Milliseconde waterstof/deuterium-uitwisseling massaspectrometrie voor de studie van alfa-synucleïne structurele dynamica onder fysiologische omstandigheden

Alle organismen hebben een wanorde in hun proteoom, geschat tot 33% Deze regio's zijn waarneembaar door waterstof / deuterium uitwisseling massaspectrometrie, maar alleen in het milliseconde tijdsbereik. Ons protocol laat u zien hoe u dit met succes kunt doen. Dit is een volledig geautomatiseerde analysetechniek.

Je stelt gewoon alles in, programmeert de gewenste tijdmetingen, drukt op go en loopt weg. Deze techniek opent de opwindende mogelijkheid om te screenen op verbindingen die specifieke bevestigingen van intrinsiek ongeordende eiwitten zoals alfa-synucleïne stabiliseren. Om te beginnen met de monstervoorbereiding voor het in kaart brengen van peptiden, neemt u eerst een injectieflacon met opgeslagen alfa-synucleïne-eiwitvoorraad uit de vriezer van min 80 graden Celsius.

En zodra het is ontdooid, filtert u met een spuitfilter van 0,22 micrometer. Meet vervolgens de absorptie van de oplossing op 218 nanometer om de eiwitconcentratie te bepalen met behulp van de wet van Beer-Lambert en verdun het eiwit met evenwichtsbuffer tot een uiteindelijke concentratie van vijf micromolair. Voeg vervolgens, om de autosampler-robot in te stellen, 50 microliter van de vijf micromolaire eiwitoplossing toe aan een injectieflacon met totaal herstel en plaats de injectieflacon in de monsterpositie in de rechterkamer van de waterstof / deuteriumuitwisseling, of HDX, robotica in overeenstemming met de massaspectrometer.

Plaats vervolgens een injectieflacon met evenwichtsbuffer en twee injectieflacons pepsinewasbuffer op reagensposities één, vier en vijf van de linkerkamers en één injectieflacon met blusbuffer om reagenspositie één in de hdx-rechterkamer te plaatsen en de temperatuur in te stellen op 20 graden Celsius met behulp van de Peltier-temperatuurregelaar. Voeg vervolgens een gelijk aantal totale herstelflacons en maximale herstelflacons toe in dezelfde reactieposities van respectievelijk de linker hdx-kamer en de hdx-rechterkamer. Stel vervolgens een voorbeeldlijst op met de juiste LC- en MS-methoden in de planningssoftware en start de planning.

Om de uiteindelijke peptidedekkingskaart te verkrijgen, beheert u handmatig de isotopische toewijzingen in de DynamX HDX-data-analysesoftware. Nadat u het Fast HDX-prototype-instrument hebt gereinigd, opent u de grafische gebruikersinterface van de compatibele HDX-software om het systeem te initialiseren. Voer respectievelijk 20 graden Celsius en 0,5 graden Celsius in als respectievelijk de temperatuur van de monsterkamer en de bluskamer, gevolgd door op Set te klikken om de nieuwe temperaturen toe te passen.

Om het instrument schoon te maken en voor te bereiden, stelt u de centrifugebuizen in met water van LC/MS-kwaliteit bij alle inlaten, controleert u vervolgens zowel de linker- als rechterspuiten op het tabblad voor het afleveren van het titratorleidingen en blijft u op prime klikken totdat alle latente luchtbellen in de buizen verdwenen zijn. Om alle vakjes voor spuiten te controleren, gaat u eerst naar het tabblad macro's en klikt u op de thuispositie van kalibreren van spuiten, klikt u vervolgens eerst op de laadlus van de wasspuit en vervolgens op het wassen van alle menglusvolumes. Als er een bel in een bufferspuit zit, koppelt u de spuit los en ontgast u deze door de bel verticaal uit te werpen.

Voordat u opnieuw kalibreert naar de nulpositie, vervangt u de spuit. Voor het instellen van het Fast HDX-prototype-instrument voor HDX-experimenten, plaatst u eerst de linker titratie-inlaatbuis in de totale herstelflacon. Om temperatuurgeïnduceerde oligomerisatie en aggregatie te voorkomen, plaatst u de buis in een tafelkoelkast.

Voeg vervolgens 50 milliliter evenwichts-, etiketterings-, blus- en pepsinewasbuffers toe aan de respectieve bufferinlaten in de rechter- en linkerkamers van het instrument, gevolgd door 50 milliliter kolomwasbuffer toe te voegen aan de pepsinewasinlaat. Voor het primen van de eiwit- en kolomwaslijnen, controleert u de rechter- en linkerspuiten in het tabblad voor het afleveren van het sanitair van de titrator en klikt u eenmaal op prime. Nadat u alle vakjes voor spuiten hebt gecontroleerd, zoals eerder gedemonstreerd, gaat u naar het tabblad handmatige doofstroom om de vereiste instellingen in te voeren.

Voor een tijdcursusexperiment gebruikt u de symbolische puntknop om de tijden in milliseconden in te voeren. Stel vervolgens de valtijd in op drie en het wachten op HPLC om de valtijd plus looptijd plus 1,5 minuut te vangen. Als lege experimenten worden uitgevoerd tussen de uitvoeringen van een voorbeeld, klikt u op het lege vak Uitvoeren nadat u ervoor hebt gezorgd dat er na elke uitgevoerde steekproef een vermelding in de acquisitiesoftware voor de lege uitvoering is uitgevoerd.

Zodra de voorbeeldlijst klaar is en de juiste vermeldingen zijn gemarkeerd, start u de run door op play en Fast HDX in de software te klikken. Voor gegevensverwerking opent u het bestandsmenu van het bestand met spectraal toegewezen peptiden uit de peptidetoewijzingsexperimenten en klikt u op openen in de DynamX-software en importeert u vervolgens de ONBEWERKTE bestanden in de DynamX-software. Nadat u het gegevensmenu hebt geopend, klikt u op MS Files.

Om toestanden te maken voor elke eiwitconditie die wordt bestudeerd, klikt u op nieuwe toestand. Om elk HDX-tijdspunt toe te voegen, klikt u op nieuwe belichting en vervolgens op nieuwe raw. Als u RAW-bestanden wilt importeren, sleept u elk bestand naar de juiste positie en klikt u op OK wanneer u klaar bent.

Nadat u automatisch isotopen hebt toegewezen, beheert u de isotopische toewijzing handmatig om een hoge gegevenskwaliteit te garanderen. Exporteer de clustergegevens in csv-bestand met de kolomvolgorde zoals beschreven in het manuscript. Open het gegevensmenu in de massameetsoftware en klik op clustergegevens exporteren.

Voor gegevensanalyse laadt u eerst de geëxporteerde geclusterde gegevens in de HDX-analysesoftware HDfleX. Om de experimentele gegevens voor alle experimenten en toestanden aan te passen, selecteert u de juiste teruguitwisselingscorrectiemethoden om de waargenomen snelheidsconstanten voor de HDX-reactie te krijgen. Bereken vervolgens een globale significantiedrempel met behulp van een voorkeursmethode in HDfleX en voer hybride significantietests uit om de significante verschillen tussen de vergeleken staten te bepalen.

Het mapping experiment op alfa-synucleïne genereerde een peptide dekkingskaart die 100% van de eiwitsequentie bedekte met een gemiddelde redundantie van 3,79. Bovendien maakte dit protocol het genereren van deuteriumopnamecurven mogelijk voor verschillende peptiden van alfa-synucleïne, die vervolgens werden uitgedrukt als aangepaste en teruguitwisseling gecorrigeerde grafieken. Het was duidelijk dat de meeste waterstof/deuterium uitwisseling in alfa-synucleïne met één seconde werd gedaan.

Het conformatieverschil tussen toestanden A en B van alfa-synucleïne was ook duidelijk uit de hogere deuteriumopname door toestand B, zowel op het peptide- als het aminozuurniveau. Voor een dergelijke gevoelige techniek is het belangrijk om robuuste statistische significantietests te gebruiken bij het vergelijken van gegevens. Hier gebruikten we onze software HDfleX.