Name: Milliseconde waterstof/deuterium-uitwisseling massaspectrometrie voor de studie van alfa-synucleïne structurele dynamica onder fysiologische omstandigheden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Leer milliseconde waterstof/deuterium-uitwisseling massaspectrometrie voor de studie van alfa-synucleïne structurele dynamica onder fysiologische omstandigheden. Deze methode biedt inzicht in conformatieveranderingen van intrinsiek ongeordende eiwitten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NS wordt gefinancierd door de Universiteitsraad Diamond Jubilee Scholarship. JJP wordt ondersteund door een UKRI Future Leaders Fellowship [Subsidienummer: MR/T02223X/1].

1. Eiwitexpressie en zuivering van aSyn
<ol><li>Bereid aSyn voor naar aanleiding van een eerder gepubliceerd rapport9.</li>
	<li>Dialyseren in een veilige opslagbuffer (bijv. Tris, pH 7,2 ).</li>
	<li>Concentreer het monster indien nodig (bijv. spinfiltermicrocentrifugebuizen met 3 kDa MWCO, 14.000 x g gedurende ongeveer 10-30 minuten, zie materiaaltabel). OPMERKING: Het wordt geadviseerd om niet overmatig te concentreren. De integriteit van het monomeerensemble is niet geverifieerd boven 25 μM.</li>
	<li>Aliquot en bewaren bij −80 °C OPMERKING: Het aSyn monomeer eiwit is stabiel voor maximaal 1 jaar in deze opslagomstandigheden.</li>
</ol>2. HDX buffer voorbereiding
OPMERKING: Aangezien Tris een hoge temperatuurcoëfficiënt heeft, moet de pH-meting worden aangepast aan de temperatuur waarbij de HDX-reactie zal worden uitgevoerd, wat in dit protocol 20 °C is.
<ol><li>Bereid evenwichtsbuffer voor toestand A en toestand B voor door 0,002 mol Tris te wegen in 100 ml water van LC-MS-kwaliteit. Voeg voor toestand B 29,8 mg KCl, 14,2 mg MgCl2, 36,8 g CaCl2 en 836 mg NaCl toe aan de Tris-buffer. Stel de pH in op 7,40 ± 0,05. OPMERKING: De evenwichtsbuffer moet de omstandigheden bevatten waaronder aSyn moet worden bestudeerd. In dit geval gaat het om 20 mM Tris bij pH 7,4 +/− zouten.</li>
	<li>Bereid de etiketteringsbuffer voor toestand A en toestand B voor door 0,002 mol Tris in 100 ml gedeutereerd water te wegen. Voeg voor toestand B 29,8 mg KCl, 14,2 mg MgCl2, 36,8 g CaCl2 en 836 mg NaCl toe aan de Tris-etiketteringsbuffer. De pD van de etiketteringsbuffer komt overeen met de pH van de evenwichtsbuffer. Aangezien pH = pD - 0,41, zo instellen dat de pH-meter 6,99 ± 0,0523,24. OPMERKING: De etiketteringsbuffer moet dezelfde componenten hebben als de evenwichtsbuffer, behalve dat deze wordt bereid met gedeutereerd water.</li>
	<li>Bereid de blusbuffer voor door 0,010 mol Tris en 0,050 mol ureum af te wegen en vul aan tot 100 ml met water van LC-MS-kwaliteit. Stel de pH in op 2,50 ± 0,05 bij 0,5 °C. OPMERKING: Voorafgaand aan HDX-experimenten moet een quenchbufferscherm worden uitgevoerd om de beste quenchbuffer voor het eiwit van belang te identificeren. Verschillende concentraties en combinaties van denaturanten (bijv. ureum en guanidiniumhydrochloride) en reductiemiddelen (bijv. Tris (2-carboxyethyl)fosfine) worden gescreend, samen met fysieke parameters zoals vangvolume en temperatuur, om het gebluste eiwit effectief te ontvouwen en te verteren. Een blusbuffer bestaande uit 100 mM Tris en 0,5 M ureum bij een pH van 2,50 is optimaal voor dit onderzoek.</li>
	<li>Bereid de wasbuffer van de verteringskolom voor door 0,125 mol guanidiniumhydrochloride in een glazen fles van Duran te wegen. Voeg 25 ml methanol en 250 μl mierenzuur toe. Maak tot 250 ml met water van LC-MS-kwaliteit. OPMERKING: Gebruik voor de Enzymate BEH pepsinekolom (zie Tabel met materialen) een kolomwasbuffer van 0,5 M guanidiniumhydrochloride, 10% (v/v) methanol en 0,1% (v/v) mierenzuur.</li>
	<li>Bereid de zwakke wassing van de spuit voor door 0,5 μL mierenzuur te pipetteren in 249,5 ml water van LC-MS-kwaliteit.</li>
	<li>Bereid de spuit sterke was voor door gelijke delen water van LC-MS-kwaliteit, methanol, acetonitril en isopropanol te mengen. Voeg mierenzuur toe aan een uiteindelijke concentratie van 2% (v/v). OPMERKING: Om kruisbesmetting tussen de verschillende buffers en het eiwit te voorkomen en om reiniging van de injectiepoort mogelijk te maken, is het van cruciaal belang dat spuitwasoplossingen worden bereid en dat het stroompad naar de klep (vaak de "wasvoering" genoemd) volledig is geprimed met vloeistof. Het mierenzuur is optioneel voor de zwakke wassing van de spuit.</li>
</ol>3. Peptide mapping procedure
<ol><li>Bereid het voorbeeld voor volgens de onderstaande stap.<ol>
<li>Filter ontdooide aSyn eiwitvoorraad uit de −80 °C vriezer met 0,22 μm spuitfilters. Meet de absorptie van het gefilterde voorraadeiwit bij 280 nm om de concentratie volgens de Beer-Lambert-wet te bepalen. Verdun het eiwit tot een concentratie van 5 μM in de evenwichtsbuffer (stap 2.1.). OPMERKING: De beer-lambertuswet: A = εcl, waarbij A absorptie is, ε de extinctiecoëfficiënt is van het eiwit op de gemeten golflengte (280 nm hier) met eenheden M−1cm−1, c is de eiwitconcentratie in M en l is de padlengte in cm. Voor wild-type aSyn26, ε = 5960 M−1cm−1.</li>
	</ol></li>
	<li>Stel de vloeistofchromatografiemethode in.<ol>
<li>Maak een inlaatbestand met een laad-/vangtijd van 3 minuten bij een druk van 7000-9000 psi, gevolgd door een gradiënt van 5% acetonitril tot 40% acetonitril in 7 minuten, gevolgd door herhaalde wasstappen van 5%-95% acetonitrilwater gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Zorg ervoor dat slotspray (bijv. leucine-enkefaline, zie Materiaaltabel) met 2000 psi stroomt en is aangesloten op de bronvergrendelingsspraysonde van de massaspectrometer.</li>
	</ol></li>
	<li>Stel de massaspectrometrie MSE-methoden in. OPMERKING: MSE is een breedbandgegevensonafhankelijke acquisitiemethode zonder precursor massa-isolatie. Daarom worden alle ionen binnen het geselecteerde m/z-bereik verder gefragmenteerd met behulp van botsing-geïnduceerde dissociatie (CID)27.<ol>
<li>Kies in het MS-methodebestand MSE Continuum en stel een acquisitietijd in tussen 2-10 minuten, elektrospraybron en positieve resolutiemodus. Verkrijg MSE meer dan 50-2000 Da en scan elke 0,3 s.</li>
		<li>Voor functie 1 (lage energie) stelt u de val in en draagt u botsingsenergieën over op 4 V. Stel voor functie 2 (hoge energie) de botsingsenergie voor rampoverdracht in op constant bij 4V en de trapbotsingsenergie op basis van tabel 1 voor elk energieniveau. OPMERKING: Ionenmobiliteit MSE-methoden kunnen ook worden gebruikt. Alternatieve toewijzingsmethoden (bijv. gegevensafhankelijke acquisitie of DDA) kunnen naar goeddunken van de gebruiker worden gebruikt.</li>
	</ol></li>
	<li>Stel de autosampler-robot in (zie Materiaalopgave).<ol>
<li>Voeg 50 μL van het 5 μM eiwit toe aan een injectieflacon met totaal herstel. Plaats de injectieflacon in een monsterpositie in de rechterkamer van HDX. Zorg ervoor dat deze kamer op 0,5 °C is.</li>
		<li>Voeg één reagensflacon met evenwichtsbuffer en twee reagensflacons met etiketteringsbuffer toe aan de reagensposities één, twee en drie in de linker hdx-kamer. Zorg ervoor dat deze kamer op 20 °C staat door de Peltier-temperatuurregelaar in te stellen (zie Materiaaltabel). Voeg één reagensflacon met blusbuffer toe aan de reagenspositie in de rechterkamer van HDX.</li>
		<li>Voeg acht totale herstelflacons toe in de reactieposities van de linker HDX-kamer en acht maximale herstelflacons in de reactieposities van de hdx-rechterkamer. OPMERKING: Om volledige reiniging en maximale reproduceerbaarheid van de gedoseerde volumes te garanderen, wordt geadviseerd om een spuitwassing en prime wash op de autosampler-spuiten uit te voeren. Voer bijvoorbeeld een reeks uit van (1) zwakke was, (2) sterke was, (3) zwakke was voordat u de mappingexperimenten start. Deze volgorde kan uitgebreid worden herhaald en het wordt aanbevolen om dit tot 20x te doen of totdat de spuit volledig bevochtigd is.</li>
		<li>Stel een voorbeeldlijst in met de juiste LC- en MS-methoden in de planningssoftware en start de planning. OPMERKING: Voor deze studie wordt Chronos gebruikt als planningssoftware (zie Materiaaltabel).</li>
	</ol></li>
	<li>Verwerk de kaartgegevens.<ol>
<li>Identificeer peptiden uit de mapping experimentbestanden met behulp van de juiste software (zie Tabel met materialen).</li>
		<li>Importeer peptide-identificatiegegevens in DynamX (zie Materiaaltabel) met behulp van de volgende peptidedrempelparameters: minimale intensiteit = 5000, minimale sequentielengte = 0, maximale sequentielengte = 40, minimumproducten = 1, minimumproducten per aminozuur = 0,25, minimale opeenvolgende producten = 2, minimale somintensiteit voor producten = 0, minimumscore = 0 en maximale MH+ Fout (ppm) = 0. OPMERKING: U kunt ook de geoptimaliseerde instellingen afleiden volgens een aanbevolen workflow28.</li>
		<li>Selecteer Gegevens in het menu en klik op PLGS-resultaten importeren. Klik op Toevoegen om de relevante gegevensbestanden voor de spectrale toewijzing te kiezen. Wanneer alles is toegevoegd, klikt u op Volgende en voert u de bovenstaande filterinstellingen in. Klik vervolgens op Voltooien.</li>
		<li>Beheer handmatig isotopische toewijzingen om de uiteindelijke peptidedekkingskaart van aSyn in DynamX te verkrijgen.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Milliseconde waterstof/deuterium uitwisselingsstudie
<ol><li>Reinig het FastHDX-prototype-instrument (zie Materiaaltabel) voordat u HDX-experimenten start.<ol>
<li>Open de compatibele HDX-software-GUI en laat het systeem initialiseren.</li>
		<li>Voer de temperatuur van de monsterkamer in als 20 °C en de bluskamer als 0,5 °C. Klik op Instellen om de nieuwe temperaturen toe te passen.</li>
		<li>Plaats de centrifugebuizen met water van LC-MS-kwaliteit bij alle inlaten.</li>
		<li>Controleer op het tabblad Titrator Plumbing Delivery zowel de linker- als de rechterspuit en klik op Prime om eventuele latente luchtbellen in de buizen te verwijderen. Herhaal dit totdat alle bubbels verdwenen zijn.</li>
		<li>Vink op het tabblad Macro's alle vakjes voor de spuiten aan. Klik op Kalibreer spuiten thuispositie. Klik op Wash Syringe Load Loop. Klik op Wash All Mixing Loop Volumes.</li>
		<li>Herhaal stap 4.1.5. 1x meer.</li>
		<li>Als er belletjes in de bufferspuiten verschijnen, ontgas dan door de spuit los te koppelen en de bel verticaal uit te werpen. Vervang de spuit en kalibreer opnieuw naar de nulpositie.</li>
	</ol></li>
	<li>Stel het FastHDX-prototype-instrument in voor HDX-experimenten.<ol>
<li>Voeg 500 uL gefilterde 5 μM aSyn toe aan een injectieflacon met totaal herstel en plaats in een tafelkoelkast om temperatuurgeïnduceerde oligomerisatie en aggregatie te voorkomen.</li>
		<li>Voeg 50 ml evenwichts-, etiketterings- en blusbuffers toe aan elke buffer (2. HDX-buffervoorbereidingsstappen 1-3) inlaat in de linker- en rechterkamer.</li>
		<li>Voeg 50 ml kolomwasbuffer toe (2. HDX-bufferbereiding stap 4) naar de pepsinewasinlaat.</li>
		<li>Om de eiwit- en kolomwaslijnen 1x te primen, controleert u zowel de linker- als de rechterspuiten op het tabblad Titrator Plumbing Delivery en klikt u eenmaal op Prime. OPMERKING: Elke volgende klik op Prime zal extra herhalingen van het prime-proces veroorzaken, wat resulteert in de consumptie van grote hoeveelheden eiwitmonster. Voorzichtigheid is geboden om dit te voorkomen, zelfs als er een vertraging in de software is nadat een klik op de knop is geprobeerd.</li>
		<li>Herhaal stap 4.1.5. 1x.</li>
		<li>Voer op het tabblad Handmatige quenchflow de vereiste instellingen in, die worden uitgelegd in de stappen 4.2.7.-4.2.10.</li>
		<li>Voor een tijdsverloopexperiment voert u de tijden in milliseconden in met de knop Symbolische stippen . Als replica's vereist zijn, voeg dan hetzelfde tijdspunt meerdere keren toe, bijvoorbeeld voor een drievoud van 50 ms moet 50 50 50 worden ingevoerd. De voorbeeldlijst in de massaspectrometersoftware (MassLynx wordt hier gebruikt, zie Tabel met materialen) moet precies overeenkomen met die tijdspunten. OPMERKING: De bestandsnamen en/of voorbeeldtekst van de massaspectrometer moeten worden gebruikt om te zorgen voor een permanente registratie van de HDX-labeltijden die overeenkomen met die welke zijn ingevoerd in de FastHDX-software-GUI. Labeltijden voor elke monsterrun worden nergens anders opgeslagen.</li>
		<li>Stel Traptijd (mins) in op de lengte van de overvultijd. Hier is het 3.00 uur.</li>
		<li>Wacht op HPLC (mins) = (traptijd + looptijd + 1,5 min) in. OPMERKING: Voor een experiment met 3 minuten overvullen en een verloop van 17 minuten is dit bijvoorbeeld 21,50 minuten.</li>
		<li>Klik alleen op het vak Leeg uitvoeren als u lege experimenten uitvoert tussen voorbeeldruns. Zo ja, zorg dan voor een vermelding (d.w.z. een geldige rij in de voorbeeldlijst) in de software voor de lege run na elke samplerun.</li>
		<li>Zodra de voorbeeldlijst klaar is op de software, markeert u de juiste vermeldingen en start u de uitvoering in de software door op de knop Afspelen en FastHDX in de software te klikken. OPMERKING: Vanwege waterstof / deuterium scrambling kunnen MS-only methoden of zachte fragmentatietechnieken (elektronenoverdracht dissociatie, elektronenvangst dissociatie en ultraviolette fotodissociatie) slechtsworden gebruikt 29. Voor aSyn bij een fysiologische pH van 7,40 zijn tijdspunten variërend van 50 ms tot 300 s het meest van toepassing, omdat deze de gehele deuteriumopnamecurve8 bestrijken.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Gegevensverwerking
<ol><li>Laad het bestand met spectraal toegewezen peptiden uit de peptide mapping experimenten. Open het menu Bestand en klik op Openen in de DynamX-software (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Importeer RAW-bestanden in de gewenste massameetsoftware (bijv. DynamX, HDExaminer, enz.). Open het menu "Gegevens" en klik op MS Files. Klik op Nieuwe toestand om toestanden te maken voor elke bestudeerde eiwitconditie.<ol>
<li>Klik op Nieuwe belichting om elk HDX-tijdspunt toe te voegen. Klik op Nieuwe RAW om de .raw bestanden te importeren. Sleep elk .raw bestand naar de juiste positie. Klik op OK als u klaar bent.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wijs eerst automatisch isotopen toe (dit is automatisch volgens stap 5.2. hierboven) en beheer vervolgens handmatig de isotopische toewijzing om een hoge gegevenskwaliteit te garanderen.</li>
	<li>Exporteer de clustergegevens naar een .csv bestand met kolommen in de volgende volgorde: eiwitnaam, volgordestartnummer, volgeindnummer, volgorde, modificatie, fragment, maximaal mogelijke opname, massa van mono-isotopensoorten, staatsnaam, blootstellingstijd, bestandsnaam, lading, retentietijd, intensiteit en centroïde.</li>
	<li>Open het menu Gegevens in de software voor massameting en klik op Clustergegevens exporteren.</li>
</ol>6. Data-analyse
<ol><li>Laad de geëxporteerde clustergegevens in de gewenste HDX-analysesoftware. Hier wordt HDfleX gebruikt30 (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Pas de experimentele gegevens voor alle peptiden en toestanden aan en selecteer de juiste back-exchange correctiemethoden om waargenomen snelheidsconstanten voor de HDX-reactie te krijgen.</li>
	<li>Bereken een globale significantiedrempel met de voorkeursmethode (HDfleX ondersteunt hiervoor verschillende opties) en voer hybride significantietests uit om de significante verschillen tussen de staten te bepalen, vergelekenmet 31,32. OPMERKING: Als het waargenomen verschil groter is dan de globale drempel en de p-waarde lager is dan het gekozen betrouwbaarheidsniveau (bijv. 95%), wordt het verschil als significant beschouwd.</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

In dit artikel worden de volgende procedures beschreven: (1) het uitvoeren van peptide mapping experimenten op monomere aSyn om de hoogste sequentiedekking te verkrijgen, (2) het verkrijgen van milliseconde HDX-MS gegevens op monomere aSyn onder fysiologische omstandigheden, en (3) het uitvoeren van data-analyse en interpretatie van de resulterende HDX-MS data. De verstrekte procedures zijn over het algemeen eenvoudig uit te voeren, elk labelexperiment duurt meestal slechts ongeveer 8 uur voor drie replicaties en acht ti...

De ziekte van Parkinson (PD) is een neurodegeneratieve ziekte die wereldwijd miljoenen mensen treft1. Het wordt gekenmerkt door de vorming van cytoplasmatische insluitsels bekend als Lewy bodies en Lewy neurites in de substantia nigra pars compacta regio van de hersenen. Deze cytoplasmatische insluitsels blijken aggregaten van het intrinsiek ongeordende eiwit aSyn2 te bevatten. Bij PD en andere synucleinopathieën transformeert aSyn van een oplosbare ongeordende toestand in een onoplosbare, sterk gestructureerde zieke toestand. In zijn oorspronkelijke vorm neemt monomere aSyn een breed scala aan conformaties aan, gestabiliseerd door elektrostatische interacties op lange afstand tussen zijn N- en C-termini en hydrofobe interacties tussen zijn C-terminus en niet-amyloïde bètacomponent (NAC) regio 3,4,5,6. Eventuele verstoringen in die stabiliserende interacties, zoals mutaties, posttranslationele modificaties en veranderingen in de lokale omgeving, kunnen leiden tot het verkeerd vouwen van het monomeer, waardoor het proces van aggregatiewordt geactiveerd 7.
Hoewel er een enorme hoeveelheid onderzoek bestaat naar de oligomere en fibrillaire vormen van aSyn 8,9,10,11, is er een cruciale behoefte om de monomere vorm van het eiwit te bestuderen en beter te begrijpen welke conformers functioneel zijn (en hoe) en welke vatbaar zijn voor aggregaat 8,9,10,11 . Omdat het intrinsiek ongeordend is, slechts 14 kDa groot is en moeilijk te kristalliseren, is het aSyn-monomeer niet vatbaar voor de meeste structurele biologische technieken. Een techniek die in staat is om de conformatiedynamiek van monomere aSyn te meten, is milliseconde HDX-MS, die onlangs belangrijke structurele waarnemingen heeft gegenereerd die uitdagend of onmogelijk te verkrijgen zouden zijn anders 12,13,14. Milliseconde HDX-MS meet gevoelig het gemiddelde van het eiwitconformatie-ensemble door de isotopische uitwisseling bij amidewaterstoffen te monitoren, wat wijst op de toegankelijkheid van oplosmiddelen en de deelname van het waterstofbindingsnetwerk van een bepaald eiwitgebied op de millisecondetijdschaal. Het is noodzakelijk om het milliseconde-aspect van de HDX-MS te benadrukken, omdat aSyn, vanwege zijn native uitgevouwen, meta-stabiele aard, een zeer snelle waterstofuitwisselingskinetiek vertoont die zich ver onder de ondergrens van conventionele HDX-MS-systemen manifesteert. Het grootste deel van het aSyn-molecuul heeft bijvoorbeeld waterstof volledig uitgewisseld voor deuterium onder intracellulaire omstandigheden in minder dan 1 s. Verschillende laboratoria hebben inmiddels snelmenginstrumenten gebouwd; in dit geval wordt een prototype snel mengend quench-flow instrument gebruikt dat HDX-MS kan uitvoeren met een dead-time van 50 ms en een temporele resolutie van 1 ms15. Hoewel milliseconde HDX-MS onlangs acuut belangrijk is geweest in de studie van aSyn, is het waardevol bij het bestuderen van intrinsiek ongeordende eiwitten / regio's op grotere schaal en een groot aantal eiwitten met lussen / regio's die slechts zwak stabiel zijn. Bijvoorbeeld peptidegeneesmiddelen (bijv. Insuline; GLP-1/glucagon; tirzepatide) en peptidefusie-eiwitten (bijv. de HIV-remmer FN3-L35-T1144) zijn belangrijke medicijnformaten waarbij structurele en stabiliteitsinformatie in de oplossingsfase een kritische input kan zijn voor beslissingen over de ontwikkeling van geneesmiddelen, en toch is het peptidegedeelte vaak slechts zwak stabiel en onhandelbaar door HDX-MS op de secondentijdschaal 16,17,18,19,20 . Van opkomende HDX-MS-methoden met labeling in de seconden/minuten-domeinen is aangetoond dat ze structurele informatie afleiden voor DNA G-quadruplexen, maar het zou mogelijk moeten zijn om dit uit te breiden naar meer diverse oligonucleotidestructuren door de toepassing van milliseconde HDX-MS21.
HDX-MS-experimenten kunnen op drie verschillende niveaus worden uitgevoerd: (1) bottom-up (waarbij het gelabelde eiwit proteolytisch wordt verteerd), (2) middle-down (waarbij het gelabelde eiwit proteolytisch wordt verteerd en de resulterende peptiden verder worden gefragmenteerd door soft-fragmentation technieken), en (3) top-down (waarbij soft-fragmentation technieken het gelabelde eiwit direct fragmenteren)22 . Submoleculaire HDX-MS-gegevens stellen ons dus in staat om het uitwisselingsgedrag te lokaliseren naar specifieke regio's van een eiwit, waardoor het van cruciaal belang is om voldoende sequentiedekking voor dergelijke experimenten te hebben. De structurele resolutie van elk HDX-MS-experiment is afhankelijk van het aantal proteolytische peptiden of fragmenten afgeleid van het eiwit bij vertering of zachte fragmentatie, respectievelijk. In elk van de drie hierboven beschreven experimenttypen wordt de verandering in amide-uitwisseling bij elk peptide / fragment teruggekoppeld naar de primaire structuur van het eiwit om het gedrag van gelokaliseerde gebieden van het eiwit aan te geven. Hoewel de hoogste structurele resolutie wordt bereikt door zachte fragmentatie, valt de beschrijving van deze experimenten buiten het bereik van de huidige studie, die zich richt op het meten van aSyn monomeer conformaties. Uitstekende resultaten kunnen worden verkregen met de vaak toegepaste "bottom-up" workflow die hier wordt beschreven.
Hier worden procedures gegeven over (1) hoe aSyn-monsters en HDX-MS-buffers te bereiden en te verwerken, (2) hoe peptidemapping uit te voeren voor een bottom-up HDX-MS-experiment, (3) hoe HDX-MS-gegevens over monomere aSyn te verkrijgen onder fysiologische omstandigheden, met name in het millisecondetijddomein (met behulp van een op maat gemaakt instrument; alternatieve instrumenten voor milliseconde-etikettering zijn ook beschreven), en (4) hoe de HDX-MS-gegevens te verwerken en te analyseren. Methoden met behulp van monomere aSyn bij fysiologische pH (7,40) in twee oplossingsomstandigheden worden hier geïllustreerd. Hoewel kritisch nuttig in de studie van aSyn, kunnen deze procedures worden toegepast op elk eiwit en zijn ze niet beperkt tot intrinsiek ongeordende eiwitten.

<table><tbody><tr><td>1 &times; 100 mm ACQUITY BEH 1.7 &mu;m C18 column&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td>186002346</td><td>Analytical column</td></tr><tr><td>Acetonitrile HPLC grade >99.9% HiPerSolv</td><td>VWR</td><td>20060.420</td><td>Voor LC mobiele fasen</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670</td><td>Zout voor HDX buffers</td></tr><tr><td>Chronos</td><td>Axel Semrau (Koop bij Waters Corporation)</td><td>667006090</td><td>Planningssoftware om meerdere HDX-MS monsterinjecties automatisch mogelijk te maken. Alternatieve software is verkrijgbaar bij andere leveranciers, bijv. HDXDirector of LEAP Shell</td></tr><tr><td>Deuterium chloride</td><td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td><td>DLM-2-50</td><td>Voor HDX labelbuffers</td></tr><tr><td>Deuterium oxide (99.9% D2O)</td><td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td><td>DLM-4</td><td>Gedeutereerd water</td></tr><tr><td>DynamX 3.0</td><td>Waters Corporation</td><td>176016027</td><td>Isotooptoewijzing en berekening van deuteriumincorporatie</td></tr><tr><td>Enzymate BEH Pepsin Column</td><td>Waters Corporation</td><td>186007233</td><td>Pepsine digestiekolom</td></tr><tr><td>Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>10596814</td><td>Voor LC mobiele fasen</td></tr><tr><td>Guanidinium hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RDD001-500G</td><td>Chaotroop/Denaturant</td></tr><tr><td>HDfleX</td><td>University of Exeter</td><td>N/A</td><td>https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td>Zout voor HDX buffers</td></tr><tr><td>LEAP HDX-2 CTC PAL bemonsteringsrobot</td><td>Waters Corporation</td><td>725000637</td><td>Autosampler robot</td></tr><tr><td>Leucine enkephalin</td><td>Waters Corporation</td><td>186006013</td><td>Voor massaspectrometrie lockspray kalibratie.</td></tr><tr><td>MassLynx</td><td>Waters Corporation</td><td>667004007</td><td>Software die de inlaatmethoden en het massaspectrometer bestuurt</td></tr><tr><td>Maximum recovery vials</td><td>Waters Corporation</td><td>600000670CV</td><td>100 pack inclusief doppen - gebruikt voor quench tray in LEAP HDX-2</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>Zout voor HDX buffers</td></tr><tr><td>Millipore 0.22 &micro;m spuitfilters</td><td>Millipore</td><td>N9CA7069B</td><td>Spuitfilters</td></tr><tr><td>ms2min</td><td>Applied Photophysics Ltd</td><td>N/A</td><td>fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td>Zout voor HDX buffers</td></tr><tr><td>Peltier temperatuurregelaar</td><td>LEAP Technologies Inc.</td><td>HP115-COOL/D</td><td>Peltier controller om de nauwkeurige temperatuur van de kamers in de LEAP robot in te stellen.</td></tr><tr><td>ProteinLynx Global Server 3.0</td><td>Waters Corporation</td><td>715001030</td><td>Peptide identificatie software. Alternatieve software is verkrijgbaar bij andere leveranciers.</td></tr><tr><td>Reagent pot caps</td><td>Waters Corporation</td><td>186004632</td><td>100 pack</td></tr><tr><td>Reagent pots voor LEAP HDX-2</td><td>Waters Corporation</td><td>186001420</td><td>100 pack exclusief doppen - gebruikt voor buffers in LEAP HDX-2</td></tr><tr><td>Sodium deuteroxide (99.5% in D2O)</td><td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td><td>DLM-57</td><td>Voor HDX labelbuffers</td></tr><tr><td>Spin filter microcentrifugebuizen (3 kDa MWCO)</td><td>Amicon (Merck Sigma Aldrich)</td><td>UFC5003</td><td>Micro centrifuge buizen om eiwitten te concentreren. Dit vergemakkelijkt bufferuitwisseling en nauwkeurige monsterlading voor HDX-MS experimenten.</td></tr><tr><td>Synapt G2-Si massaspectrometer</td><td>Waters Corporation</td><td>176850035</td><td>Massaspectrometer</td></tr><tr><td>Total recovery vials</td><td>Waters Corporation</td><td>600000671CV</td><td>100 pack inclusief doppen - gebruikt voor labeltray in LEAP HDX-2</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3253-250G</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T60040-B2005</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378-1KG</td><td>Chaotroop/Denaturant</td></tr><tr><td>VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td>186004623</td><td>Trap ontzouting kolom</td></tr></tbody></table>

milliseconde waterstof/deuterium-uitwisseling massaspectrometrie voor de studie van alfa-synucleïne structurele dynamica onder fysiologische omstandigheden

Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions

Alfa-synucleïne (aSyn) is een intrinsiek ongeordend eiwit waarvan de fibrillaire aggregaten overvloedig aanwezig zijn in Lewy-lichamen en neurieten, die de kenmerken zijn van de ziekte van Parkinson. Toch is veel van zijn biologische activiteit, evenals de aggregatie ervan, centraal betrokken bij de oplosbare monomeervorm van het eiwit. Opheldering van de moleculaire mechanismen van aSyn biologie en pathofysiologie vereist structureel sterk opgeloste methoden en is gevoelig voor biologische omstandigheden. De oorspronkelijk uitgevouwen, meta-stabiele structuren maken monomere aSyn onhandelbaar voor veel structurele biologietechnieken. Hier wordt de toepassing van een dergelijke benadering beschreven: waterstof/deuterium-uitwisseling massaspectrometrie (HDX-MS) op de milliseconde tijdschaal voor de studie van eiwitten met lage thermodynamische stabiliteit en zwakke beschermingsfactoren, zoals aSyn. Op de milliseconde tijdschaal bevatten HDX-MS-gegevens informatie over de toegankelijkheid van oplosmiddelen en waterstofgebonden structuur van aSyn, die verloren gaan bij langere etiketteringstijden, wat uiteindelijk een structurele resolutie tot het aminozuurniveau oplevert. Daarom kan HDX-MS informatie verstrekken met hoge structurele en temporele resoluties over conformatiedynamica en thermodynamica, intra- en intermoleculaire interacties en de structurele impact van mutaties of veranderingen in omgevingsomstandigheden. Hoewel breed toepasbaar, wordt aangetoond hoe milliseconde HDX-MS-metingen in monomere aSyn kunnen worden verkregen, geanalyseerd en geïnterpreteerd.

Vanwege de intrinsiek ongeordende aard is het moeilijk om de ingewikkelde structurele veranderingen in aSyn bij fysiologische pH vast te leggen. HDX-MS bewaakt de isotopische uitwisseling bij backboneamidehydrogenen en onderzoekt de eiwitconformatiedynamiek en interacties. Het is een van de weinige technieken om deze informatie te verkrijgen met hoge structurele en temporele resoluties. Dit protocol is breed toepasbaar op een breed scala aan eiwitten en buffercondities, en dit wordt geïllustreerd door de meting van de ui...

Het structurele ensemble van monomeer alfa-synucleïne beïnvloedt de fysiologische functie en fysisch-chemische eigenschappen. Het huidige protocol beschrijft hoe milliseconde waterstof/deuterium-uitwisseling massaspectrometrie en daaropvolgende data-analyses kunnen worden uitgevoerd om conformatie-informatie over het monomeer van dit intrinsiek ongeordende eiwit onder fysiologische omstandigheden te bepalen.

Milliseconde waterstof/deuterium-uitwisseling massaspectrometrie voor de studie van alfa-synucleïne structurele dynamica onder fysiologische omstandigheden

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks ...

Alle organismen hebben een wanorde in hun proteoom, geschat tot 33% Deze regio's zijn waarneembaar door waterstof / deuterium uitwisseling massaspectrometrie, maar alleen in het milliseconde tijdsbereik. Ons protocol laat u zien hoe u dit met succes kunt doen. Dit is een volledig geautomatiseerde analysetechniek.Je stelt gewoon alles in, programmeert de gewenste tijdmetingen, drukt op go en loopt weg. Deze techniek opent de opwindende mogelijkheid om te screenen op verbindingen die specifieke bevestigingen van intrinsiek ongeordende eiwitten zoals alfa-synucleïne stabiliseren. Om te beginnen met de monstervoorbereiding voor het in kaart brengen van peptiden, neemt u eerst een injectieflacon met opgeslagen alfa-synucleïne-eiwitvoorraad uit de vriezer van min 80 graden Celsius.En zodra het is ontdooid, filtert u met een spuitfilter van 0,22 micrometer. Meet vervolgens de absorptie van de oplossing op 218 nanometer om de eiwitconcentratie te bepalen met behulp van de wet van Beer-Lambert en verdun het eiwit met evenwichtsbuffer tot een uiteindelijke concentratie van vijf micromolair. Voeg vervolgens, om de autosampler-robot in te stellen, 50 microliter van de vijf micromolaire eiwitoplossing toe aan een injectieflacon met totaal herstel en plaats de injectieflacon in de monsterpositie in de rechterkamer van de waterstof / deuteriumuitwisseling, of HDX, robotica in overeenstemming met de massaspectrometer.Plaats vervolgens een injectieflacon met evenwichtsbuffer en twee injectieflacons pepsinewasbuffer op reagensposities één, vier en vijf van de linkerkamers en één injectieflacon met blusbuffer om reagenspositie één in de hdx-rechterkamer te plaatsen en de temperatuur in te stellen op 20 graden Celsius met behulp van de Peltier-temperatuurregelaar. Voeg vervolgens een gelijk aantal totale herstelflacons en maximale herstelflacons toe in dezelfde reactieposities van respectievelijk de linker hdx-kamer en de hdx-rechterkamer. Stel vervolgens een voorbeeldlijst op met de juiste LC- en MS-methoden in de planningssoftware en start de planning.Om de uiteindelijke peptidedekkingskaart te verkrijgen, beheert u handmatig de isotopische toewijzingen in de DynamX HDX-data-analysesoftware. Nadat u het Fast HDX-prototype-instrument hebt gereinigd, opent u de grafische gebruikersinterface van de compatibele HDX-software om het systeem te initialiseren. Voer respectievelijk 20 graden Celsius en 0,5 graden Celsius in als respectievelijk de temperatuur van de monsterkamer en de bluskamer, gevolgd door op Set te klikken om de nieuwe temperaturen toe te passen.Om het instrument schoon te maken en voor te bereiden, stelt u de centrifugebuizen in met water van LC/MS-kwaliteit bij alle inlaten, controleert u vervolgens zowel de linker- als rechterspuiten op het tabblad voor het afleveren van het titratorleidingen en blijft u op prime klikken totdat alle latente luchtbellen in de buizen verdwenen zijn. Om alle vakjes voor spuiten te controleren, gaat u eerst naar het tabblad macro's en klikt u op de thuispositie van kalibreren van spuiten, klikt u vervolgens eerst op de laadlus van de wasspuit en vervolgens op het wassen van alle menglusvolumes. Als er een bel in een bufferspuit zit, koppelt u de spuit los en ontgast u deze door de bel verticaal uit te werpen.Voordat u opnieuw kalibreert naar de nulpositie, vervangt u de spuit. Voor het instellen van het Fast HDX-prototype-instrument voor HDX-experimenten, plaatst u eerst de linker titratie-inlaatbuis in de totale herstelflacon. Om temperatuurgeïnduceerde oligomerisatie en aggregatie te voorkomen, plaatst u de buis in een tafelkoelkast.Voeg vervolgens 50 milliliter evenwichts-, etiketterings-, blus- en pepsinewasbuffers toe aan de respectieve bufferinlaten in de rechter- en linkerkamers van het instrument, gevolgd door 50 milliliter kolomwasbuffer toe te voegen aan de pepsinewasinlaat. Voor het primen van de eiwit- en kolomwaslijnen, controleert u de rechter- en linkerspuiten in het tabblad voor het afleveren van het sanitair van de titrator en klikt u eenmaal op prime. Nadat u alle vakjes voor spuiten hebt gecontroleerd, zoals eerder gedemonstreerd, gaat u naar het tabblad handmatige doofstroom om de vereiste instellingen in te voeren.Voor een tijdcursusexperiment gebruikt u de symbolische puntknop om de tijden in milliseconden in te voeren. Stel vervolgens de valtijd in op drie en het wachten op HPLC om de valtijd plus looptijd plus 1,5 minuut te vangen. Als lege experimenten worden uitgevoerd tussen de uitvoeringen van een voorbeeld, klikt u op het lege vak Uitvoeren nadat u ervoor hebt gezorgd dat er na elke uitgevoerde steekproef een vermelding in de acquisitiesoftware voor de lege uitvoering is uitgevoerd.Zodra de voorbeeldlijst klaar is en de juiste vermeldingen zijn gemarkeerd, start u de run door op play en Fast HDX in de software te klikken. Voor gegevensverwerking opent u het bestandsmenu van het bestand met spectraal toegewezen peptiden uit de peptidetoewijzingsexperimenten en klikt u op openen in de DynamX-software en importeert u vervolgens de ONBEWERKTE bestanden in de DynamX-software. Nadat u het gegevensmenu hebt geopend, klikt u op MS Files.Om toestanden te maken voor elke eiwitconditie die wordt bestudeerd, klikt u op nieuwe toestand. Om elk HDX-tijdspunt toe te voegen, klikt u op nieuwe belichting en vervolgens op nieuwe raw. Als u RAW-bestanden wilt importeren, sleept u elk bestand naar de juiste positie en klikt u op OK wanneer u klaar bent.Nadat u automatisch isotopen hebt toegewezen, beheert u de isotopische toewijzing handmatig om een hoge gegevenskwaliteit te garanderen. Exporteer de clustergegevens in csv-bestand met de kolomvolgorde zoals beschreven in het manuscript. Open het gegevensmenu in de massameetsoftware en klik op clustergegevens exporteren.Voor gegevensanalyse laadt u eerst de geëxporteerde geclusterde gegevens in de HDX-analysesoftware HDfleX. Om de experimentele gegevens voor alle experimenten en toestanden aan te passen, selecteert u de juiste teruguitwisselingscorrectiemethoden om de waargenomen snelheidsconstanten voor de HDX-reactie te krijgen. Bereken vervolgens een globale significantiedrempel met behulp van een voorkeursmethode in HDfleX en voer hybride significantietests uit om de significante verschillen tussen de vergeleken staten te bepalen.Het mapping experiment op alfa-synucleïne genereerde een peptide dekkingskaart die 100% van de eiwitsequentie bedekte met een gemiddelde redundantie van 3,79. Bovendien maakte dit protocol het genereren van deuteriumopnamecurven mogelijk voor verschillende peptiden van alfa-synucleïne, die vervolgens werden uitgedrukt als aangepaste en teruguitwisseling gecorrigeerde grafieken. Het was duidelijk dat de meeste waterstof/deuterium uitwisseling in alfa-synucleïne met één seconde werd gedaan.Het conformatieverschil tussen toestanden A en B van alfa-synucleïne was ook duidelijk uit de hogere deuteriumopname door toestand B, zowel op het peptide- als het aminozuurniveau. Voor een dergelijke gevoelige techniek is het belangrijk om robuuste statistische significantietests te gebruiken bij het vergelijken van gegevens. Hier gebruikten we onze software HDfleX.

millisecond-hydrogendeuterium-exchange-mass-spectrometry-for-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates the process of quantifying alpha-synuclein accumulation in embryonic mouse dopamine neurons pre-treated with alpha-synuclein pre-formed fibrils. It outlines the steps for fixing, staining, and quantifying the dopamine neurons containing alpha-synuclein aggregates using immunofluorescence.

Studying Alpha-Synuclein Accumulation in Primary Embryonic Mouse Dopamine Neurons

Eiwitconformatie en dynamiek zijn de sleutel tot het begrijpen van de relatie tussen eiwit structuur en functie. Waterstofwisselproces combinatie met hoge-resolutie massaspectrometrie is een veelzijdige methode om de conformationele dynamica van proteïnen en karakteriseren eiwit-ligand en eiwit-eiwit interacties, zoals contact interfaces en allosterische effecten.

Het analyseren van Protein Dynamics gebruik van waterstof Exchange Massaspectrometrie

Conformationele flexibiliteit speelt een cruciale rol in de eiwit-functie. Hierin beschrijven we het gebruik van tijdsopgeloste electrospray ionisatie massaspectrometrie gekoppeld met waterstof deuterium ruil voor het sonderen van de snelle structurele veranderingen die functie rijden besteld en ontvouwen eiwitten.

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Het doel van dit protocol is bedoeld als een cel-gebaseerd systeem dat wordt uitgevoerd, de vorming van alpha-synuclein repliceert aggregaten in vivo. Alpha-synuclein intracellulaire insluitsels worden overgeënt in primaire neuronen door de internalisering en verspreiding van exogene toegediend aggregaten van inheemse microsomes-geassocieerde alpha-synuclein geïsoleerd van zieke alpha-synuclein transgene muizen.

Exogene toediening van Alpha-synuclein Microsomes-geassocieerde aggregaten te primaire neuronen als een krachtige cel Model van de vorming van fibrillen

Lanthipeptide synthetases katalyseren multistep reacties tijdens de biosynthese van peptide natuurlijke producten. Hier beschrijven we een continue, bottom-up, waterstof-deuterium uitwisseling massaspectrometrie (HDX-MS) workflow die kan worden gebruikt om de conformationele dynamiek van lanthipeptide synthetases te bestuderen, evenals andere vergelijkbare enzymen die betrokken zijn bij peptide natuurlijke productbiosynthese.

Een Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform voor het onderzoeken van Peptide Biosynthetische Enzymen

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om neuronale α-synucleinaccumulatie in primaire muis dopamine neuronen te bestuderen. Fosforyleerde α-synuclein aggregaten in neuronen worden geïnduceerd met voorgevormde α-synucleinfibrils. Geautomatiseerde beeldvorming van immunofluorescently gelabelde cellen en onbevooroordeelde beeldanalyse maken dit robuuste protocol geschikt voor medium-to-high doorvoerscreening van geneesmiddelen die α-synucleinaccumulatie remmen.

Het bestuderen van voorgevormde Fibril Geïnduceerde α-Synuclein Accumulatie in primaire embryonale muis Midbrain Dopamine Neuronen

Tijd-opgeloste single-molecule eiwit-geïnduceerde fluorescentieverbetering is een nuttige fluorescentiespectroscopische nabijheidssensor die gevoelig is voor lokale structurele veranderingen in eiwitten. Hier laten we zien dat het kan worden gebruikt om stabiele lokale conformaties in α-Synuclein te ontdekken, dat ook wel bekend staat als bolvormig ongestructureerd en onstabiel wanneer het wordt gemeten met behulp van de FRET-liniaal met een groter bereik.

Gebruik van time-resolved eiwit-geïnduceerde fluorescentieverbetering om stabiele lokale conformaties één α-synucleïnemonomeer tegelijk te identificeren

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een op capillaire elektroforese gebaseerde waterstof / deuteriumuitwisseling (HDX) -benadering in combinatie met top-down massaspectrometrie. Deze benadering karakteriseert het verschil in hogere-orde structuren tussen verschillende eiwitsoorten, inclusief eiwitten in verschillende toestanden en verschillende proteoformen, door gelijktijdige differentiële HDX en elektroforetische scheiding uit te voeren.

Op capillaire elektroforese gebaseerde waterstof/deuteriumuitwisseling voor conformatiekarakterisering van eiwitten met top-down massaspectrometrie

Neutronenbackscattering spectroscopie biedt een niet-destructieve en labelvrije toegang tot de ps-ns dynamiek van eiwitten en hun hydratatiewater. De workflow wordt gepresenteerd met twee studies over amyloïde eiwitten: over de tijd-opgeloste dynamiek van lysozym tijdens aggregatie en over de hydratatiewaterdynamiek van tau op vezelvorming.

Neutronenspectroscopie met hoge resolutie om picoseconde-nanosecondedynamiek van eiwitten en hydratatiewater te bestuderen

De ziekte van Parkinson is gerelateerd aan de blootstelling aan pesticiden. Hier laten we een methode om pesticiden met behulp van een maagsonde in de gewenste concentratie en een methode om het effect te analyseren in de alfa-synucleïne accumulatie in het enterisch zenuwstelsel te leveren.

Orale toediening van Rotenon met behulp van een Gavage en beeldanalyse van de Alpha-synucleïne inclusies in het enterisch zenuwstelsel

Leer milliseconde waterstof/deuterium-uitwisseling massaspectrometrie voor de studie van alfa-synucleïne structurele dynamica onder fysiologische omstandigheden. Deze methode biedt inzicht in conformatieveranderingen van intrinsiek ongeordende eiwitten.

Milliseconde waterstof/deuterium-uitwisseling massaspectrometrie voor de studie van alfa-synucleïne structurele dynamica onder fysiologische omstandigheden (Video) | JoVE Journal

Milliseconde waterstof/deuterium-uitwisseling massaspectrometrie voor de studie van alfa-synucleïne structurele dynamica onder fysiologische omstandigheden

Meer video's verkennen