Een stabiel gevestigde tweepuntsinjectie van lysofosfatidylcholine-geïnduceerd focale demyelinisatiemodel bij muizen

Ons model is zeer relevant voor demyelinisatieziekten, met name multiple sclerose. En het kan bijdragen aan het gerelateerde voortschrijdende klinisch relevante onderzoek. Het is een gedetailleerd protocol dat direct ernstige demyelinisatie snel en stabiel kan veroorzaken bij muizen door chirurgische ingreep.

Terwijl u deze techniek voor de eerste keer probeert, moet u geduldig zijn en ervoor zorgen dat de coördinaten nauwkeurig zijn. Begin met het aansluiten van een naald van 32 gauge op een spuit van 5 microliter. Trek 5 microliter LPC-oplossing op voor de bereiding van de injectie.

Bevestig vervolgens de diepte van de anesthesie van de muis door het ontbreken van een teenknijpreflex terwijl de ademhaling soepel verloopt. Plaats de muis in het stereotaxische frame met de dorsale kant naar boven en bevestig het hoofd met een neuskegel en tandklem. Bevestig de muis aan het stereotaxische apparaat met bilaterale oorbalken.

Zorg ervoor dat de oorbalken vlak zijn en dat het hoofd horizontaal en stabiel is. Desinfecteer de hoofdhuid door af te vegen met joodophor. Gebruik vervolgens scalpel om een kleine incisie te snijden tot ongeveer 1,5 centimeter langs de middellijn van de hoofdhuid om de schedel bloot te leggen.

Veeg de vaardigheid af met een wattenstaafje gedompeld in 1% waterstofperoxide totdat de bregma, lambda en posterieure fontanel zijn blootgesteld. Plaats de spuit op het stereotaxische apparaat. Zorg voor de horizontale positionering van het hoofd van het dier en lokaliseer het corpus callosum.

Zodra de injectieplaats is bepaald, registreert u de coördinaten en maakt u een markering met een marker op de schedel. Boor voorzichtig de gemarkeerde site met een schedelboor. Zorg ervoor dat u bloedingen voorkomt.

Beweeg de naald langzaam naar de gegeven coördinaten. Om corpus callosum demyelinisatie te induceren, injecteert u 2 microliter LPC-oplossing op elke injectieplaats met een snelheid van 0,4 microliter per minuut. Houd na injectie de naald nog eens 10 minuten op elke plaats.

Hecht ten slotte de huid met een 4-0 hechting en wacht tot het dier binnen 10 minuten wakker wordt. De representatieve afbeelding toont de detectie van de witte stof legioenen via Luxol snelle blauwe kleuring. Uit de resultaten kan stabiele demyelinisatie van het corpus callosum worden gezien 10 en 28 dagen na injectie.

De kwantificering van het demyelinisatiegebied op verschillende tijdstippen wordt hier weergegeven. Door immunofluorescentiekleuring afgebroken myeline basiseiwit werd een opmerkelijke toename van dMBP waargenomen in de LPC-geïnjecteerde groep 10 dagen na injectie, wat myelineverlies in het corpus callosum vertegenwoordigt. Western blot analyse van de myeline basiseiwit, of MBP, expressie toonde een significant verlies van MBP na injectie van LPC.

Beta-actine werd gebruikt als de belastingscontrole om de basislijnexpressie te meten. Elektronenmicroscopiebeelden bevestigen de gemyeliniseerde ultrastructuur in het corpus callosum van de schijngroep en de LPC-geïnjecteerde groep. GST-pi is de marker van oligodendrocytenvoorlopercel, of OPC, differentiatierijping.

Na 10 dagen LPC-injectie daalde de GST-pi in vergelijking met de schijngroep. Tegelijkertijd kan het proliferatievermogen van oligodendrocyten worden weerspiegeld door de verhouding van oligodendrocyten die prolifereren en de totale oligodendrocytenafstammingscellen. De hogere verhouding vertegenwoordigt meer proliferatie van oligodendrocyten na 10 dagen na injectie.

De representatieve afbeeldingen tonen het zwempad van de muizen in elke groep, in aanwezigheid van het platform en na het verwijderen van het platform. De resultaten suggereren dat het ruimtelijke geheugen van gedemyeliniseerde muizen aanzienlijk is aangetast in het tweepunts LPC-injectiemodel. Zorg er tijdens het proberen van deze procedure voor dat de injectiesnelheid nauwkeurig is en houd de naald nog eens 10 minuten op elke plaats.