Het meten van Caenorhabditis elegans Gevoeligheid voor de Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Dit protocol stelt onderzoekers in staat om te observeren hoe C-elgans reageren op acetylcholine receptor agonist Levamisole. Veranderde Levamisolgevoeligheid kan wijzen op defecten in de signalering op hun neuromusculaire overgang of spierfunctie. Een groot voordeel is dat het krachtige zwemmen van C-elgans in de Levamisole-oplossing onderzoekers in staat stelt om de tijdsafhankelijke verlamming van honderden wormen in slechts één uur te kwantitatief te maken.

Het tellen van het aantal wormen in elke put om de vijf minuten kan overweldigend zijn. Aantal geteste putten of tijdspunten kunnen indien nodig worden aangepast. Om te beginnen met het bereiden van nematodengroeimedia door drie gram natriumchloride, 2,5 gram pepton en 17 gram agar te combineren met een liter gedeïoniseerd water in een kolf met een roerstaaf.

Na het autoclaveren legt u de media op een hete plaat op 70 graden Celsius en roert u gedurende een uur met een gematigde snelheid. Voeg druppelsgewijs één milliliter van vijf milligram per milliliter cholesterol toe om neerslag te voorkomen. Eén milliliter van één molair calciumchloride, één milliliter van één molair magnesiumsulfaat en 25 milliliter van één molaire pH 6,0 kaliumfosfaatbuffer naar de media.

Breng twee milliliter nematodengroeimedia over in elk putje van een 24 putjesplaat met een steriele serologische pipet. Liet de platen twee dagen drogen op het bankblad voordat ze met bacteriën gingen zitten. Kies een enkele op 50 kolonie in B-bouillon en zet de cultuur 's nachts op 37 graden Celsius.

Laat met behulp van een steriele pipet 30 microliter OP50-suspensie op de agar in het midden van elke put vallen. laat de platen minstens twee dagen na het zitten op kamertemperatuur staan om een bacterieel gazon te laten ontstaan. Kweek wild type unc-63 Lev10 en unc-49 C-elgan tot volwassenheid op platen van zes centimeter, waarbij ten minste acht platen per soort worden bereid.

Bereid bleekoplossing onder de motorkap voor op de dag van synchronisatie. Meng 10 milliliter bleekmiddel, 2,5 milliliter natriumhydroxide en 37,5 milliliter gedeïoniseerd water in een kroniekbuis van 50 milliliter. Was met behulp van een plastic transferpipet volwassen wormen van ten minste vier platen met M9-buffer en breng ze over in een kroniekbuis van 15 milliliter.

Draai die 716 G gedurende één minuut op kamertemperatuur en verwijder vervolgens de super natant met behulp van een transferpipet. Voeg 10 milliliter van de bleekoplossing toe. Schud de buis voorzichtig gedurende vier minuten totdat de meeste, maar niet alle wormkarkassen zijn opgelost.

Draai op 716 G gedurende één minuut. Giet de bleekoplossing in één beweging af. Zolang de buis op dit punt niet wordt geschud, blijven de eieren aan de zijkant van de buis plakken met 15 milliliter M9-buffer en keren ze om.

Draai gedurende één minuut op 716 G en giet de M9-buffer in één vloeiende beweging af. Herhaal dit wassen met bufferoplossing drie keer. Voeg na de laatste wasbeurt 10 milliliter vers M9 toe en plaats het 's nachts op een rotator bij 15 graden Celsius om een gesynchroniseerde populatie van uitgehongerde eerste larvale stadiumdieren te isoleren.

Print uit op 24 putplaten en wijs stammen toe aan gerandomiseerde plaatsen. Ongeveer 24 uur na de bleekvoorbereiding, spin-down uitgehongerde L1-wormen bij 716 G gedurende één minuut bij kamertemperatuur. Verwijder ongeveer negen milliliter M9-buffer met een plastic transferpipet en meng vervolgens voorzichtig de uitgehongerde wormen van het eerste larvale stadium in de resterende M9-buffer.

Pipetteer onmiddellijk drie microliter van de wormen en M9 buffer op een microscoopglaasje en bepaal het aantal L1's. Het gewenste aantal is 20 tot 30 L1's in drie microliter. Pipetteer drie microliter L1's in elke put volgens de vooraf gemaakte plaatkaart, laat de wormen drie dagen lang bij 20 graden Celsius uitgroeien tot volwassenheid.

Druk het lege gegevensblad af dat zal worden gebruikt om het aantal wormen te registreren dat elke vijf minuten gedurende een uur in elke put beweegt. Controleer de wormen in de 24 putplaten. Maak met behulp van een marker een X op het plaatdeksel over putten die besmet zijn, zijn uitgehongerd of te veel wormen hebben, wat het tellen moeilijk zal maken.

Maak 0,4 millimolaire Levamisol-oplossing door 200 microliter 100 millimol levamisolvoorraad toe te voegen aan 50 milliliter M9. Start een timer en voeg vervolgens met een transferpipet een milliliter van 0,4 millimol levamisol toe aan de eerste twee putten, zodat de dieren vrij zwemmen. Blijf Levamisole toevoegen aan de aangrenzende putten, waarbij de tijd wordt gespreid op basis van het aantal te testen putten. Begin na vijf minuten handmatig alleen het aantal bewegende wormen in elke put te tellen, te beginnen met de eerste put, en noteer dat aantal op het gegevensblad.

Blijf het aantal bewegende wormen in elke put elke vijf minuten gedurende een uur tellen. Noteer aan het einde van de test of wanneer de tijd het toelaat het totale aantal wormen in elke put. Verkrijg de plaat, breng in kaart en noteer welke stam overeenkomt met elke put.

Voer de gegevens in een spreadsheet in, beginnend met het totale aantal wormen in elke put en geordend op genotype. Door gegevens uit de putten te combineren, bepaalt u het aantal wormen dat op elk tijdstip beweegt. Gebruik dit om het aantal te berekenen dat op elk tijdstip verlamt.

Maak een gegevenstabel zodat de linkerkolom de tijd aangeeft en de volgende kolommen de gegevens voor elke stam bevatten. Voor elk dier dat binnen de eerste vijf minuten verlamd is, maak je een rij en voer je een rij in voor vijf minuten. Herhaal dit voor elk tijdstip.

Voor alle dieren die aan het einde van de test niet verlamd zijn, voert u gedurende 60 minuten een nul in. Gebruik deze gegevens om een overlevingscurve te creëren in de specifieke statistische software die hier wordt gebruikt om de tijdsafhankelijke verlamming van de populatie visueel weer te geven. Gegevens voor alle geteste stammen moeten in dezelfde gegevenstabel worden ingevoerd, waarbij ruimte moet worden gelaten als dat nodig is.

Mutaties in subeenheden van de Levamisol-acetylcholinereceptor, evenals in genen die nodig zijn voor clustering van post-synaptische Levamisolgevoelige acetylcholinereceptoren, veroorzaken resistentie tegen door Levamisol geïnduceerde verlamming zoals waargenomen in respectievelijk de unc-63- en Lev-10-mutanten. Verlies van het GABA-gated ionkanaal unc-49 veroorzaakte Levamisol overgevoeligheid als gevolg van verstoring van de juiste balans van cholinerge en GABAerge signalering. Een goede voorbereiding van 24 putplaten is essentieel.

Als bacteriële gazons niet droog zijn voordat L1's worden gespot, kan de Levamisole-oplossing troebel worden tijdens de test, wat de observatie remt. Door de 24 putplaten aan te passen, kan dit protocol worden uitgevoerd met RNAi neergeslagen dieren. Hierdoor kunnen onderzoekers de genen van C-elgan bestuderen, waarvoor mutanten niet beschikbaar zijn.