In het veld inzetbare Candidatus Liberibacter asiaticus detectie met behulp van recombinase polymerase amplificatie in combinatie met CRISPR-Cas12a

Huang long bing, afgekort als HLB. Het is wereldwijd een verwoestende citrusziekte. In de meest citrusproducerende landen, zoals China en de VS, wordt HLB veroorzaakt door de floëembeperkte bacterie Candidatus Liberibacter asiaticus, afgekort als CLas.

Vroege detectie van CLas was belangrijk voor telers om vroegtijdige interventie te vergemakkelijken en verspreiding van ziekten te voorkomen. Daarom hebben we hier een nieuwe methode ontwikkeld voor de snelle en draagbare HLB-diagnose, gecombineerd met het recombinasepolypolymeraseversterkings- en CRISPR-Cas12a-systeem. We noemden het CLas-DETECTR.

De gevoeligheid van ons platform is veel hoger dan PCR. Bovendien toont het een vergelijkbaar resultaat met qPCR wanneer de bladmonsters werden gebruikt. Vergelijk met de conventionele CLas-detecties, onze methode kan in 90 minuten worden voltooid en werkt in een isothermische toestand.

Het resultaat kan ook worden gevisualiseerd via een handheld fluorescerend detectieapparaat in het veld. De CLas-DETECTR bevat vier stappen: oplossingsvoorbereiding, citrus totale DNA-isolatie, isothermische DNA-amplificatie en de resultaten van visualisatie. Het schema van de CLas-DETECTR-test wordt hier geïllustreerd.

Buffer A, Oplossing B en Oplossing C worden bereid zoals beschreven in het protocol. Om tijd te besparen en deze methode geschikt te maken voor veld-CLas-detectie, werd de op E.coli-polyethyleenglycol gebaseerde benadering gebruikt om ruwe plantenextracten voor DNA-amplificatie te verkrijgen. Citrusbladeren worden gebruikt in de tool.

Pons de paar stukjes bladschijven van blad. Doe bladschijven in een Eppendorf-buis van 1,5 milliliter. Voeg vervolgens 200 microliter buffer A toe aan de buis.

Maal de bladschijven tot een gladde massa met een plastic staaf handmatig. Laat de tube 10 minuten ongestoord. Het supernatant wordt vervolgens toegepast op DNA-amplificatie.

Voeg voor isothermische DNA-amplificatie één microliter supernatant uit stap 2.3 en één microliter magnesiumacetaat toe aan oplossing B en meng goed. In het laboratorium incubeer je ze in een eenvoudige incubator op 37 graden gedurende 15 minuten. Om de resultaten te visualiseren, voegt u 10 microliter van het mengsel uit stap 3.2 toe aan oplossing C en mengt u goed.

Incubeer ze in de 37 graden incubator gedurende 60 minuten. Draag een bril en observeer het groene fluorescentiesignaal via een handheld fluorescerend detectieapparaat. Om de specificiteit van CLas-DETECTR te testen, eerste zuivere kolonies van Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp.

citri, de ziekteverwekker van de citruscanker en Burkholderia stabilis stam 1440 geïsoleerd in ons laboratorium, werden gebruikt om hun genomische DNA te extraheren. Vervolgens werden deze drie bacteriën genomisch DNA en de CLas-positieve Newhall-bladeren genomisch DNA onderworpen aan de CLas-DETECTR-test. Om de gevoeligheid van CLas-DETECTR te testen, werd een reeks CLas DNA-fragmentverdunningen gedetecteerd met behulp van PCR, CLas-DETECTR en qPCR zoals beschreven in het protocol Na de specificiteit en de gevoeligheidstest werd de CLas-DETECTR-methode gebruikt om de aanwezigheid van de CLas's in het veld te detecteren.

Bladmonsters verzameld van Newhall zoete sinaasappelboom gekweekt in de kiemplasma resource kwekerij op de campus van de Gannan Normal University, Jiangxi, China. qPCR, een overtuigende CLas-detectiemethode die gewoonlijk in het laboratorium wordt gebruikt, werd ook toegepast. De bladmonsters van HLB-geïnfecteerde en HLB-niet-geïnfecteerde Newhall-boom, waarin de aanwezigheid van de CLas in ons laboratorium werd bevestigd, werden onderworpen aan de CLas-DETECTR-test.

Het groene fluorescentiesignaal werd opgevangen in het HLB-geïnfecteerde monster, maar niet in de HLB-niet-geïnfecteerde en negatieve controle. We bepaalden de specificiteit van CLas-DETECTR met behulp van nucleïnezuren geëxtraheerd uit andere bacteriën. In de CLas-DETECTR-test vertoonde alleen gDNA geëxtraheerd uit CLas-positieve Newhall-bladeren groene fluorescerende signalen.

gDNA geëxtraheerd uit Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri en Burkholderia stabilis stam 1440 niet, wat betekent dat de CLas-DETECTR specifiek CLas kan detecteren. We hebben ook de gevoeligheid van CLas-DETECTR getest met behulp van een reeks CLas DNA-verdunningen, vermeld in het protocol.

PCR kan 201 kopieën per megaliter detecteren. Aan de andere kant kan CLas-DETECTR 2,01 kopieën per megaliter detecteren, wat de beschikbaarheid ervan als een gevoelige velddiagnose suggereert. qPCR kan 0,201 kopieën per megaliter detecteren en de Ct-waarde is hoger dan 36.

CLas-DETECTR is dus twee ordes van grootte gevoeliger dan traditionele PCR en één orde van een magnitude minder gevoelig dan qPCR wanneer verdunde CLas-specifieke ampliconen werden gebruikt. Ten slotte de haalbaarheid van de CLas-DETECTR voor veldmonsters opnieuw onderzocht en de gevoeligheid ervan vergeleken met qPCR. In cijfers zien we.

We kunnen zien dat de Ct-waarde hoger is dan 36 wanneer de CLas-concentratie minder dan 0,2 kopieën per megaliter is, wat een zeer lage concentratie is. Van de 15 monsters was de Ct-waarde van de monsters 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 en 14 gedetecteerd door qPCR minder dan 36. Er werd een schijnbaar groen fluorescentiesignaal waargenomen.

Aan de andere kant, toen de Ct-waarde van de monsters 6, 7, 9, 12 en 15 gedetecteerd door qPCR onbepaald was, werden geen groene fluorescerende signalen waargenomen. Bovendien werden zwakke groene fluorescerende signalen waargenomen wanneer de CT-waarde van monster 5 en 11 gedetecteerd door qPCR hoger was dan 36. De resultaten zullen suggereren dat ons platform een snel, robuust en gevoelig hulpmiddel is voor HLB-diagnose in het veld.