Als er grote klonten aan de zijkanten van het vat zijn, kantel het vat dan om ze los te maken. Kleine hoeveelheden alginaat aan de zijkanten zullen oplossen tijdens het roeren en zijn geen reden tot bezorgdheid. OPMERKING: Het is niet nodig om de pH van de oplossing te controleren.</li>
	<li>Wanneer het alginaat oplost, verlaagt u de roersnelheid, voegt u langzaam een gelijk volume van 0,4% calcium D-gluconaat toe aan de alginaatoplossing om te voorkomen dat zich kruislingse klonten vormen en roer krachtig gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Kantel het bekerglas of de injectieflacon zijwaarts om eventuele klonten te verwijderen. OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een homogenisator te gebruiken. De uiteindelijke oplossing moet optisch duidelijk zijn.</li>
	<li>Pipetteer het gewenste volume van de oplossing in elke put van een 48-well plaat of 24-well plaat. Gebruik 300 μL/put voor een 48-well plaat en 1 mL/well voor een 24-well plaat. Werp langzaam en verander regelmatig van tip, omdat de oplossing stroperig zal zijn en aan de punt zal blijven plakken.</li>
	<li>Dek de borden af met deksels en vries ze een nacht in bij -20 °C.</li>
	<li>Bereid de plaat voor op de lyofilisator door het deksel te verwijderen en de bovenkant vast te zetten met doekjes en elastiekjes. Plaats de platen in 750 ml tot 2.000 ml lyofilisatorkolven en plaats deze gedurende 72 uur op de lyofilisator.</li>
	<li>Verwijder na 72 uur de plaat van de lyofilisator en vervang het deksel. Sluit de plaat af en bewaar bij 4 °C. Voor langdurige opslag, vacuümdicht de plaat voordat u deze bij 4 °C bewaart. Droog bewaren tot het nodig is. OPMERKING: Maak extra calcium-alginaatoplossing vanwege een volumefout (sommige kleven aan de wanden van de injectieflacon, pipetpunten). Om bijvoorbeeld vier steigers in een 24-wellsplaat te maken, is 4 ml gecombineerde oplossing (2 ml alginaat + 2 ml calcium D-gluconaat) vereist, maar het wordt aanbevolen om 2,5 ml 2% alginaatoplossing en 2,5 ml 0,4% calcium D-gluconaatoplossing te bereiden.</li>
</ol>2. Transductie
<ol><li>Concentratie van viraal supernatant met behulp van 100 kDa filters<ol><li>Hydrateer het centrifugaalfilter gedurende 2 minuten met 1 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Gooi de PBS weg.</li>
		<li>Concentreer de virale suspensie door 2 ml virale suspensie toe te voegen (1 × 106 TU / ml) en deze gedurende 10 minuten door het centrifugaalfilter te centrifugaalfilter bij 1.500 × g in een zwenkbakrotor. LET OP: Per steiger is één tot tweehonderd microliter geconcentreerd virus nodig.</li>
		<li>Draai nog een paar minuten als het geconcentreerde virussuspensievolume groter is dan 200 μL.</li>
		<li>Herhaal stap 2.1.1-2.1.3 voor elk schavot. OPMERKING: Het is ook acceptabel om een grote voorraad virus te concentreren en 100-200 μL aliquots uit de geconcentreerde voorraad te nemen.</li>
	</ol></li>
	<li>Zaad geactiveerde cellen en virus samen.<ol><li>Bereid voor elke scaffold een aliquot door 1 × 106 geactiveerde perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) te suspenseren in 50 μL volledige celkweekmedia (250 ml Click's media + 250 ml RPMI 1640 media + 50 ml foetaal runderserum + 5 ml glutaminevervanger + 5 ml penicilline / streptomycine). OPMERKING: Zie Aanvullend bestand 1 voor een protocol over het activeren van PBMC's.</li>
		<li>Voeg het geconcentreerde virale supernatant (~2 × 106 TU, MOI 2) toe aan de celsuspensie. Het totale volume van de celvirussuspensie mag niet hoger zijn dan 200 μL voor een scaffold van 48 putten of 350 μL voor een scaffold met 24 putten.</li>
		<li>Voeg het cel-virusmengsel druppelsgewijs toe aan de bovenkant van de droge steiger. Gebruik voor negatieve controle-experimenten complete celkweekmedia in plaats van het geconcentreerde virus. Voeg de celsuspensie toe aan de bovenkant van de droge steiger.</li>
		<li>Herhaal stap 2.2.1-2.2.3 voor elk schavot.</li>
		<li>Incubeer de steigers in een celkweekincubator bij 37 °C gedurende 45-60 min. Verwijder de steigers uit de incubator; de steigers zullen de oplossing gedurende deze tijd volledig absorberen.</li>
		<li>Om proliferatie te induceren, voegt u volledige celkweekmedia aangevuld met IL-15 (5 ng / ml) en IL-7 (10 ng / ml) toe aan elke put; IL-2 kan ook worden gebruikt. Voeg 500 μL toe aan elke 48-well scaffold of 1 mL aan elke 24-well scaffold.</li>
		<li>Incubeer de steigers bij 37 °C gedurende 72 uur. Naarmate de cellen zich vermenigvuldigen, zullen de media oranje worden.</li>
	</ol></li>
	<li>Isoleer cellen van de steigers voor analyse.<ol><li>Verdun 0,5 M EDTA tot 0,25 M EDTA in 1x PBS.</li>
		<li>Verwijder overtollig medium uit elke put en verzamel in afzonderlijke centrifugebuizen van 15 ml.</li>
		<li>Om cellen van de steiger te isoleren, voegt u 0,25 M EDTA toe aan elke steiger. Voeg 300 μL toe aan 48-well steigers of 1 ml aan 24-well steigers. Laat het bord 3-4 min zitten of voorzichtig roeren.</li>
		<li>Zodra de steiger grotendeels is opgelost, pipet u voorzichtig in en uit in de put. Een paar in-en-uit pipetteerstappen kunnen nodig zijn om de steiger volledig op te lossen. Als het niet binnen 10 minuten oplost, voeg dan nog eens 200 μL van 0,25 M EDTA toe.</li>
		<li>Zodra de steiger volledig is opgelost, brengt u de oplossing over naar een centrifugebuis van 15 ml.</li>
		<li>Herhaal stap 2.3.4 en 2.3.5 voor elk schavot.</li>
		<li>Was de cellen tweemaal door 12 ml PBS aan elke centrifugebuis toe te voegen en gedurende 5 minuten te centrifugeren met 400 × g . Aan de onderkant van elke buis vormt zich een celpellet. Aspirateer het supernatant en herhaal de was. Zorg ervoor dat u het supernatant bij elke wasbeurt volledig aspirateert, omdat het cruciaal is om alle EDTA te verwijderen.</li>
		<li>Na de tweede wasbeurt met PBS is de celpellet nu klaar voor analyse. Volg het juiste protocol dat vereist is voor de analyse.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Prinzing, B. L., Gottschalk, S. M., Krenciute, G. C. A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+therapy+for+glioblastoma%3A+ready+for+the+next+round+of+clinical+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Anticancer+Therapy%22%5BJournal%5D)">T-cell therapy for glioblastoma: ready for the next round of clinical testing.</a> Expert Review of Anticancer Therapy. 18 (5), 451-461 (2018).</li>
<li>Bagley, S. J., Desai, A. S., Linette, G. P., June, C. H., O'Rourke, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T-cell+therapy+for+glioblastoma%3A+recent+clinical+advances+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-oncology%22%5BJournal%5D)">CAR T-cell therapy for glioblastoma: recent clinical advances and future challenges.</a> Neuro-oncology. 20 (11), 1429-1438 (2018).</li>
<li>Nair, R., Westin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">CAR T cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1342, 297-317 (2021).</li>
<li>Jackson, H. J., Rafiq, S., Brentjens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Driving+CAR+T-cells+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Driving CAR T-cells forward.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 13 (6), 370-383 (2016).</li>
<li>Sterner, R. C., Sterner, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cell+therapy%3A+current+limitations+and+potential+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+Journal%22%5BJournal%5D)">CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies.</a> Blood Cancer Journal. 11 (4), 69(2021).</li>
<li>Miliotou, A. N., Papadopoulou, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T-cell+therapy%3A+A+new+era+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CAR T-cell therapy: A new era in cancer immunotherapy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 19 (1), 5-18 (2018).</li>
<li>Lee, H. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retronectin+enhances+lentivirus-mediated+gene+delivery+into+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%3A+Journal+of+the+International+Association+of+Biological+Standardization%22%5BJournal%5D)">Retronectin enhances lentivirus-mediated gene delivery into hematopoietic progenitor cells.</a> Biologicals: Journal of the International Association of Biological Standardization. 37 (4), 203-209 (2009).</li>
<li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+in+human+primary+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57(2021).</li>
<li>Sun, J., Tan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate-based+biomaterials+for+regenerative+medicine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Alginate-based biomaterials for regenerative medicine applications.</a> Materials. 6 (4), 1285-1309 (2013).</li>
<li>Nayak, A. K., Mohanta, B. C., Hasnain, M. S., Hoda, M. N., Tripathi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+14+-+Alginate-based+scaffolds+for+drug+delivery+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Alginates+in+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Chapter 14 - Alginate-based scaffolds for drug delivery in tissue engineering.</a> Alginates in Drug Delivery. , 359-386 (2020).</li>
<li>Lee, K. Y., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate%3A+properties+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Alginate: properties and biomedical applications.</a> Progress in Polymer Science. 37 (1), 106-126 (2012).</li>
<li>Kuo, C. K., Ma, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionically+crosslinked+alginate+hydrogels+as+scaffolds+for+tissue+engineering%3A+part+1.+Structure%2C+gelation+rate+and+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Ionically crosslinked alginate hydrogels as scaffolds for tissue engineering: part 1. Structure, gelation rate and mechanical properties.</a> Biomaterials. 22 (6), 511-521 (2001).</li>
<li>Soccol, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+nondairy+beverages%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Plant-Based+Fermented+Food+and+Beverage+Technology%2C+Second+Edition%22%5BJournal%5D)">Probiotic nondairy beverages.</a> Handbook of Plant-Based Fermented Food and Beverage Technology, Second Edition. , 707-728 (2012).</li>
<li>Moody, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoring+carboxylates+on+highly+modified+alginates+improves+gelation%2C+tissue+retention+and+systemic+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Restoring carboxylates on highly modified alginates improves gelation, tissue retention and systemic capture.</a> Acta Biomaterialia. 138, 208-217 (2022).</li>
<li>Brudno, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replenishable+drug+depot+to+combat+post-resection+cancer+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Replenishable drug depot to combat post-resection cancer recurrence.</a> Biomaterials. 178, 373-382 (2018).</li>
<li>Moody, C. T., Palvai, S., Brudno, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+cross-linking+improves+retention+and+targeting+of+refillable+alginate+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Click cross-linking improves retention and targeting of refillable alginate depots.</a> Acta Biomaterialia. 112, 112-121 (2020).</li>
<li>Agarwalla, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-mediated+static+transduction+of+T+Cells+for+CAR-T+Cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Scaffold-mediated static transduction of T Cells for CAR-T Cell therapy.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (14), 2000275(2020).</li>
<li>Agarwalla, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinstructive+implantable+scaffolds+for+rapid+in+vivo+manufacture+and+release+of+CAR-T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bioinstructive implantable scaffolds for rapid in vivo manufacture and release of CAR-T cells.</a> Nature Biotechnology. 40 (8), 1250-1258 (2022).</li>
<li>Vera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocytes+redirected+against+the+kappa+light+chain+of+human+immunoglobulin+efficiently+kill+mature+B+lymphocyte-derived+malignant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">T lymphocytes redirected against the kappa light chain of human immunoglobulin efficiently kill mature B lymphocyte-derived malignant cells.</a> Blood. 108 (12), 3890-3897 (2006).</li>
<li>PRONOVA UP MVG. IFF Nutrition Norge AS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/">https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/</a> (2022).</li>
<li>Zappasodi, R., Budhu, S., Abu-Akeel, M., Merghoub, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assays+for+effector+T+cell+functions+and+activity+of+immunomodulatory+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">In vitro assays for effector T cell functions and activity of immunomodulatory antibodies.</a> Methods in Enzymology. 631, 43-59 (2020).</li>
<li>Kong, B. S., Lee, C., Cho, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+assessment+of+human+T+cell+activation+by+real-time+metabolic+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for the assessment of human T cell activation by real-time metabolic flux analysis.</a> STAR Protocols. 3 (1), 101084(2022).</li>
<li>Bio-Rad cell activation protocols. Bio-Rad. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24. ecommerce2&evCntryLang=US-en&cntry= US&thirdPartyCookieEnabled=true">https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24. ecommerce2&evCntryLang=US-en&cntry= US&thirdPartyCookieEnabled=true</a> (2022).</li>
<li>Lin, H. -R., Yeh, Y. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+alginate%2Fhydroxyapatite+composite+scaffolds+for+bone+tissue+engineering%3A+Preparation%2C+characterization%2C+andin+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Porous alginate/hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering: Preparation, characterization, andin vitro studies.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 71 (1), 52-65 (2004).</li>
<li>Wu, J., Zhao, Q., Sun, J., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+poly%28ethylene+glycol%29+aligned+porous+cryogels+using+a+unidirectional+freezing+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Preparation of poly(ethylene glycol) aligned porous cryogels using a unidirectional freezing technique.</a> Soft Matter. 8 (13), 3620(2012).</li>
</ol>

P.A. en Y.B. zijn uitvinders van patenten met betrekking tot het gebruik van biomaterialen voor het genereren van CAR-T-celtherapieën. Y.B. ontvangt een door de industrie gesponsorde onderzoekssubsidie met betrekking tot CAR-T-celtherapeutische technologie (niet gerelateerd aan dit werk). Alle andere auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.

CAR-T-celtherapie blijft interesse wekken voor zowel onderzoek als commerciële toepassingen. Ondanks het succes dat CAR-T-celtherapie heeft gehad bij de behandeling van bloedkankers, beperken de hoge kosten van de procedure het gebruik ervan. Het hier gepresenteerde protocol introduceert een nieuwe methode voor virale genoverdracht van T-cellen zonder de noodzaak van spinoculatie van retronectine-gecoate platen. Het produceren van droge macroporeuze alginaatsteigers om transductie te bemiddelen is relatief eenvoudig en i...

Immunotherapie is naar voren gekomen als een revolutionair paradigma voor de behandeling van kanker vanwege het vermogen om zich specifiek op tumoren te richten, off-target cytotoxiciteit te beperken en terugval te voorkomen. Met name chimere antigeenreceptor T (CAR-T) celtherapie heeft aan populariteit gewonnen vanwege het succes bij de behandeling van lymfomen en leukemieën. De FDA keurde de eerste CAR-T-celtherapie in 2017 goed en heeft sindsdien nog vier CAR-T-celtherapieëngoedgekeurd 1,2,3,4,5. CARs hebben een antigeenherkenningsdomein dat meestal bestaat uit een enkelketenvariabel fragment van een monoklonaal antilichaam dat specifiek is voor een tumorgeengeassocieerd antigeen 3,4. Wanneer een CAR interageert met zijn tumor-geassocieerde antigeen, worden de CAR-T-cellen geactiveerd, wat leidt tot een antitumorrespons met cytokine-afgifte, cytolytische degranulatie, transcriptiefactorexpressie en T-celproliferatie. Om CAR-T-cellen te produceren, wordt bloed verzameld van de patiënt om hun T-cellen te verkrijgen. CARs worden genetisch toegevoegd aan de T-cellen van de patiënt met behulp van een virus. De CAR-T-cellen worden in vitro gekweekt en terug toegediend aan patiënt 2,3,4,6. Succesvolle generatie van CAR-T-cellen wordt bepaald door de transductie-efficiëntie, die het aantal T-cellen beschrijft dat genetisch is gemodificeerd tot CAR-T-cellen.
Momenteel is de gouden standaard voor CAR-T-celgeneratie spinoculatie van geactiveerde T-cellen en virus op retronectine-gecoate platen 7,8. Transductie begint wanneer virale deeltjes zich bezighouden met het oppervlak van de T-cellen. Retronectine bevordert de colocalisatie van virus en cellen door de bindingsefficiëntie tussen de virale deeltjes en de cellen te verhogen, waardoor de transductie wordt verbeterd 7,8. Retronectine werkt op zichzelf niet goed en moet gepaard gaan met spinoculatie, wat de genoverdracht verbetert door de virale deeltjes te concentreren en de oppervlaktedoorlaatbaarheid van de T-cel te vergroten, waardoor virale infectie gemakkelijkerwordt 8. Ondanks het succes van spinoculatie op retronectine-gecoate platen, is het een complex proces dat meerdere spincycli en dure reagentia vereist. Daarom zijn alternatieve methoden voor virale genoverdracht die sneller en goedkoper zijn, zeer wenselijk.
Alginaat is een natuurlijke anionische polysaccharide die op grote schaal wordt gebruikt in de biomedische industrie vanwege de lage kosten, het goede veiligheidsprofiel en het vermogen om hydrogels te vormen bij het mengen met tweewaardige kationen 9,10,11,12. Alginaat is een GMP-conform polymeer en wordt algemeen erkend als veilig (GRAS) door de FDA13. Cross-linking alginaat met kationen creëert stabiele hydrogels die vaak worden gebruikt bij wondgenezing, levering van kleine chemische geneesmiddelen en eiwitten en celtransport 9,10,11,12,14,15,16. Vanwege de uitstekende geleereigenschappen is alginaat het voorkeursmateriaal om poreuze steigers te creëren door10,17 te vriesdrogen. Deze kenmerken van alginaat maken het een aantrekkelijke kandidaat voor het produceren van een steiger die virale genoverdracht van geactiveerde cellen kan bemiddelen.
Hier beschreven is een protocol voor het maken van droge macroporeuze alginaatsteigers, bekend als Drydux-steigers, die T-cellen statisch transduceren door virale genoverdracht17,18. Het proces voor het maken van deze steigers is weergegeven in figuur 1. Deze steigers elimineren de noodzaak van spinoculatie van retronectine-gecoate platen. De macroporeuze alginaatsteigers moedigen de interactie van virale deeltjes en T-cellen aan om efficiënte genoverdracht in één stap mogelijk te maken zonder de functionaliteit en levensvatbaarheid van de gemanipuleerde T-cellen te beïnvloeden17. Indien correct gevolgd, hebben deze macroporeuze alginaatsteigers een transductie-efficiëntie van ten minste 80%, waardoor het virale transductieproces wordt vereenvoudigd en verkort.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64036/64036fig01v2.jpg"> Figuur 1: Schema en tijdlijn van het protocol. (A) Tijdlijn voor het maken van de droge macroporeuze alginaatsteigers. Alginaat is verknoopt met calcium-D-gluconaat en wordt 's nachts ingevroren. De bevroren steigers worden gedurende 72 uur gelyofiliseerd om de Drydux-steigers te creëren. (B) Tijdlijn voor virale transductie van geactiveerde cellen. Geactiveerde cellen en virussen (MOI 2) worden bovenop de steiger gezaaid en geïncubeerd in volledige media aangevuld met IL-7 en IL-15. De steigers absorberen het mengsel en bevorderen de virale genoverdracht. EDTA wordt gebruikt om de steigers op te lossen en de getransduceerde cellen te isoleren. Na twee keer wassen met PBS kan de celpellet worden gebruikt voor analyse. Afkortingen: PBS = fosfaat-gebufferde zoutoplossing; PBMC's = perifere mononucleaire bloedcellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64036/64036fig01largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>UltraPure, pH 8.0</td></tr><tr><td>1x DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Geen calciumchloride of magnesiumchloride</td></tr><tr><td>3% Azijnzuur met Methyleenblauw</td><td>Stemcell Technologies Inc</td><td>07060</td><td></td></tr><tr><td>Geactiveerde perifere mononucleaire bloedcellen</td><td>-</td><td>-</td><td>Frisse of bevroren</td></tr><tr><td>Calcium-D-Gluconaat</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11649</td><td></td></tr><tr><td>CD28.2 Antilichaam</td><td>BD</td><td>555725</td><td>1 mg/mL</td></tr><tr><td>CD3 Antilichaam</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-387</td><td>100 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>Click's Media</td><td>FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS</td><td>9195</td><td></td></tr><tr><td>DI Water</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35-050-061</td><td></td></tr><tr><td>HyClone FBS</td><td>Cytvia</td><td>SH3039603</td><td></td></tr><tr><td>HyClone RPMI 1640 Media</td><td>Cytvia</td><td>SH3009601</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine (P/S)</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Perifere mononucleaire bloedcellen</td><td>-</td><td>-</td><td>Frisse of bevroren</td></tr><tr><td>PRONOVA UP MVG</td><td>NovaMatrix</td><td>4200101</td><td>Natriumalginaat</td></tr><tr><td>Recombinant humaan IL-15</td><td>Peprotech</td><td>200-15</td><td>5 ng/mL</td></tr><tr><td>Recombinant humaan IL-7</td><td>Peprotech</td><td>200-07</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>Retrovirus</td><td>-</td><td>-</td><td>1 x 106 TU/mL</td></tr></tbody></table>

fabricage en gebruik van droge macroporeuze alginaatsteigers voor virale transductie van t-cellen

Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells

Genetische manipulatie van T-cellen voor CAR-T-celtherapie is de afgelopen jaren op de voorgrond van de behandeling van kanker gekomen. CAR-T-cellen worden geproduceerd door virale genoverdracht naar T-cellen. De huidige gouden standaard van virale genoverdracht omvat spinoculatie van retronectine-gecoate platen, wat duur en tijdrovend is. Er is een aanzienlijke behoefte aan efficiënte en kosteneffectieve methoden om CAR-T-cellen te genereren. Hier beschreven is een methode voor het fabriceren van goedkope, droge macroporeuze alginaatsteigers, bekend als Drydux-steigers, die efficiënt virale transductie van geactiveerde T-cellen bevorderen. De steigers zijn ontworpen om te worden gebruikt in plaats van gouden standaard spinoculatie van retronectine-gecoate platen bezaaid met virus en vereenvoudigen het proces voor het transduceren van cellen. Alginaat wordt verknoopt met calcium-D-gluconaat en 's nachts ingevroren om de steigers te creëren. De bevroren steigers worden gedurende 72 uur gevriesdroogd in een lyofilisator om de vorming van de droge macroporeuze steigers te voltooien. De scaffolds bemiddelen virale genoverdracht wanneer virus- en geactiveerde T-cellen samen bovenop de steiger worden gezaaid om genetisch gemodificeerde cellen te produceren. De steigers produceren >85% primaire T-celtransductie, wat vergelijkbaar is met de transductie-efficiëntie van spinoculatie op retronectine-gecoate platen. Deze resultaten tonen aan dat droge macroporeuze alginaatsteigers dienen als een goedkoper en handiger alternatief voor de conventionele transductiemethode.

Deze macroporeuze alginaatsteigers zijn gemakkelijk te maken en moeten uit de lyofilisator komen als poreuze, donzige en witte schijven. Hoewel niet bestudeerd in dit experiment, kan calcium-alginaatoplossing in verschillende mallen worden gegoten om steigers van verschillende vormen te creëren, afhankelijk van de behoeften van de gebruiker 9,10. De steigers zijn elektrostatisch en kunnen aan het deksel van de putplaat of aan een gehandschoende vinger kleven. <st...

Hierin is een protocol voor het maken van droge macroporeuze alginaatsteigers die efficiënte virale genoverdracht bemiddelen voor gebruik bij genetische manipulatie van T-cellen, inclusief T-cellen voor CAR-T-celtherapie. De scaffolds bleken geactiveerde primaire T-cellen te transduceren met >85% transductie.

Fabricage en gebruik van droge macroporeuze alginaatsteigers voor virale transductie van T-cellen

Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by ...

Beschreven in deze video is een protocol voor het maken en gebruiken van droge macroporeuze alginaatsteigers bekend als Drydux die efficiënt de transductie van geactiveerde T-cellen bevorderen. Drydux is ontworpen om te worden gebruikt in plaats van gouden standaard spinoculatie van RetroNectin-gecoate platen bezaaid met virus en vereenvoudigt het proces voor het transduceren van cellen. Drydux heeft een transductie-efficiëntie vergelijkbaar met spinoculatie op RetroNectin-gecoate platen en dient als een goedkoper en handiger alternatief voor de conventionele transductiemethode.Bereid eerst een 0,4% oplossing van calcium-D-gluconaat. Voeg steriel gefilterd DI-water toe aan calcium-D-gluconaat in een bekerglas. Roer op gemiddelde snelheid totdat het calcium-D-gluconaat is opgelost, wat ongeveer 1 1/2 uur duurt.Eenmaal opgelost, steriel filter de calcium-D-gluconaatoplossing. Deze oplossing kan bij kamertemperatuur worden bewaard. Bereid vervolgens een 2% alginaatoplossing.Dit kan worden bereikt met behulp van een injectieflacon met schroefdop of een bekerglas. Beide zullen hier worden getoond. Voeg voorzichtig het ultrazuivere alginaat toe aan het vat.Voeg de juiste hoeveelheid DI-water toe aan het alginaat. Kies de grootst mogelijke roerstaaf die het mengen niet belemmert en voeg deze toe aan het vat. Roer de oplossing op hoog totdat het alginaat oplost, wat ongeveer een uur duurt.Als er grote alginaatklonten aan de zijkant van het vat zijn, kantel het vat dan zijwaarts om ze los te maken. Kleine klontjes lossen in de loop van het uur op en zijn geen reden tot bezorgdheid. Zodra de 2% alginaatoplossing is opgelost, verlaagt u de roersnelheid.Voeg langzaam een gelijk volume van de calcium-D-gluconaatoplossing toe aan de alginaatoplossing. Door het langzaam toe te voegen, wordt voorkomen dat er zich kruislingse klonten vormen. Wanneer de calciumgluconaatoplossing is toegevoegd, verhoogt u de roersnelheid en roert u krachtig gedurende 15 minuten.Kantel het vat zijwaarts om eventuele klonten te verwijderen. Nadat u gedurende 15 minuten krachtig hebt geroerd, moet u ervoor zorgen dat er geen klonten in de oplossing zitten. Pipetteer de oplossing in een 48- of 24-wellsplaat.Voor een plaat met 48 putten pipet u 300 microliter in elke put. Zorg ervoor dat je langzaam werpt en vaak van tip wisselt, omdat de oplossing stroperig is en aan de punt kan blijven plakken. Voor een plaat met 24 putten pipetteer je één milliliter in elke put.Nogmaals, werp langzaam en verander vaak van pipettip. Bedek de putplaten met een deksel en vries 's nachts in op negatief 20 graden Celsius. Bereid de platen voor op de lyofilisator door de deksels te verwijderen en de bovenkant vast te zetten met doekjes en elastiekjes.Plaats de platen in de buis van de lyofilisator en zet de lyofilisator 72 uur op. Verwijder na 72 uur de plaat uit de lyofilisator. De steigers zijn nu klaar om gebruikt te worden voor transductie.Als u de steigers niet onmiddellijk gebruikt, sluit u de plaat af met Parafilm en bewaart u deze bij vier graden Celsius totdat deze nodig is. Voor langdurige opslag wordt aanbevolen om de plaat vacuüm af te dichten naast het afdichten met Parafilm. Concentraat viraal supernatant door twee milliliter virale oplossing te centrifugeren door een centrifugaalfilter op 1.500 g gedurende 10 minuten.Per steiger is 100 tot 200 microliter geconcentreerd virus nodig. Draai nog een paar minuten als het volume van de geconcentreerde virusoplossing groter is dan 200 microliter. Maak voor elke steiger een aliquot van 1 miljoen geactiveerde T-cellen gesuspendeerd in 50 microliter complete celkweekmedia.Voeg het geconcentreerde virus toe aan de celsuspensie. Het totale volume van de celvirussuspensie mag niet groter zijn dan 200 microliter voor een steiger met 48 putten, of 350 microliter voor een steiger met 24 putten. Voeg het celvirusmengsel druppelsgewijs toe aan de bovenkant van de droge steiger.Gebruik voor negatieve controle-experimenten complete celkweekmedia in plaats van geconcentreerd virus. Voeg deze celsuspensie toe aan de bovenkant van de droge steiger. Incubeer de steigers in de celkweekincubator bij 37 graden Celsius gedurende 45 tot 60 minuten.Verwijder de steigers uit de couveuse. De steigers moeten de oplossing gedurende deze tijd volledig absorberen. Om proliferatie te induceren, voegt u volledige celkweekmedia aangevuld met IL-7 en IL-15 toe aan elke put.IL-2 kan ook worden gebruikt. Voeg voor een steiger met 24 putten één milliliter toe. Voeg voor een steiger met 48 putten 500 microliter toe.Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 72 uur. De cellen zullen zich gedurende de 72 uur vermenigvuldigen, waardoor de media oranje kunnen worden. Verwijder overtollige media uit elke put.Om cellen van de steiger te isoleren, voegt u 0,25 molaire EDTA-oplossing toe aan elke steiger. Voeg een milliliter toe voor 24-well scaffolds, of 300 microliter voor 48-well scaffolds. Laat het bord zitten of roer zachtjes gedurende drie tot vier minuten.Eenmaal grotendeels opgelost, pipetteer in en uit voorzichtig in de put. Een paar in- en uitpipeterende stappen kunnen nodig zijn om de steiger volledig op te lossen. Breng de oplossing over in een centrifugebuis van 15 milliliter.Was de cellen twee keer met PBS. Voeg 12 milliliter PBS toe aan elke centrifugebuis. Centrifugeer op 400 g gedurende vijf minuten.Een celpellet vormt zich aan de onderkant van de buis. Aspirateer de supernatantoplossing en herhaal de was. Wees voorzichtig om supernatant volledig te verwijderen bij elke wasbeurt, omdat het cruciaal is om alle EDTA te verwijderen.Na een tweede keer wassen met PBS is de celpellet klaar voor analyse. Flowcytometrie werd gebruikt om de transductie-efficiëntie van elke groep te bepalen. Niet-getransduceerde cellen werden gebruikt als een negatieve controle en vertoonden geen transductie.Cellen gezaaid op steigers zonder GFP retrovirus vertoonden ook geen transductie. De Drydux-groep, die geactiveerde cellen had gezaaid op de droge macroporeuze alginaatsteigers, vertoonde 85% transductie, net lager dan de RetroNectin-groep. Deze resultaten tonen aan dat Drydux-steigers effectief cellen transduceerden door retrovirale genoverdracht zonder de noodzaak van spinoculatie van RetroNectine-gecoate platen.Drydux-steigers vertonen een hoge transductie-efficiëntie vergelijkbaar met RetroNectin en bieden een alternatieve methode voor het transduceren van T-cellen. Vanwege de lage productiekosten van de Drydux-steigers heeft dit proces het potentieel om de kosten van CAR T-celtherapieën aanzienlijk te verlagen.

fabrication-use-dry-macroporous-alginate-scaffolds-for-viral

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

This video demonstrates the procedure of extracellular matrix-derived microcarrier fabrication by electrospraying. These microcarriers simulate the native tissue-specific microenvironment and are stable in long-term 3D in vitro cell culture models.

Bioscaffold Fabrication by Electrospraying: A Technique to Generate Microcarrier Scaffolds Derived from Extracellular Matrix of Decellularized Tissue

Het doel van dit protocol is om pathogeen-specifieke klinische graad T-cellen te produceren met behulp van een tafelblad, geautomatiseerde, tweede generatie celverrijkingsapparaat dat een gesloten cytokine-opvangsysteem bevat en geen toegewijd personeel of gebruik van een GMP-faciliteit vereist. De gegenereerde cytomegalovirus pp65-specifieke T-cellen kunnen direct aan patiënten worden toegediend.

Geautomatiseerde Cel Verrijking van Cytomegalovirus-specifieke T-cellen voor klinische toepassingen met het cytokine-beeldverwerkingssysteem

Injecteerbare tissue engineering scaffold uit poly (N-isopropylacrylamide) -graft-chondroïtinesulfaat (PNIPAAm-g-CS) bevattende alginaat microdeeltjes bereid. De hechtsterkte, zwelvermogen en in vitro biocompatibiliteit geanalyseerd in deze studie. De karakterisering technieken die hier ontwikkeld kan van toepassing zijn op andere thermogelling systemen.

Synthese van Thermogelling Poly (N-isopropylacrylamide) -graft-chondroïtinesulfaat Composites met Alginaatmicrodeeltjes voor Tissue Engineering

Hier presenteren we een protocol om te visualiseren bloedvat vorming in vivo en in real-time in 3D steigers door multiphoton microscopie. Angiogenese in genetisch gemodificeerde steigers werd bestudeerd in een lymfkliertest calvarial kritische bot defect model. Meer nieuwe bloedvaten werden ontdekt in de behandelde groep dan in besturingselementen.

Visualiseren van angiogenese door Multiphoton microscopie In Vivo in genetisch gemodificeerde 3D-PLGA/nHAp steiger voor Calvarial kritische bot Defect reparatie

Het weefsel-specifieke extracellulaire matrix (ECM) is een sleutelmediator van celfunctie. Dit artikel beschrijft werkwijzen voor het synthetiseren van zuiver ECM afgeleide schuimen en microdragers die stabiel in cultuur zonder de noodzaak voor chemische verknoping voor toepassingen in geavanceerde 3D in vitro celkweekmodellen of pro-regeneratieve bioscaffolds.

Fabricage van extracellulaire matrix-afgeleide schuimen en microdragers Weefsel-specifieke Cell Cultuur en Delivery Platforms

Dit protocol beschrijft de fabricage van elastische 3D macroporeuze microcryogels door de integratie van microfabrication met cryogelation-technologie. Bij het laden met cellen, worden 3D-microtissues gegenereerd, die kan gemakkelijk ingespoten in vivo om regeneratieve therapie of geassembleerd tot arrays voor in vitro high-throughput drug screening.

3D Microtissues voor injecteerbare regeneratieve therapie en High-throughput Drug Screening

Dit protocol beschrijft een platform voor het fabriceren van zelf geassembleerde weefsel ringen in verschillende afmetingen met behulp van een aangepaste 3D-gedrukte kunststof schimmel. PDMS negatieven worden genezen in de 3D-gedrukte mal; vervolgens is agarose gegoten in de uitgeharde PDMS negatieven. Cellen worden overgeënt in de resulterende agarose putten waar ze in weefsel ringen aggregaat.

Fabricage van aangepaste Agarose putten voor het zaaien van de cellen en weefsel Ring zelf-assemblage met behulp van 3D-gedrukte mallen

Hier presenteren we een protocol voor het snel en reproducibly genereren van biologisch geïnspireerde, biologisch afbreekbare articifical antigeen presentatie van cellen (aAPC) met afstembare grootte, vorm en oppervlakte-proteïne presentatie voor T cel expansie ex vivo of in vivo .

Fabricage van anisotrope polymere kunstmatige antigeen presentatie van cellen voor CD8 + T cel activatie

Gepresenteerd hier is een eenvoudig te gebruiken, Core/shell, driedimensionale bioprinten set-up voor één stap fabricage van holle steigers, geschikt voor weefsel engineering van vasculaire en andere buisvormige structuren.

Kern/shell druk steigers voor weefsel engineering van buisvormige constructies

Microgelstaven met complementaire reactieve groepen worden geproduceerd via microfluïdica met het vermogen om in waterige oplossing met elkaar te verbinden. De anisometrische microgels binden en verbinden zich tot stabiele constructies met grotere poriën in vergelijking met op bolvormige systemen gebaseerde systemen. Microgels gemodificeerd met GRGDS-PC vormen macroporeuze 3D-constructies die kunnen worden gebruikt voor celkweek.

Onderling verbonden macroporeuze 3D-steigers van Microgel-staven

Leer hoe je droge macroporeuze alginaatsteigers (Drydux) fabriceert en gebruikt voor efficiënte virale transductie van T-cellen. Deze methode biedt een eenvoudiger en goedkopere alternatief voor traditionele technieken in CAR-T celtherapie.

Fabricage en gebruik van droge macroporeuze alginaatsteigers voor virale transductie van T-cellen

Meer video's verkennen