Name: Grootschalige Gravitaxis-test van Caenorhabditis Dauer-larven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Leer een grootschalige gravitaxismethode voor Caenorhabditis dauer-larven. Dit protocol verbetert de detectie van gravitaxisgedrag ten opzichte van traditionele plaatassays en biedt inzicht in zwaartekrachtwaarneming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek werd ondersteund door onderzoekssubsidies van de National Institutes of Health aan JHR (#R01 5R01HD081266 en #R01GM141493). Sommige stammen werden geleverd door de CGC, die wordt gefinancierd door het NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). We willen Pradeep Joshi (UCSB) bedanken voor zijn redactionele inbreng. Statistische raadpleging door het UCSB DATALAB.

De stammen die in deze studie worden gebruikt zijn C. elegans (N2) en C. briggsae (AF16) (zie Materiaaltabel). Voor elke test werd een populatie van dauers van gemengd geslacht gebruikt.
1. Kamervoorbereiding
<ol><li>Werk in een zuurkast. Richt de werkruimte in met een Bunsen-brander, 1-2 scheermesjes, tangen, pincetten en een plastic snijoppervlak (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Verzamel voor elke kamer twee serologische pipetten van 5 ml. Verwijder de katoenen plug van een pipet met een pincet. Houd een scheermesje boven de Bunsen brander tot het heet is met een tang. Gebruik het verwarmde mes om het taps toelopende uiteinde van de tweede pipet af te snijden, zodat de hele pipet een uniforme diameter heeft (figuur 1A).</li>
	<li>Werk snel, breng de twee gemodificeerde pipetuiteinden dicht bij de vlam en smelt ze enigszins. Verbind deze uiteinden door ze stevig tegen elkaar te drukken, zodat de wanden van beide pipetten continu zijn. Als er na het samenvoegen openingen zichtbaar zijn, breek deze dan uit elkaar en herhaal deze stap (figuur 1A,B).</li>
</ol>2. De kamers vullen met agar
<ol><li>Bereid NGM met 4% agar volgens standaard wormprocedures21. Terwijl de agar nog steeds gesmolten is, vult u elke kamer door deze aan een serologische pipettor te bevestigen en de oplossing langzaam op te trekken. Sluit de punt af met paraffinefilm voordat u de kamer uit de pipettor verwijdert. Leg de kamer plat (parallel aan het bankblad) om af te koelen. OPMERKING: Het bedekken van de kolf met vershoudfolie (zie Materiaaltabel) na het autoclaveren helpt voorkomen dat er bellen in de oplossing ontstaan18.<ol><li>Om eventuele variaties in de consistentie van de agar als gevolg van ongelijke koeling te minimaliseren, houdt u de pipettor (zie Materiaaltabel) parallel aan het tafelblad terwijl u de agar opstelt. Leg de kamers plat op het bankje en laat de agar uitharden voordat je gaat bewegen. OPMERKING: Het agarpercentage en de media-inhoud kunnen worden aangepast aan het experiment. 4% agar is stijver dan de concentratie van ongeveer 2% die wordt gebruikt voor het gieten van platen en voorkomt dat wormen zich door het medium in onze handen graven. Andere onderzoekers hebben echter graafgedrag van volwassen wormen waargenomen in maximaal 9% agar18,19.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwarm na het afkoelen een inbussleutel van 3 mm (of een ander metalen gereedschap van dezelfde grootte, zie Materiaaltabel) boven een Bunsen-brander. Druk het stevig in de wand van elke kamer ongeveer 5 mm aan één kant van de middellijn, waardoor een kleine opening in het plastic ontstaat (figuur 1C). Gebruik een verwarmd mes om de katoenen en taps toelopende uiteinden van de kamer te verwijderen en sluit deze uiteinden af met paraffinefilm. OPMERKING: Eenmaal bereid, moet elke kamer binnen 1 dag worden gebruikt of gedurende enkele dagen op 4 °C worden gehouden. Bedek eventuele blootgestelde openingen met paraffinefilm om te voorkomen dat de agar uitdroogt.</li>
</ol>3. Dauerlarven isoleren
<ol><li>10-15 dagen voorafgaand aan het experiment, snijd elke stam op 2-3 grote NGM-platen met OP50-bacteriën en wikkel met paraffinefilm. Na 10-15 dagen moet elke plaat volledig worden uitgehongerd met duizenden dauerlarven aanwezig op de agar, muren en deksels. OPMERKING: Maak borden van tevoren met behulp van een dik OP50-recept voor maximale drukte (zie Materiaaltabel). Dauervorming kan ook worden geïnduceerd door andere methoden, waaronder de toevoeging van feromonen of door te groeien bij hogere temperaturen22.</li>
	<li>Verzamel wormen door de deksels en platen met M9-buffer te spoelen en de oplossing in centrifugebuizen van 15 ml te pipetteren. Draai op 1.600 x g gedurende 30-60 s bij kamertemperatuur en zuig het grootste deel van de M9-buffer aan met een pipet of vacuümaspirator.</li>
	<li>Isoleer dauers door behandeling met 1% SDS gevolgd door een sucrose flotatiegradiënt van 30% volgens het eerder gepubliceerde rapport20.<ol><li>Voeg 7 ml 1% SDS-oplossing toe aan elke wormpellet. Laat de wormen 30 minuten in SDS staan; draai de buizen gedurende deze tijd continu om beluchting mogelijk te maken. Spoel 3-5x af met M9 om het wasmiddel te verwijderen.</li>
		<li>Voeg vervolgens 5 ml M9 toe, gevolgd door 5 ml koude, gefilterde 60% sucrose-oplossing. Meng grondig en centrifugeer vervolgens op 1.600 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om een scheidingsgradiënt te creëren.</li>
	</ol></li>
	<li>Vul nieuwe centrifugebuizen van 15 ml met 2 ml M9-buffer. Plet de uiteinden van glazen Pasteur-pipetten om de boring te verbreden en gebruik deze pipetten om de bovenste laag van de oplossing (met geïsoleerde dauers) van de sucrosegradiënt naar de nieuwe buizen over te brengen. Spoel de dauers 3-5x af met M9. OPMERKING: Er zullen op dit moment duizenden geïsoleerde dauers in oplossing zijn. Ze kunnen onmiddellijk worden gebruikt of belucht worden gehouden door een nacht in 5-7 ml M9 te draaien.</li>
</ol>4. Dauers toevoegen aan de kamer
<ol><li>Centrifugeer dauers bij 1.600 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en zuig het grootste deel van de M9-oplossing aan met een pipet of vacuümaspirator. Om de wormdichtheid te schatten, telt u handmatig het aantal wormen in drie afzonderlijke druppeltjes van 1 μL onder een ontleedmicroscoop. Gebruik het gemiddelde van deze tellingen om het aantal wormen per μL te benaderen. OPMERKING: Sommige pipettors met een klein volume kunnen mogelijk niet de bodem van een centrifugebuis van 15 ml bereiken; in dit geval kan een geconcentreerde druppel wormen eerst worden overgebracht naar een stuk paraffinefilm.</li>
	<li>Snijd het uiteinde van een pipetpunt van 10, 20 of 200 μL om de boring te verbreden. Stel de micropipette in op een iets groter volume dan het beoogde aspiratievolume. Zuig ongeveer 1-2 μL van de geconcentreerde wormoplossing aan (idealiter tussen 100-300 wormen) en laat een kleine hoeveelheid lucht in de punt komen. OPMERKING: Grote aantallen wormen (1.000+) in één kamer kunnen het bereik van afgelegde afstanden vergroten als gevolg van overbevolking9.</li>
	<li>Duw de pipetpunt voorzichtig in de agar terwijl u de micropipette indrukt. Hierdoor ontstaat een injectieplaats in de agar zonder de punt te verstoppen. Laat de wormen los in de agar. Gebruik paraffinefolie om de opening af te sluiten.</li>
</ol>5. Uitvoeren en scoren van de test
OPMERKING: Gravitaxis kan worden getest onder verschillende omstandigheden die van invloed kunnen zijn op gedrag9.
<ol><li>Om zoveel mogelijk variabelen te elimineren, plaatst u de kamers in een donkere kooi van Faraday (zie Materiaaltabel) bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Label elke kamer en hang deze verticaal in de kooi van Faraday (voer dit uit met behulp van labeling tape). Test horizontale controles gelijktijdig door sommige kamers plat te leggen binnen dezelfde omgevingsomstandigheden. Test de experimentele stammen tegen verticaal georiënteerde N2-wormen als een positieve controle. Gebruik horizontaal georiënteerde kamers met N2 dauers als extra negatieve controle. OPMERKING: Horizontale en verticale testen moeten in dezelfde omgeving binnen het laboratorium worden uitgevoerd om de omgevingsvariabiliteit tussen de twee omstandigheden te minimaliseren. Een grote incubator kan worden gebruikt om beide kooien van Faraday te huisvesten.</li>
	<li>Dauers beginnen zich na een paar uur van de startplaats te verspreiden en doen er enkele uren over om beide uiteinden van de kamer te bereiken. Laat de kamers gedurende deze tijd ongestoord en scoor binnen 12-24 uur na injectie. OPMERKING: Gebruik geen verlamd middel (zoals natriumazide) om wormen te immobiliseren die de uiteinden van de kamers hebben bereikt. Omdat de totale verspreiding van wormen wordt gemeten in plaats van een voorkeursindex (zoals in een test met twee keuzes), is natriumazide onnodig en kan het de resultaten veranderen.</li>
	<li>Verwijder en scoor gravitaxiskamers één voor één. Zoek naar levende dauers onder een ontleedmicroscoop en markeer hun locaties in inkt (figuur 1C, D). Scoor geen wormen binnen 2,5 cm aan weerszijden van de injectieplaats, omdat deze wormen waarschijnlijk geen richtingsvoorkeur vertonen.<ol><li>Vermijd ook het scoren van wormen die dood lijken of gevangen zitten in de vloeistof. Gooi alle kamers met >50% dode of zwemmende wormen weg. OPMERKING: Zodra de kamer uit het testgebied is verwijderd, moet deze onmiddellijk worden gescoord op nauwkeurigheid. Dauers mogen alleen zichtbaar zijn tussen het oppervlak van de agar en de muur van de pipet. Als graafgedrag wordt waargenomen, overweeg dan om de agarconcentratie in toekomstige testen te verhogen.</li>
	</ol></li>
	<li>Om de resultaten te kwantificeren, gebruikt u een marker om elke helft van de kamer te verdelen in zeven secties van 3,5 cm vanaf 2,5 cm afstand van de injectieplaats (op sommige pipetten 3,5 cm = 1 ml volume). Gebruik een handmatige tellingsteller (zie Tabel met materialen) om het aantal wormen te tellen dat in elke sectie is waargenomen. OPMERKING: Er moeten zeven secties aan elke kant van de oorsprong zijn, die kunnen worden genummerd van -7 (onder) tot +7 (boven). Deze getallen moeten overeenkomen met dezelfde relatieve locaties op basis van hoe de kamers zijn gebouwd; agar wordt getrokken van het -7-uiteinde naar het +7-einde in stap 2.</li>
</ol>

<ol><li>Peterka, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+integration+for+human+balance+control%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Clinical+Neurology%22%5BJournal%5D)">Sensory integration for human balance control.</a> Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).</li>
<li>Lacquaniti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisensory+Integration+and+Internal+Models+for+Sensing+Gravity+Effects+in+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates.</a> BioMed Research International. 2014, 61584(2014).</li>
<li>Bostwick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+inhibitory+circuits+integrate+visual+and+gravitactic+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors.</a> Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).</li>
<li>Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+light+exposure+leads+to+a+sign+change+in+gravitaxis+of+the+flagellate+Euglena+gracilis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gravitational+Physiology%22%5BJournal%5D)">High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis.</a> Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).</li>
<li>Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electromagnetic+field+disrupts+negative+geotaxis+in+Drosophila+via+a+CRY-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway.</a> Nature Communications. 5, 4391(2014).</li>
<li>Frézal, L., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+outside+the+Petri+dish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">C. elegans outside the Petri dish.</a> eLife. 4, 05849(2015).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+dispersal+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%2C+is+regulated+by+IL2+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons.</a> Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).</li>
<li>Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+gravitactic+behavior+of+Caenorhabditis+japonica+dauer+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae.</a> The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).</li>
<li>Ackley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+mechanosensory+systems+are+required+for+negative+gravitaxis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Häder, D. -P., Hemmersbach, R. Gravitaxis in Euglena. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aH%C3%A4der%2C+D-P+%22Euglena%3A+Biochemistry%2C+Cell+and+Molecular+Biology%22">Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology</a>. Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. , Springer International Publishing. 237-266 (2017).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPA+channels+distinguish+gravity+sensing+from+hearing+in+Johnston%27s+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston's organ.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).</li>
<li>Chen, W. -L., Ko, H., Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+exhibits+positive+gravitaxis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis.</a> BMC Biology. 19 (1), 186(2021).</li>
<li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+Identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).</li>
<li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li>
<li>Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+chemotaxis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">elegans chemotaxis assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), e50069(2013).</li>
<li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).</li>
<li>Vidal-Gadea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetosensitive+neurons+mediate+geomagnetic+orientation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 4, 07493(2015).</li>
<li>Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+assessment+of+neuromuscular+integrity+and+burrowing+choice+in+vermiform+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).</li>
<li>Beron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+burrowing+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+a+new+assay+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders.</a> Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).</li>
<li>Ow, M. C., Hall, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+obtaining+large+populations+of+synchronized+Caenorhabditis+elegans+dauer+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae.</a> Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2293(2011).</li>
<li>Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+with+dauer+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Working with dauer larvae.</a> WormBook. , 1-19 (2018).</li>
<li>Dinno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonparametric+pairwise+multiple+comparisons+in+independent+groups+using+Dunn%27s+test%5BTitle%5D)+AND+%22The+Stata+Journal%22%5BJournal%5D)">Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn's test.</a> The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).</li>
<li>Gray, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensation+and+social+feeding+mediated+by+a+C.+elegans+guanylate+cyclase+homologue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue.</a> Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).</li>
<li>Goodman, M. B., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Caenorhabditis+elegans+senses+mechanical+stress%2C+temperature%2C+and+other+physical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli.</a> Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).</li>
<li>Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans%3A+a+sensible+model+for+sensory+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">C. elegans: a sensible model for sensory biology.</a> Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).</li>
<li>Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humidity+sensation+requires+both+mechanosensory+and+thermosensory+pathways+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).</li>
<li>Iliff, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nematode+C.+elegans+senses+airborne+sound%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The nematode C. elegans senses airborne sound.</a> Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).</li>
<li>Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+sensory+processing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans.</a> Open Biology. 8 (6), 180049(2018).</li>
<li>Wicks, S., Rankin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+mechanosensory+stimuli+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 15, 3 Pt 2 2434-2444 (1995).</li>
<li>Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+C.+elegans+touch+sensitivity+is+integrated+at+multiple+levels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).</li>
<li>Stockand, J. D., Eaton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus+discrimination+by+the+polymodal+sensory+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron.</a> Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469(2013).</li>
<li>Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evolution+of+the+vestibular+apparatuses+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear.</a> Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).</li>
<li>Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+disorders+of+the+vestibular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Otolaryngology+%26+Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Genetic disorders of the vestibular system.</a> Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).</li>
<li>Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+vestibular+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Genetics of vestibular syndromes.</a> Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).</li>
<li>Mei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+the+individualized+therapy+of+vestibular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders.</a> Frontiers in Neurology. 12, 633207(2021).</li>
<li>Weghorst, F. P., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+hearing+and+balance%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The evolution of hearing and balance.</a> eLife. 8, 44567(2019).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Vergelijking met eerdere methoden In tegenstelling tot chemotaxis kan gravitaxis bij Caenorhabditis niet betrouwbaar worden waargenomen met behulp van een traditioneel experimenteel ontwerp van de agarplaat. Een standaard petrischaal heeft een diameter van 150 mm, wat resulteert in slechts 75 mm beschikbaar in beide richtingen voor dauers om gravitaxis-voorkeur aan te tonen. Hoewel de oriëntatievoorkeur van C. elegans kan worden getest in oplossing12, is deze ...

Het voelen van de zwaartekracht van de aarde is cruciaal voor de oriëntatie, beweging, coördinatie en balans van veel organismen. De moleculaire mechanismen en neurocircuits van zwaartekrachtsensatie zijn echter slecht begrepen in vergelijking met andere zintuigen. Bij dieren werkt het zwaartekrachtgevoel samen met en kan het worden weggeconcurreerd door andere stimuli om gedrag te beïnvloeden. Visuele signalen, proprioceptieve feedback en vestibulaire informatie kunnen worden geïntegreerd om een gevoel van lichaamsbewustzijn te genereren ten opzichte van de omgeving van een dier 1,2. Omgekeerd kan de gravitactische voorkeur worden gewijzigd in aanwezigheid van andere stimuli 3,4,5. Daarom is gravitactisch gedrag ideaal voor het bestuderen van zwaartekrachtsensatie en het begrijpen van de complexe sensorische integratie en besluitvorming van het zenuwstelsel.
C. elegans is een bijzonder nuttig modelorganisme voor het bestuderen van gravitaxis vanwege zijn polyfenische levenscyclus. Bij blootstelling aan stressoren tijdens de ontwikkeling, waaronder hitte, overbevolking of een gebrek aan voedsel, ontwikkelen C. elegans-larven zich tot dauers, die zeer stressbestendig zijn6. Als dauers voeren wormen kenmerkend gedrag uit, zoals nictatie, waarbij wormen op hun staart "staan" en met hun hoofd zwaaien, wat verspreiding naar betere habitats kan vergemakkelijken7. Gravitaxis-assays van C. elegans en C. japonica suggereren dat dauerlarven negatief gravitax zijn, en dat dit gedrag gemakkelijker wordt waargenomen bij dauers dan bij volwassenen 8,9. Het testen van gravitaxis in andere Caenorhabditis-stammen kan natuurlijke variatie in gravitactisch gedrag onthullen.
Mechanismen voor zwaartekrachtsensatie zijn gekarakteriseerd in Euglena, Drosophila, Ciona en verschillende andere soorten met behulp van gravitaxis-assays 3,10,11. Ondertussen leverden gravitaxisstudies in Caenorhabditis aanvankelijk gemengde resultaten op. Een studie van C. elegans oriëntatievoorkeur wees uit dat wormen zich oriënteren met hun hoofd naar beneden in oplossing, wat een positieve gravitactische voorkeur suggereert12. Ondertussen, hoewel C. japonica dauers al vroeg werden geïdentificeerd als negatief gravitactisch8, is dit gedrag pas onlangs beschreven in C. elegans9. Verschillende uitdagingen doen zich voor bij het ontwikkelen van een representatieve gravitaxis-test in wormen. Caenorhabditis stammen worden onderhouden op agar platen; om deze reden gebruiken gedragstests meestal agarplaten als onderdeel van hun experimentele ontwerp 13,14,15. De vroegst gerapporteerde gravitaxistest bij Caenorhabditis werd uitgevoerd door een plaat op zijn kant te laten staan in een hoek van 90° ten opzichte van de horizontale controleplaat8. Gravitaxis-gedrag is echter niet altijd robuust onder deze omstandigheden. Hoewel volwassen wormen in oplossing12 kunnen worden getest op oriëntatievoorkeur, kan deze richtingsvoorkeur ook contextafhankelijk zijn, wat leidt tot ander gedrag als de wormen kruipen in plaats van zwemmen. Bovendien is C. elegans gevoelig voor andere stimuli, waaronder licht en elektromagnetische velden16,17, die interfereren met hun reacties op zwaartekracht9. Daarom is een bijgewerkte gravitaxis-test die beschermt tegen andere omgevingsvariabelen belangrijk voor het ontleden van de mechanismen van dit sensorische proces.
In dit protocol wordt een test voor het observeren van Caenorhabditis gravitaxis beschreven. De opzet voor deze studie is deels gebaseerd op een methode die is ontwikkeld om neuromusculaire integriteit tebestuderen 18,19. Dauerlarven worden gekweekt en geïsoleerd met behulp van standaardprocedures20. Ze worden vervolgens geïnjecteerd in kamers gemaakt van twee serologische pipetten van 5 ml gevuld met agar. Deze kamers kunnen verticaal of horizontaal worden georiënteerd en gedurende 12-24 uur in een donkere kooi van Faraday worden geplaatst om te beschermen tegen licht en elektromagnetische velden. De locatie van elke worm in de kamers wordt geregistreerd en vergeleken met de verticale taxi's van een referentiestam zoals C. elegans N2.

<table><tbody><tr><td>1% Sodium Dodecyl Sulfate oplossing</td><td></td><td></td><td>Van stock 10% (w/v) SDS in DI water</td></tr><tr><td>15 mL Centrifuge tubes</td><td>Falcon</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>3 mm Hex key</td><td></td><td></td><td>Andere metalen gereedschappen van vergelijkbare grootte kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>4% Agar in normaal groeimedium (NGM) - 1 L</td><td></td><td></td><td>Voorafgaand aan het autoclaven: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2,5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 &mu;L Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; Na het autoclaven: 24,5 mL Fosfaatbuffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycine (200 mg/mL)</td></tr><tr><td>5 mL Serologische pipetten</td><td>Fisherbrand</td><td>S68228C</td><td>Polystyreen, niet borosilicaatglas</td></tr><tr><td>60% Koude sucrose oplossing</td><td></td><td></td><td>60% sucrose (w/v) in DI water; steriliseren door filtratie (0,45 &mu;m filter). Bewaren bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>AF16 C. briggsae of andere experimentele stam</td><td></td><td></td><td>Beschikbaar bij het CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td></tr><tr><td>Bunsen-brander</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cling-wrap</td><td>Fisherbrand</td><td>22-305654</td><td></td></tr><tr><td>Klinische centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wegwerp scheermesjes</td><td>Fisherbrand</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Faraday kooi</td><td></td><td></td><td>Kan worden gebouwd met karton en aluminiumfolie; 30" L x 6" B x 26" H of groter</td></tr><tr><td>Inktmarkers</td><td></td><td></td><td>Sharpie of een andere merk voor markeren op plastic</td></tr><tr><td>Labeling tape</td><td>Carolina</td><td>215620</td><td></td></tr><tr><td>M9 buffer</td><td></td><td></td><td>22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl</td></tr><tr><td>N2 C. elegans stam</td><td></td><td></td><td>Beschikbaar bij het CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td></tr><tr><td>NGM platen met OP50</td><td></td><td></td><td>1,7% (w/v) agar in NGM (zie beschrijving: 4% agar in NGM). Zaaien met OP50</td></tr><tr><td>Paraffine film</td><td>Bemis</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof snijplank</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tang</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roterende verticale mixer</td><td>BTLab SYSTEMS</td><td>BT913</td><td>Met 22 x 15 mL buisendrager</td></tr><tr><td>Serologische pipettor</td><td>Corning</td><td>357469</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Microscoop</td><td>Laxco</td><td>S2103LS100</td><td></td></tr><tr><td>Tellingteller</td><td>ULINE</td><td>H-7350</td><td></td></tr><tr><td>Dikke NGM/agar plaat media - 1 L</td><td></td><td></td><td>Zie 4% Agar in NGM recept; vervang 40 g Agar door 20 g Agar</td></tr><tr><td>Pincet</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

grootschalige gravitaxis-test van caenorhabditis dauer-larven

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Zwaartekrachtsensatie is een belangrijk en relatief onderbelicht proces. Het waarnemen van de zwaartekracht stelt dieren in staat om door hun omgeving te navigeren en vergemakkelijkt beweging. Bovendien is het zwaartekrachtgevoel, dat optreedt in het binnenoor van het zoogdier, nauw verwant aan het gehoor - dus het begrijpen van dit proces heeft implicaties voor auditief en vestibulair onderzoek. Gravitaxis-assays bestaan voor sommige modelorganismen, waaronder Drosophila. Enkele wormen zijn eerder getest op hun oriëntatievoorkeur terwijl ze zich in oplossing vestigen. Een betrouwbare en robuuste test voor Caenorhabditis gravitaxis is echter niet beschreven. Het huidige protocol schetst een procedure voor het uitvoeren van gravitaxis-assays die kunnen worden gebruikt om honderden Caenorhabditis dauers tegelijk te testen. Deze grootschalige, langeafstandstest maakt gedetailleerde gegevensverzameling mogelijk, waarbij fenotypen worden onthuld die mogelijk worden gemist op een standaard op platen gebaseerde test. Dauer-beweging langs de verticale as wordt vergeleken met horizontale bedieningselementen om ervoor te zorgen dat directionele vertekening te wijten is aan de zwaartekracht. Gravitactische voorkeur kan dan worden vergeleken tussen stammen of experimentele omstandigheden. Deze methode kan moleculaire, cellulaire en omgevingsvereisten voor gravitaxis in wormen bepalen.

Gravitaxis vergelijken tussen soorten Volgens de hierboven beschreven procedure kan C. briggsae dauer gravitaxis worden vergeleken met C. elegans gravitaxis en horizontale controles. De verticale verdeling (kastanjebruin) van C. briggsae dauers is scheef naar de toppen van de kamers, waarbij een groot percentage wormen +7 bereikt (figuur 2A). In tegenstelling tot horizontale bedieningselementen (aqua), waarbij dauers in een ruwweg klokvormige cu...

Het huidige protocol schetst methoden voor het uitvoeren van een grootschalige gravitaxis-test met Caenorhabditis dauer-larven. Dit protocol zorgt voor een betere detectie van gravitaxis-gedrag in vergelijking met een op platen gebaseerde test.

Grootschalige Gravitaxis-test van Caenorhabditis Dauer-larven

Gravity sensation is an important and relatively understudied process. Sensing gravity enables animals to navigate their surroundings and facilitates ...

Deze high throughput assay kan worden gebruikt om robuust gravitactisch gedrag te observeren bij caenorhabditis dauer larven. Wormgedrag wordt waargenomen over grote afstanden in vergelijking met testen uitgevoerd op een petrischaaltje. Dit verhoogt de gevoeligheid van de test en maakt gedetailleerde gegevensanalyse mogelijk.Het bestuderen van gravitaxis-gedrag kan inzicht geven in hoe zwaartekrachtsensatie optreedt bij caenorhabditis, wat relevant is voor het begrijpen van het vestibulaire systeem van zoogdieren. Het maken van de gravitaxis-testkamers, het isoleren van dauers en het injecteren van de wormen in de kamers vergt oefening. U kunt tijd besparen door de dauers te isoleren en de kamers een dag van tevoren te maken.Begin met het opzetten van een Bunsen-brander, een tot twee scheermesjes, tangen, pincetten en een plastic snijoppervlak en een zuurkast. Om een kamer te maken, verzamelt u twee serologische pipetten van 5 milliliter en verwijdert u met een pincet de katoenen plug uit één pipet. Houd een scheermesje met een tang boven de Bunsen-brander tot het heet is.Gebruik het verwarmde mes om het taps toelopende uiteinde van de tweede pipet af te snijden, zodat de hele pipe

large-scale-gravitaxis-assay-of-caenorhabditis-dauer-larvae

Research

JoVE Journal

Behavior

Gedrag

C. elegans eierleggedrag kan belangrijke informatie bieden in ontwikkelings-, reproductieve en anatomische studies.  Deze video introduceert de belangrijke stappen van een eierlegtest en toont een monsterexperiment waarbij een medicijn wordt getest op reproductietoxiciteit.

Egg Laying Assay: Een methode om het eierleggedrag van C. elegans te kwantificeren

Werkwijze voor het kwantitatief beoordelen van de chemotactische respons...

C. elegans Chemotaxis Assay

Een semi-automatische micro-electro-fluidisch methode om on-demand motoriek induceren...

Microfluïdische-based Electrotaxis voor On-demand Kwantitatieve analyse van<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

Beschrijven we methoden om aspecten van amylopathies in de worm te...

Een<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Model Systeem voor Amylopathy Study

We beschrijven de gedetailleerde stappen van een hoog-doorvoer chemische test bij de rondworm Caenorhabditis elegans die wordt gebruikt om de toxiciteit van de kiemcellen te beoordelen. Bij deze test wordt de verstoring van de kiemcellenfunctie na blootstelling aan chemicaliën gemonitord met behulp van een fluorescerende reporter specifiek voor aneuploïde embryo's.

Uitgebreide beoordeling van Kiembaan chemische toxiciteit De nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Het in beeld brengen van gedrag en neurale activiteit over lange tijdschalen zonder het dier te immobiliseren, is een voorwaarde om gedrag te begrijpen. Agarose microfluïdische kamersbeeldvorming (AMI) kan worden gebruikt om neurale activiteit en gedrag voor alle levensfasen van Caenorhabditis elegans in beeld te brengen.

Agarose microkamers naar Lange termijn Calcium Imaging van<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Hier beschrijven we protocollen die specifiek zijn ontworpen om morfogenetische defecten te monitoren die optreden tijdens de vroege en late fasen van embryonale verlenging van de rondworm Caenorhabditis elegans. Uiteindelijk zijn deze protocollen ontworpen om genen te identificeren die deze fasen reguleren en om hun differentiële vereisten langs de antero-posterior as van het embryo te karakteriseren.

Novel Metrics te karakteriseren Embryonale Verlenging van de nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Om Caenorhabditis elegans (C. elegans) te gebruiken in omics-onderzoek, is een methode nodig om grote populaties wormen te genereren waar een enkel monster kan worden gemeten op verschillende platforms voor vergelijkende analyses. Hier wordt een methode gepresenteerd om C. eleganspopulaties op grootschalige cultuurplaten (LSCPs) te culteren en de bevolkingsgroei te documenteren.

Cultuur en assay van grootschalige gemengde caenorhabditis elegans populaties

Een protocol voor het in beeld brengen van de dynamische microtubuli in vivo met behulp van fluorescerend gelabeld Eindbindend eiwit is gepresenteerd. We beschreven de methoden om de dynamische microtubuli in het posterieure laterale microtubuli (PLM) neuron van C. elegans te labelen,in beeld te geven en te analyseren .

In vivo Beoordeling van microtubule dynamica en oriëntatie in Caenorhabditis elegans neuronen

Caenorhabditis elegans dienen als een uitstekend modelsysteem met robuuste en goedkope methoden voor het onderzoeken van de gezondheid, levensduur en veerkracht tegen stress.

Onderzoek naar goedkope methoden om levensduur en gezondheid te meten in Caenorhabditis elegans

Leer een grootschalige gravitaxismethode voor Caenorhabditis dauer-larven. Dit protocol verbetert de detectie van gravitaxisgedrag ten opzichte van traditionele plaatassays en biedt inzicht in zwaartekrachtwaarneming.

Grootschalige Gravitaxis-test van Caenorhabditis Dauer-larven

Meer video's verkennen