Name: Een stabiel gevestigde tweepuntsinjectie van lysofosfatidylcholine-geïnduceerd focale demyelinisatiemodel bij muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Leer een tweepuntsinjectie van lysofosfatidylcholine voor focale demyelinisatie bij muizen. Deze stereotaxische methode creëert een stabiel model om demyelinisatiemechanismen en mogelijke therapieën voor multiple sclerose te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grants: 82071380, 81873743).

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door het Institute of Animal Care Committee van Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China. Volwassen C57BL/6 mannelijke en vrouwelijke muizen (wild type, WT; 20-25 g; 8-10 weken oud) werden gebruikt voor de huidige studie. De muizen werden verkregen uit commerciële bronnen (zie Tabel van Materialen). Muizen werden gehuisvest in een specifieke pathogeenvrije (SPF) dierenfaciliteit met water en voedsel dat ad libitum werd geleverd. Ze werden bewaard in een afwisselende periode van 12 uur licht en donker in de standaardomstandigheden van 22 °C temperatuur en relatieve vochtigheid van 55%-60%.
1. Bereiding van LPC-oplossingen
<ol><li>Los 25 mg LPC-poeder (zie materiaaltabel) op met 250 μL chloroform en methanol gemengde oplossing (1:1) om een 10% LPC-oplossing te maken en over te brengen naar een centrifugebuis van 500 μL. OPMERKING: Als de LPC niet volledig is opgelost, plaatst u de centrifugebuis in een ultrasone reiniger en ultrasoon op 40 kHz gedurende ~ 1 uur om een uniforme oplossing te verkrijgen.</li>
	<li>Verdeel de oplossing in 3 μL/buis en bewaar bij −80 °C. OPMERKING: De oplossing kan ~ 2 jaar worden bewaard.</li>
	<li>Verdun vóór de operatie de oplossing (stap 1.2.) met 27 μL 0,9% NaCl-oplossing en houd de oplossing in een waterbad met constante temperatuur bij 37 °C. OPMERKING: Bereid de oplossing vlak voordat u met de injectie begint.</li>
</ol>2. Chirurgische voorbereiding
<ol><li>Gebruik een naald van 32 G, 2 inch om verbinding te maken met een spuit van 5 μL (zie Materiaaltabel). Zorg ervoor dat de microliterspuit vrij is. Trek 5 μL LPC-oplossing op voor de bereiding van de injectie.</li>
	<li>Verdoof de muis in een inductiekamer die is aangesloten op een isofluraanverdamper met 3% isofluraan gemengd met 100% zuurstof met een snelheid van ongeveer 0,3 l/min.</li>
	<li>Bevestig de diepte van de anesthesie door het ontbreken van een teen-knijpreflex terwijl de ademhaling soepel verloopt.</li>
	<li>Scheer de kop van de muis tussen de oren met behulp van een elektrisch scheerapparaat. Breng bevochtigende oogdruppels aan om uitdroging van het hoornvlies tijdens de procedure te voorkomen.</li>
	<li>Plaats de muis vervolgens in een stereotaxisch frame (zie Materiaaltabel) met de dorsale kant naar boven en bevestig het hoofd met een neuskegel en tandklem. Onderhoud anesthesie met 1,2% -1,6% isofluraan door de neus. OPMERKING: De isofluraanconcentratie kan worden aangepast aan de ademhalingsstatus van de muizen.</li>
</ol>3. Chirurgische ingreep
OPMERKING: Dieren worden tijdens alle procedures op een verwarmingskussen geplaatst.
<ol><li>Bevestig de muis aan het stereotaxische apparaat met bilaterale oorbalken. Zorg ervoor dat de oorbalken vlak zijn en dat het hoofd horizontaal en stabiel is.</li>
	<li>Desinfecteer de huid op het hoofd door meerdere keren af te vegen met jodophor gevolgd door alcohol in cirkelvormige beweging. Gebruik vervolgens een scalpel om een kleine incisie van ongeveer 1,5 cm langs de middellijn van de hoofdhuid te snijden om de schedel bloot te leggen.</li>
	<li>Veeg de schedel af met een wattenstaafje gedompeld in 1% waterstofperoxide totdat de bregma, lambda en achterste fontanel zijn blootgesteld. Plaats de spuit op het stereotaxische apparaat. OPMERKING: Gebruik waterstofperoxide met zorg en vermijd het aanraken van de omliggende weefsels.</li>
	<li>Zorg voor een horizontale positionering van het hoofd van het dier (zowel voor als achter en links en rechts).<ol><li>Pas de Z-asknop van het stereotaxische frame aan zodat de naaldpunt en de schedel elkaar gewoon raken zonder te buigen en meet vervolgens de Z-ascoördinaat. Controleer de Z-coördinaten van bregma en posterieure fontanel.</li>
		<li>Stel de oorbalk zo in dat het verschil tussen de Z-coördinaten van bregma en posterieure fontanel niet meer dan 0,02 mm is. Volg vervolgens dezelfde methode om de Z-coördinaten van de overeenkomstige posities aan de linker- en rechterkant van de middellijn te meten. Pas de oorbalk aan om ervoor te zorgen dat links en rechts op hetzelfde niveau staan.</li>
	</ol></li>
	<li>Zoek het corpus callosum. Stel de XYZ-oorsprong in op bregma. OPMERKING: De eerste injectieplaats is 1,0 mm lateraal aan de bregma, 2,4 mm diep en 1,1 mm voorste. De tweede injectieplaats is 1,0 mm lateraal aan de bregma, 2,1 mm diep en 0,6 mm voorste. De coördinaat van de bregma is bijvoorbeeld (0,0,0). Meet de Z-coördinaat van de overeenkomstige locatie gemarkeerd als (-1, 1.1, X) en (-1, 0.6, Y). Er kan worden bepaald dat de eerste injectieplaatscoördinaat van het corpus callosum is (-1, 1,1, −[X + 2,4]), en de tweede injectieplaats (-1, 0,6, −[Y + 2,1]).</li>
	<li>Zodra de injectieplaats is bepaald, maakt u een markering met een steriele marker op de schedel en registreert u de coördinaten.</li>
	<li>Boor voorzichtig de gemarkeerde plaats met een schedelboor (zie Materiaaltabel). Zorg ervoor dat u bloedingen voorkomt.</li>
	<li>Beweeg de naald langzaam naar de gegeven coördinaten en start de injectie. Om corpus callosum demyelinisatie te induceren, injecteert u 2 μL LPC-oplossing (stap 1.) op elke injectieplaats (stap 3.5.) met een snelheid van 0,4 μL/min.</li>
	<li>Houd de naald na injectie nog eens 10 minuten op elke plaats. OPMERKING: Zorg ervoor dat het interval van twee injecties niet meer dan 20 minuten is.</li>
	<li>Hecht de huid met een 4-0 hechting en wacht tot het dier binnen 10 minuten wakker wordt. Analgetica postoperatief toedienen in overeenstemming met de voorschriften voor institutionele dierverzorging. OPMERKING: De aanbevolen tijd voor euthanasie kan worden bepaald op basis van het doel van het experiment.</li>
</ol>4. Monsterextractie voor focale demyelinisatie
OPMERKING: Voor meer informatie over deze stap, zie het eerder gepubliceerde rapport14.
<ol><li>Los neutrale rode kleurstof (zie materiaaltabel) op in een 1% oplossing in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
	<li>uren voordat u de muizen opoffert (voor details, zie vorige referentie10), injecteert u 500 μL 1% neutrale rode kleurstof in PBS door intraperitoneale injectie voor elke muis.</li>
	<li>Voer hartperfusie12 uit met 30 ml van 0,1% PBS voorgekoeld bij 4 °C.</li>
	<li>Snijd de hersenen in 1 mm met een hersenvorm (zie Tabel met materialen).</li>
	<li>Visualiseer de laesie gekleurd met neutraal rood onder de microscoop en dissociëer de laesie. OPMERKING: Verwijder zoveel mogelijk omringend normaal weefsel om de nauwkeurigheid van de daaropvolgende analyse te verbeteren. Het laesieweefsel kan worden onderzocht met RT-PCR, elektronenmicroscopie en western blot-analyses.</li>
</ol>5. Histologische kleuring en immunofluorescentie
<ol><li>Voor histologische kleuring en immunofluorescentie12, na hartperfusie (stap 4.3.), verwijder de hersenen10, fixeer in 4% PFA 's nachts (bij 4 °C) en droog volledig uit in 30% sucrose.</li>
	<li>Snijd in 20 mm coronale hersensecties met behulp van een bevroren snijmachine10 bij constante temperatuur (−20 °C).</li>
	<li>Gebruik de plakjes voor Luxol fast blue (LFB) kleuring, immunofluorescentie en western blot10.</li>
</ol>

<ol><li>Gaire, B. P., Choi, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+roles+of+lysophospholipid+receptors+in+activation+of+neuroglia+and+their+neuroinflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864(2021).</li>
<li>Compston, A., Coles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis.</a> Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).</li>
<li>Dobson, R., Giovannoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis+-+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis - a review.</a> European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).</li>
<li>Mahad, D. H., Trapp, B. D., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+mechanisms+in+progressive+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Pathological mechanisms in progressive multiple sclerosis.</a> The Lancet Neurology. 14 (2), 183-193 (2015).</li>
<li>Filippi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis.</a> Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 43(2018).</li>
<li>Villoslada, P., Steinman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+targets+and+therapeutics+for+neuroprotection%2C+remyelination+and+repair+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Investigational+Drugs%22%5BJournal%5D)">New targets and therapeutics for neuroprotection, remyelination and repair in multiple sclerosis.</a> Expert Opinion on Investigational Drugs. 29 (5), 443-459 (2020).</li>
<li>Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis pathology.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936(2018).</li>
<li>Franklin, R. J., Ffrench-Constant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+in+the+CNS%3A+From+biology+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Remyelination in the CNS: From biology to therapy.</a> Nature Reviews Neuroscience. 9 (11), 839-855 (2008).</li>
<li>Gentile, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+effects+of+exercise+in+experimental+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory effects of exercise in experimental multiple sclerosis.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2197(2019).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+microglial+Hv1+channel+is+associated+with+activation+of+autophagic+pathway+and+ROS+production+in+LPC-induced+demyelination+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Deficiency of microglial Hv1 channel is associated with activation of autophagic pathway and ROS production in LPC-induced demyelination mouse model.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 333(2020).</li>
<li>Luo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+and+easily+reproducible+model+of+focal+white+matter+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A stable and easily reproducible model of focal white matter demyelination.</a> Journal of Neuroscience Methods. 307, 230-239 (2018).</li>
<li>Blakemore, W. F., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+in+experimental+models+of+toxin-induced+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Remyelination in experimental models of toxin-induced demyelination.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 318, 193-212 (2008).</li>
<li>Degaonkar, M. N., Raghunathan, P., Jayasundar, R., Jagannathan, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+relaxation+characteristics+during+preacute+stage+of+lysophosphatidyl+choline-induced+demyelinating+lesion+in+rat+brain%3A+An+animal+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+Imaging%22%5BJournal%5D)">Determination of relaxation characteristics during preacute stage of lysophosphatidyl choline-induced demyelinating lesion in rat brain: An animal model of multiple sclerosis.</a> Magnetic Resonance Imaging. 23 (1), 69-73 (2005).</li>
<li>Baydyuk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+evolution+of+CNS+remyelinating+lesion+in+mice+with+neutral+red+dye%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).</li>
<li>Plemel, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+lysophosphatidylcholine-induced+demyelination%3A+A+primary+lipid+disrupting+myelinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of lysophosphatidylcholine-induced demyelination: A primary lipid disrupting myelinopathy.</a> Glia. 66 (2), 327-347 (2018).</li>
<li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+oligodendrocyte+differentiation+by+Olig2+and+Sox10%3A+evidence+for+reciprocal+interactions+and+dosage-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms.</a> Developmental Biology. 302 (2), 683-693 (2007).</li>
<li>Kassis, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+expression+in+white+matter+oligodendrocytes+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase expression in white matter oligodendrocytes after stroke.</a> Neurochemistry International. 77, 17-23 (2014).</li>
<li>Vorhees, C. V., Williams, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morris+water+maze%3A+Procedures+for+assessing+spatial+and+related+forms+of+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Morris water maze: Procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory.</a> Nature Protocols. 1 (2), 848-858 (2006).</li>
<li>Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+focal+EAE+model+of+cortical+demyelination%3A+multiple+sclerosis-like+lesions+with+rapid+resolution+of+inflammation+and+extensive+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination.</a> Brain. 129, Pt 8 1972-1983 (2006).</li>
<li>Karussis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+of+multiple+sclerosis+and+the+various+related+demyelinating+syndromes%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review.</a> Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).</li>
<li>Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+macrophages+in+progressive+multiple+sclerosis%3A+Relationship+to+neurodegeneration+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: Relationship to neurodegeneration and therapeutics.</a> Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 45(2022).</li>
<li>Kutzelnigg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+demyelination+and+diffuse+white+matter+injury+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Cortical demyelination and diffuse white matter injury in multiple sclerosis.</a> Brain. 128, Pt 11 2705-2712 (2005).</li>
<li>Lassmann, H., Bradl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+Experimental+models+and+reality%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: Experimental models and reality).</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 223-244 (2017).</li>
<li>Lamport, A. C., Chedrawe, M., Nichols, M., Robertson, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+accelerates+remyelination+after+lysophosphatidylcholine-induced+demyelination+in+the+corpus+callosum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune encephalomyelitis accelerates remyelination after lysophosphatidylcholine-induced demyelination in the corpus callosum.</a> Journal of Neuroimmunology. 334, 576995(2019).</li>
<li>Torkildsen, O., Brunborg, L. A., Myhr, K. M., Bo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuprizone+model+for+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurologica+Scandinavica.+Supplementum%22%5BJournal%5D)">The cuprizone model for demyelination.</a> Acta Neurologica Scandinavica. Supplementum. 188, 72-76 (2008).</li>
<li>Zhan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuprizone+model%3A+Dos+and+do+nots%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The cuprizone model: Dos and do nots.</a> Cells. 9 (4), 843(2020).</li>
<li>Torre-Fuentes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+demyelination+and+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Neurologia+%28Barcelona%2C+Spain%29%22%5BJournal%5D)">Experimental models of demyelination and remyelination.</a> Neurologia (Barcelona, Spain). 35 (1), 32-39 (2020).</li>
<li>Merkler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein-induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+common+marmoset+reflects+the+immunopathology+of+pattern+II+multiple+sclerosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis+Journal%22%5BJournal%5D)">Myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental autoimmune encephalomyelitis in the common marmoset reflects the immunopathology of pattern II multiple sclerosis lesions.</a> Multiple Sclerosis Journal. 12 (4), 369-374 (2006).</li>
<li>Ucal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+cortical+demyelination+of+both+hemispheres+can+be+induced+by+injection+of+pro-inflammatory+cytokines+via+an+implanted+catheter+in+the+cortex+of+MOG-immunized+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Widespread cortical demyelination of both hemispheres can be induced by injection of pro-inflammatory cytokines via an implanted catheter in the cortex of MOG-immunized rats.</a> Experimental Neurology. 294, 32-44 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

MS, een chronische demyeliniserende ziekte van het CZS, is een van de meest voorkomende oorzaken van neurologische disfunctie bij jonge volwassenen20. Klinisch ervaren ongeveer 60%-80% van de MS-patiënten de cyclus van recidieven en remissies voordat ze een secundair progressieve MS21,22 ontwikkelen, en het leidt uiteindelijk tot cumulatieve bewegingsstoornissen en cognitieve tekorten in de loop van de tijd23. Momen...

Receptorgemedieerde lysofosfolipide signalering omvat diverse fysiologische processen van bijna alle orgaansystemen1. In het centrale zenuwstelsel (CZS) speelt deze signalering een cruciale rol bij de pathogenieën van auto-immuun neurologische ziekten zoals multiple sclerose (MS). Multiple sclerose is een chronische immuungemedieerde aandoening die wordt gekenmerkt door pathologische demyelinisatie en ontstekingsreactie, waardoor neurologische disfunctie en cognitieve stoornissen ontstaan 2,3. Na continue terugval en remitting tijdens de vroege ziekte, gaan de meeste patiënten uiteindelijk door naar het secundair-progressieve stadium, wat onomkeerbare schade aan de hersenen en de daaruit voortvloeiende invaliditeit kan veroorzaken4. Er wordt aangenomen dat het pathologische kenmerk van het secundair-progressieve beloop het demyeliniseren van plaques veroorzaakt door inflammatoire laesiesis 5. Bestaande behandelingen voor MS kunnen het risico op terugval aanzienlijk verminderen. Er is echter nog steeds geen effectieve therapie voor langdurige demyeliniserende schade veroorzaakt door progressieve MS6. Er is dus een stabiel en gemakkelijk reproduceerbaar model nodig om preklinische therapieën te bestuderen die zich richten op degeneratie van witte stof.
Demyelinisatie en remyelinisatie zijn twee belangrijke pathologische processen bij het ontwikkelen van multiple sclerose. Demyelinisatie is het verlies van myelineschede rond axonen geïnduceerd door microglia met pro-inflammatoire fenotypen7, en het leidt tot langzame geleiding van zenuwimpulsen en resulteert in het verlies van neuronen en neurologische aandoeningen. Remyelinisatie is een endogene reparatierespons gemedieerd door oligodendrocyten, waarbij aandoeningen kunnen leiden tot neurodegeneratie en cognitieve stoornissen8. De ontstekingsreactie is cruciaal voor het hele proces en beïnvloedt zowel de mate van myelineschade als het herstel.
Daarom is een stabiel diermodel van aanhoudende inflammatoire demyelinisatie zinvol voor verdere verkenning van therapeutische strategieën voor MS. Vanwege de complexiteit van MS zijn verschillende soorten diermodellen opgesteld om demyeliniserende laesies in vivo na te bootsen, waaronder experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE), toxisch-demyeliniserende modellen, cuprizon (CPZ) en lysofosfosfatidylcholine (LPC)9 . LPC is een endogene lysofosfolipide geassocieerd met ontsteking, en het kan snelle schade veroorzaken met toxiciteit voor myeline lipiden, wat leidt tot focale demyelinisatie. Op basis van eerdere rapporten en onderzoek10,11 wordt een gedetailleerd protocol van tweepuntsinjectie met enkele wijzigingen verstrekt. Over het algemeen produceert het klassieke eenpunts LPC-injectiemodel alleen lokale demyelinisatie op de injectieplaats en gaat het vaak gepaard met spontane remyelinisatie12,13. Het tweepuntsinjectie LPC-model kan echter aantonen dat de LPC direct demyelinisatie in het corpus callosum van de muis kan induceren en duurzamere demyelinisatie kan veroorzaken met weinig myelineregeneratie.

<table><tbody><tr><td>L-&alpha;-Lysophosphatidylcholine uit dooier</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4129-25MG</td><td></td></tr><tr><td>32 gauge Naald</td><td>HAMILTON</td><td>7762-05</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu;l spuit</td><td>HAMILTON</td><td>80014</td><td></td></tr><tr><td>hoge snelheid schedelboor</td><td>strong,korea</td><td>strong204</td><td></td></tr><tr><td>boor</td><td>Hager &amp; Meisinger, Duitsland&nbsp;</td><td>REF 500 104 001 001 005</td><td></td></tr><tr><td>Matrx dier Anesthesie Ventilator</td><td>MIDMARK</td><td>VMR</td><td></td></tr><tr><td>Draagbare Stereotaxische Instrument voor Muis</td><td>Reward</td><td>68507</td><td></td></tr><tr><td>Micro spuit</td><td>Reward</td><td>KDS LEGATO 130</td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan&nbsp;</td><td>VETEASY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Servicebio</td><td>G1101</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatbuffer</td><td>BOSTER</td><td>PYG0021</td><td></td></tr><tr><td>LuxoL snelle bLue</td><td>Servicebio</td><td>G1030-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Hechtdraad</td><td>FUSUNPHARMA</td><td>20152021225</td><td></td></tr><tr><td>Hersenvorm</td><td>Reward</td><td>68707</td><td></td></tr><tr><td>Elektronenmicroscoop fixeermiddel</td><td>Servicebio</td><td>G1102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Neutral red (C.I. 50040), voor microscopie Certistain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.01376</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Myelin Basic Protein Antilichaam&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>#AB5864</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GST-P pAb</td><td>MBL</td><td>#311</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 Monoklonaal Antilichaam (SolA15)</td><td>Thermo Fisher&nbsp;Scientific</td><td>14-5698-95</td><td></td></tr><tr><td>Beta Actin Monoklonaal Antilichaam</td><td>Proteintech</td><td>66009-1-Ig&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Myelin Basic Protein Polyklonaal Antilichaam</td><td>Proteintech</td><td>10458-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>OLIG2 Polyklonaal Antilichaam</td><td>Proteintech</td><td>13999-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488&nbsp;AffiniPure&nbsp;Donkey anti-Konijn&nbsp;IgG (H+L)</td><td>YEASEN</td><td>34206ES60</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Ratten IgG (H+L)&nbsp;</td><td>YEASEN</td><td>34412ES60</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594&nbsp;AffiniPure Donkey Anti-Konijn IgG (H+L)&nbsp;</td><td>YEASEN</td><td>34212ES60</td><td></td></tr><tr><td>HRP Geit Anti-Konijn IgG (H+L)</td><td>abclonal</td><td>AS014</td><td></td></tr><tr><td>HRP Geit Anti-Muis IgG (H+L)&nbsp;</td><td>abclonal</td><td>AS003</td><td></td></tr><tr><td>Volwassen C57BL/6 mannelijke en vrouwelijke muizen</td><td>Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een stabiel gevestigde tweepuntsinjectie van lysofosfatidylcholine-geïnduceerd focale demyelinisatiemodel bij muizen

A Stably Established Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine-Induced Focal Demyelination Model in Mice

Receptorgemedieerde lysofosfolipidensignalering draagt bij aan de pathofysiologie van diverse neurologische ziekten, met name multiple sclerose (MS). Lysophosphatidylcholine (LPC) is een endogene lysofosfolipide geassocieerd met ontsteking, en het kan snelle schade veroorzaken met toxiciteit voor myeline lipiden, wat leidt tot focale demyelinisatie. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor stereotactische tweepunts LPC-injectie die direct ernstige demyelinisatie kan veroorzaken en de experimentele demyelinisatiebeschadiging snel en stabiel bij muizen kan repliceren door chirurgische ingreep. Dit model is dus zeer relevant voor demyelinisatieziekten, met name MS, en het kan bijdragen aan het gerelateerde voortschrijdende klinisch relevante onderzoek. Ook werden immunofluorescentie en Luxol snelle blauwe kleuringsmethoden gebruikt om het tijdsverloop van demyelinisatie in het corpus callosum van muizen geïnjecteerd met LPC weer te geven. Daarnaast werd de gedragsmethode gebruikt om de cognitieve functie van muizen na modellering te evalueren. Over het algemeen is de tweepuntsinjectie van lysofosfatidylcholine via een stereotaxisch frame een stabiele en reproduceerbare methode om een demyelinisatiemodel bij muizen te genereren voor verder onderzoek.

Tweepuntsinjectie van de LPC resulteerde in een duurzamere demyelinisatie LPC leidt voornamelijk tot snelle schade met toxiciteit voor myeline en splitsing van de axonintegriteit15. De dag van injectie werd beschouwd als dag 0. Muizen werden gedurende een periode van 10-28 dagen (10 dpi en 28 dpi) gehouden. Luxol fast blue (LFB) kleuring10 werd gebruikt om het gebied van demyelinisatie bij muizen op deze tijdstippen te evalueren. In het tweepuntsinjectie...

Het huidige protocol beschrijft een tweepuntsinjectie van lysofosfatidylcholine via een stereotaxisch frame om een stabiel en reproduceerbaar demyelinisatiemodel bij muizen te genereren.

Een stabiel gevestigde tweepuntsinjectie van lysofosfatidylcholine-geïnduceerd focale demyelinisatiemodel bij muizen

Receptor-mediated lysophospholipid signaling contributes to the pathophysiology of diverse neurological diseases, especially multiple sclerosis (MS). ...

Ons model is zeer relevant voor demyelinisatieziekten, met name multiple sclerose. En het kan bijdragen aan het gerelateerde voortschrijdende klinisch relevante onderzoek. Het is een gedetailleerd protocol dat direct ernstige demyelinisatie snel en stabiel kan veroorzaken bij muizen door chirurgische ingreep.Terwijl u deze techniek voor de eerste keer probeert, moet u geduldig zijn en ervoor zorgen dat de coördinaten nauwkeurig zijn. Begin met het aansluiten van een naald van 32 gauge op een spuit van 5 microliter. Trek 5 microliter LPC-oplossing op voor de bereiding van de injectie.Bevestig vervolgens de diepte van de anesthesie van de muis door het ontbreken van een teenknijpreflex terwijl de ademhaling soepel verloopt. Plaats de muis in het stereotaxische frame met de dorsale kant naar boven en bevestig het hoofd met een neuskegel en tandklem. Bevestig de muis aan het stereotaxische apparaat met bilaterale oorbalken.Zorg ervoor dat de oorbalken vlak zijn en dat het hoofd horizontaal en stabiel is. Desinfecteer de hoofdhuid door af te vegen met joodophor. Gebruik vervolgens scalpel om een kleine incisie te snijden tot ongeveer 1,5 centimeter langs de middellijn van de hoofdhuid om de schedel bloot te leggen.Veeg de vaardigheid af met een wattenstaafje gedompeld in 1% waterstofperoxide totdat de bregma, lambda en posterieure fontanel zijn blootgesteld. Plaats de spuit op het stereotaxische apparaat. Zorg voor de horizontale positionering van het hoofd van het dier en lokaliseer het corpus callosum.Zodra de injectieplaats is bepaald, registreert u de coördinaten en maakt u een markering met een marker op de schedel. Boor voorzichtig de gemarkeerde site met een schedelboor. Zorg ervoor dat u bloedingen voorkomt.Beweeg de naald langzaam naar de gegeven coördinaten. Om corpus callosum demyelinisatie te induceren, injecteert u 2 microliter LPC-oplossing op elke injectieplaats met een snelheid van 0,4 microliter per minuut. Houd na injectie de naald nog eens 10 minuten op elke plaats.Hecht ten slotte de huid met een 4-0 hechting en wacht tot het dier binnen 10 minuten wakker wordt. De representatieve afbeelding toont de detectie van de witte stof legioenen via Luxol snelle blauwe kleuring. Uit de resultaten kan stabiele demyelinisatie van het corpus callosum worden gezien 10 en 28 dagen na injectie.De kwantificering van het demyelinisatiegebied op verschillende tijdstippen wordt hier weergegeven. Door immunofluorescentiekleuring afgebroken myeline basiseiwit werd een opmerkelijke toename van dMBP waargenomen in de LPC-geïnjecteerde groep 10 dagen na injectie, wat myelineverlies in het corpus callosum vertegenwoordigt. Western blot analyse van de myeline basiseiwit, of MBP, expressie toonde een significant verlies van MBP na injectie van LPC.Beta-actine werd gebruikt als de belastingscontrole om de basislijnexpressie te meten. Elektronenmicroscopiebeelden bevestigen de gemyeliniseerde ultrastructuur in het corpus callosum van de schijngroep en de LPC-geïnjecteerde groep. GST-pi is de marker van oligodendrocytenvoorlopercel, of OPC, differentiatierijping.Na 10 dagen LPC-injectie daalde de GST-pi in vergelijking met de schijngroep. Tegelijkertijd kan het proliferatievermogen van oligodendrocyten worden weerspiegeld door de verhouding van oligodendrocyten die prolifereren en de totale oligodendrocytenafstammingscellen. De hogere verhouding vertegenwoordigt meer proliferatie van oligodendrocyten na 10 dagen na injectie.De representatieve afbeeldingen tonen het zwempad van de muizen in elke groep, in aanwezigheid van het platform en na het verwijderen van het platform. De resultaten suggereren dat het ruimtelijke geheugen van gedemyeliniseerde muizen aanzienlijk is aangetast in het tweepunts LPC-injectiemodel. Zorg er tijdens het proberen van deze procedure voor dat de injectiesnelheid nauwkeurig is en houd de naald nog eens 10 minuten op elke plaats.

a-stably-established-two-point-injection-lysophosphatidylcholine

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

The video demonstrates the induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in a mouse model by injecting a combination of myelin oligodendrocyte glycoproteins and inactivated Mycobacterium tuberculosis. The model enables researchers to study disease mechanisms and test therapeutic interventions.

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in a Mouse Model

This video demonstrates the procedure of surgically accessing the optic nerve in an anesthetized animal and precisely delivering lysolecithin to induce focal demyelination, creating neuropathological conditions for further study.

Inducing Local Demyelination in the Optic Nerve Using Lysolecithin

In this video, a mouse model of multiple sclerosis is established using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). The mouse is injected with an emulsion containing a neuronal peptide and an adjuvant, triggering an immune response that activates autoreactive T cells. This is followed by an injection of pertussis toxin (PTX) to increase blood-brain barrier permeability, allowing the autoreactive T-cells to infiltrate the brain. This infiltration initiates a signaling cascade that...

This video demonstrates the generation of a focal demyelination mouse model using a two-point Lysophosphatidylcholine (LPC) injection. The skull of an anesthetized mouse is exposed. The injection coordinates are determined, and a hole is drilled to enable LPC injections at targeted sites. LPC induces focal demyelination of neurons via inflammation, while a two-point injection ensures its sustainability.

Establishing a Focal Demyelination Mouse Model via a Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine

This video demonstrates the method for inducing demyelination in mouse spinal cord neurons using lysolecithin injections, followed by remyelination through the migration and differentiation of oligodendrocyte precursor cells. The process impairs and then gradually restores neuronal signal transmission.

Demyelination and Remyelination of Mouse Spinal Cord Neurons

Source: Wang, X. et. al., Osmotic Pump-based Drug-delivery for In Vivo Remyelination Research on the Central Nervous System. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the method for delivering neurotherapeutic drugs using an osmotic pump in a demyelinated mouse model. The controlled drug release promotes remyelination by activating myelin-producing cells in the corpus callosum.

 Osmotic Pump-Based Neurotherapeutic Drug Delivery in a Demyelinated Mouse Model

Een nieuw ex vivo voorbereiding voor het afbeelden van de muis ruggenmerg. Dit protocol maakt twee-foton beeldvorming van levende cellulaire interacties gehele ruggenmerg.

Twee-foton Imaging van Cellular Dynamics in de Muis Spinal Cord

Demyeliniserende ziekten kunnen worden gemodelleerd bij dieren door lokale toepassing van lysolecithin in het CZS. Een enkele injectie van lysolecithin in het ruggenmerg van muizen produceert een laesie die zich na verloop van tijd spontaan herstelt. Het doel is om factoren te bestuderen die betrokken zijn bij de- en remyelinisatie en middelen te testen om het herstel te verbeteren.

Experimentele Demyelinisatie en Remyelinisatie van Muriene Spinal Cord door Focal Injectie van lysolecithine

Het hier gepresenteerde protocol maakt de reproductie mogelijk van een wijdverspreide demyelinatie van grijze stof van beide corticale hemisferen bij volwassen mannelijke Dark Agouti-ratten. De methode bestaat uit intracerebrale implantatie van een katheter, subklinische immunisatie tegen myeline oligodendrocyt glycoproteïne en intracerebrale injectie van een pro-inflammatoir cytokinemengsel via de geïmplanteerde katheter.

Rat model van wijdverspreide cerebrale corticale demyelinatie geïnduceerd door een intracerebrale injectie van pro-inflammatoire cytokinen

Demyelinisatie vindt plaats bij meerdere ziekten van het centrale zenuwstelsel. Een betrouwbare in vivo medicijnafgiftetechniek is noodzakelijk voor het remyeliniseren van drugstests. Dit protocol beschrijft een op osmotische pomp gebaseerde methode die langdurige medicijnafgifte rechtstreeks in het hersenparenchym mogelijk maakt en de biologische beschikbaarheid van het geneesmiddel verbetert, met brede toepassing in remyelinisatieonderzoek.

Osmotische pomp-gebaseerde medicijnafgifte voor in vivo remyelinisatieonderzoek op het centrale zenuwstelsel

Het huidige protocol beschrijft de inductie van experimentele auto-immune encefalomyelitis in een muismodel met behulp van myeline oligodendrocytenglycoproteïne en het monitoren van het ziekteproces met behulp van een klinisch scoresysteem. Experimentele auto-immuun encefalomyelitis-gerelateerde symptomen worden geanalyseerd met behulp van muis femur micro-computertomografie analyse en open veld test om het ziekteproces uitgebreid te beoordelen.

Inductie- en diverse beoordelingsindicatoren van experimentele auto-immuun encefalomyelitis

Leer een tweepuntsinjectie van lysofosfatidylcholine voor focale demyelinisatie bij muizen. Deze stereotaxische methode creëert een stabiel model om demyelinisatiemechanismen en mogelijke therapieën voor multiple sclerose te bestuderen.

Een stabiel gevestigde tweepuntsinjectie van lysofosfatidylcholine-geïnduceerd focale demyelinisatiemodel bij muizen

Meer video's verkennen