Een microfluïdische benadering voor de studie van ijs- en clathraathydraatkristallisatie

Dit protocol is uniek omdat het de gebruiker in staat stelt om de interactie tussen oplosbare moleculen en kristaloppervlakken te bestuderen en te onderzoeken en te meten. Sterk bewijs voor onomkeerbare binding van antivrieseiwitten aan ijs of verkregen met behulp van deze methode. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het vermogen om de groei van micronformaat ijs en hydrateerde kristallen te beheersen en de oplossing eromheen op een gecontroleerde manier uit te wisselen.

Plaats om te beginnen de vooraf voorbereide mal in een glazen petrischaal bedekt met aluminiumfolie. Bereid vervolgens 30 tot 40 milliliter van het PDMS-mengsel door een 1 tot 10 mengsel van het uithardingsmiddel en elastomeer te wegen en gedurende ongeveer vijf minuten continu te mengen totdat het mengsel wit en bijna ondoorzichtig lijkt. Giet vervolgens het PDMS-mengsel in de petrischaal met de vorm en ontgas in een exsiccator totdat er geen bubbels achterblijven.

Bak de mal met de vloeibare PDMS in een oven of op een hete plaat op 70 graden Celsius tot een rubberachtige consistentie is verkregen. Snijd vervolgens het apparaat uit door de kenmerken met een scalpel te traceren, waarbij u ervoor zorgt dat u met het scalpel naar voren duwt in plaats van naar beneden, omdat de mal kwetsbaar is. Nadat u het uitgesneden PDMS-apparaat hebt verwijderd, plaatst u het ondersteboven in een nieuwe petrischaal.

Met behulp van een stompe spuit, een naald van 20 gauge, pons je gaten in het apparaat op basis van het bedrukte patroon. Plaats vervolgens het gereinigde PDMS en de coverslip in de plasmareiniger. Sluit de kleppen en schakel de stroom, stofzuiger en pomp in.

Laat de plasmareiniger ongeveer een minuut draaien. Stel de RF in op hoog en laat wat lucht in de plasmareiniger komen met behulp van de fijne klep. Wanneer de kleur van de weergavevensters verandert van paars naar roze, laat u de plasmareiniger 50 seconden werken om de RF uit te schakelen.

Houd de pomp een minuut aan en open na het uitschakelen geleidelijk de hoofdklep om lucht in de plasmareiniger toe te laten. Druk vervolgens het PDMS-oppervlak op de gereinigde coverslip en bevestig dat ze zijn gebonden door geen loslating te observeren bij het iets omhoog trekken op de coverslip. Nadat u de naald van een stompe naald van 90 graden met een tang hebt vastgezet, steekt u het ene uiteinde van de naald in een Tygon-buis en het andere uiteinde in een van de uitgestanste gaten van het apparaat terwijl u het proces voor de andere gaten herhaalt.

Breng een kleine hoeveelheid dompelolie aan op het oppervlak van het koperen koude stadium en verspreid het met een pluisvrij doekje om een dunne laag olie te maken. Plaats vervolgens een schone saffierschijf op de gecreëerde olielaag. Breng vervolgens een druppel dompelolie aan op het midden van de saffierschijf en plaats het PDMS-apparaat op de druppel zodat de kenmerken van het apparaat worden uitgelijnd over het kijkgat van het koude podium.

Nadat u het apparaat op zijn plaats hebt gehouden, bevestigt u de slang aan de buitenwanden van de aluminium doos waarin de plakband is ondergebracht. Injecteer met behulp van een glazen spuit vier tot vijf microliter antivrieseiwitoplossing in het inlaatkanaal en sluit het deksel van de koude fase. Start het temperatuurregelingsprogramma en stel de temperatuur in op min 25 graden Celsius.

Verhoog vervolgens langzaam de temperatuur met ongeveer één graad Celsius per vijf seconden. Benader het smeltpunt van de monsters, dat kan variëren van min 1 tot min 0,2 graden Celsius, afhankelijk van de buffer die wordt gebruikt in de antivrieseiwitoplossing. Om enkelvoudige kristallen beter te observeren, schakel je over naar 10x of 20x objectieven.

En na het verkrijgen van een enkel kristal op de gewenste locatie, laat het kristal groeien door de temperatuur enigszins te verlagen totdat de uiteinden van het kristal de kanaalwanden ontmoeten. Nadat u bent overgeschakeld naar het 50x-doel, injecteert u de antivrieseiwitoplossing in de kanalen en ziet u de fluorescentie-intensiteit toenemen, wat aangeeft dat de eiwitoplossing met succes in de kanalen is geïnjecteerd. Om het uitwisselingsproces van de oplossing vast te leggen, gebruikt u het NIS-Elements Imaging Program, zorgt u ervoor dat de uitgeoefende druk niet te hoog is en injecteert u de bufferoplossing langzaam in de tweede inlaat van het microfluïdische apparaat.

Neem een afname van het fluorescerende signaal op met een snelheid die afhankelijk is van de druk die op de spuit wordt uitgeoefend. Om THF-hydraten te verkrijgen na het bereiden van een THF-wateroplossing met een molaire verhouding van 1 tot 15, injecteert u de oplossing in het microfluïdische apparaat. Nadat de THF-wateroplossing is bevroren, verhoogt u langzaam de temperatuur totdat al het ijs is gesmolten met uitsluiting van de hydraten en houdt u de temperatuur gedurende drie minuten op één graad Celsius.

Stel de temperatuur in op min twee graden Celsius en observeer de overvloed aan hydraten die in de microfluïdische kanalen verschijnen in afwezigheid van remmers. Injecteer vervolgens het antivrieseiwit of de remmer in het microfluïdische kanaal met behulp van de glazen spuit terwijl u de temperatuur aanpast om ervoor te zorgen dat de verkregen kristallen niet smelten of groeien en een paar minuten de remmermoleculen laten adsorberen aan het kristaloppervlak. Voer de oplossingsuitwisseling uit door de remmervrije oplossing in het kanaal te injecteren.

Maak beelden van het kristal voor en na de oplossingsuitwisseling en analyseer de fluorescentie-intensiteit op het kristal en in de oplossing met behulp van het beeldvormingsprogramma. Een succesvolle oplossingsuitwisseling rond een ijskristal werd uitgevoerd, wat aangeeft dat de oplossingsuitwisseling relatief snel was. Een langzamere uitwisseling is echter mogelijk.

De fluorescentie-intensiteit afkomstig van de ijsgeadsorbeerde antivriesglycoproteïnenmoleculen werd duidelijk waargenomen nadat de uitwisseling was voltooid. Een kwantitatieve analyse van de concentratie van antivrieseiwitten werd gemonitord en de fluorescentie-intensiteit werd bepaald in de oplossing en op het ijs, wat aangeeft dat het fluorescentiesignaal in de oplossing tijdens de oplossingsuitwisseling met een factor 100 is afgenomen, terwijl het berekende signaal op het ijsoppervlak constant blijft. Microfluïdische experimenten met THF-hydraten werden uitgevoerd waarbij een remmervrije oplossing in de kanalen werd geïnjecteerd nadat de hydraatkristallen de remmermoleculen hadden mogen adsorberen.

De THF-hydraten werden waargenomen na oplossingsuitwisseling met twee soorten remmers, waaronder antivriesglycoproteïnen gelabeld met fluoresceïneisothiocyanaat en Safranin O, een fluorescerende kleurstof. De kritieke stappen van deze procedure zijn de vorming en isolatie van een enkel kristal in de microfluïdische kanalen en de uitwisseling van oplossing eromheen. Deze methode kan worden gebruikt met andere kristalmaterialen die zeer temperatuurgevoelig zijn, in een poging om het mechanisme te begrijpen waarmee remmers interageren met deze kristallen.

Het vermogen om oplossingen rond kristallen uit te wisselen, maakte de weg vrij voor onderzoekers om belangrijke inzichten in het bindingsmechanisme van antivrieseiwitten te identificeren en een nieuw fenomeen van isotoopeffect op ijsgroei te ontdekken.