Name: Virale transgene expressie in knaagdierharten en de beoordeling van het risico op hartritmestoornissen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: Leer een minimaal invasieve techniek voor virale transgene expressie in knaagdierharten met echogeleide intramyocardiale injectie. Deze methode maakt efficiënt genexpressieonderzoek en beoordeling van hartritmestoornissen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Canadian Institutes of Health Research (CIHR) Project Grants (PJT-148918 en PJT-180533, aan WL), de CIHR Early Career Investigator Award (AR8-162705, aan WL), de Heart and Stroke Foundation of Canada (HSFC) McDonald Scholarship en New Investigator Award (S-17-LI-0866, aan WL), Student Scholarships (aan JW en YX), en een Postdoctoral Fellowship (aan AL) van de University of Ottawa Cardiac Endowment Funds aan het Heart Institute. De auteurs bedanken de heer Richard Seymour voor zijn technische ondersteuning. Figuur 2 is gemaakt met Biorender.com met goedgekeurde licenties.

Alle beschreven methoden en procedures zijn goedgekeurd door de ethische beoordelingscommissie voor dieronderzoek aan de Universiteit van Ottawa en de beoordelingscommissie voor bioveiligheid aan het Heart Institute van de Universiteit van Ottawa. De ontwikkelde veiligheidsprotocollen omvatten dat alle procedures die te maken hebben met recombinant adenovirus of adeno-geassocieerd virus (AAV) werden uitgevoerd in een bioveiligheidskast van niveau II. Alle items die in contact kwamen met het virus werden na het experiment grondig ontsmet. Ctnnb1flox/flox en αMHC-MerCreMer muizen (8-12 weken oud, van beide geslachten) en Sprague-Dawley ratten (200-250g, mannelijk) werden gebruikt voor de huidige studie. De dieren werden verkregen uit commerciële bronnen (zie Materiaaltabel). Alle procedures met betrekking tot dieren werden uitgevoerd door personeel dat is opgeleid en goedgekeurd door institutionele regelgevende comités. Bij alle ingrepen werd gebruik gemaakt van passende persoonlijke beschermingsmiddelen.
1. Virale transgene expressie in ventriculaire weefsels van knaagdieren
OPMERKING: Bewaar recombinant adenovirus of AAV dat het doelgen en het bijbehorende controlevirus tot expressie brengt, zoals Ad-GFP (titer van 1 x 1010 PFU/ml) of AAV9-GFP (titer van 1 x 1013 GC/ml) (zie materiaaltabel), in een vriezer van −80 °C.
<ol><li>Op de dag van virusinjectie ontdooi je het virus op ijs. Aspirateer het virus dat het doelgen en het controlevirus tot expressie brengt in twee afzonderlijke spuiten (volume = 50 μL) met 30 G 1/2 naalden en blijf op ijs tot gebruik. OPMERKING: Eventuele belletjes in de spuit en naald moeten zorgvuldig worden verwijderd.</li>
	<li>Dien buprenorfine toe aan ratten of muizen (0,05 mg /kg voor ratten, 0,1 mg / kg voor muizen, subcutaan), 1 uur later anesthesie induceren met behulp van 3% isofluraan en isofluraan op 2% (in 100% zuurstof bij een stroomsnelheid van 0,5-1,0 l / min) voor de volgende procedure.</li>
	<li>Knijp zachtjes in het lichaam van het dier (bijvoorbeeld de staart) met een tang en als het dier niet reageert op de knijp met lichaamsbewegingen, wordt de juiste verdoving bevestigd.</li>
	<li>Houd de lichaamstemperatuur op 37 °C met behulp van een elektrisch verwarmingskussen. Scheer het haar in de borststreek met behulp van een tondeuse. OPMERKING: Wees voorzichtig bij het gebruik van een elektrisch verwarmingskussen vanwege mogelijke ongelijke warmteverdeling.</li>
	<li>Breng oogheelkundige zalf aan op beide ogen om het uitdrogen van het hoornvlies te voorkomen.</li>
	<li>Houd het dier in rugligging en gebruik een preklinisch beeldvormingssysteem (zie Materiaaltabel) voor echografie van het hart van het dier in de korte-asoriëntatie. OPMERKING: De volgende stappen worden uitgevoerd in een niveau II bioveiligheidskast die een steriele omgeving biedt. Standaard veiligheidsprocedures, inclusief die met veilige naaldbehandeling, worden gebruikt.</li>
	<li>Steriliseer het linker onderste borstgebied van het dier met afwisselende rondes van een op jodium gebaseerde of chloorhexidine-gebaseerde scrub en alcohol drie keer in een cirkelvormige beweging.</li>
	<li>Breng onder begeleiding van echografie de naald van 30 G 1/2 van de spuit met het virus in zoals voorbereid in stap 1.1. in de borst van het dier via de linker onderborstzijde van het lichaam.</li>
	<li>Benader de punt van de naald in de linker ventriculaire voorste vrije wand en injecteer langzaam 10-15 μL van het virus. Controleer de succesvolle injectie in echografiebeelden door de verhoogde helderheid in de buurt van de punt van de naald. OPMERKING: De hoeveelheid virus die op elke plaats wordt geïnjecteerd, is niet meer dan 15 μL om fysieke schade aan de myocardiale weefsels te voorkomen.</li>
	<li>Trek de naald uit het hart en breng deze in andere delen van de linker ventrikel in voor een tweede en derde injectie van dezelfde hoeveelheid virus. OPMERKING: Het totale aantal injectieplaatsen wordt bepaald door het experimentele ontwerp. Als focale transgene expressie vereist is, is slechts één injectie nodig; als meer diffusieve transgene expressie vereist is, zijn meestal meerdere injectieplaatsen (drie tot vijf) nodig.</li>
	<li>Na het voltooien van de injecties, breng het dier terug naar zijn kooi.</li>
	<li>Controleer het dier zorgvuldig totdat het weer voldoende bewustzijn heeft gekregen om sternale lighouding te behouden en terug te brengen naar zijn huisvestingskamer.</li>
	<li>Dien buprenorfine HCl (0,1 mg/kg, tweemaal daags voor muizen, 0,05 mg/kg, tweemaal daags voor ratten, subcutaan) toe aan het dier gedurende de volgende 2 dagen. Breng dieren terug naar het vivarium en controleer dagelijks op ongebruikelijke tekenen van pijn of angst, en indien gevonden, behandel dieren volgens de protocollen van de institutional animal care committee.</li>
</ol>2. Beoordeling van de gevoeligheid voor hartritmestoornissen
OPMERKING: Beoordeel 4-6 dagen na adenovirusinjectie en 1-2 weken na AAV-injectie de gevoeligheid van de dierenharten voor hartritmestoornissen volgens stappen 2.1.-2.2.
<ol><li>Voer Langendorff-perfusie van het ratten- of muizenhart uit.<ol><li>Bereid Tyrode-oplossing door het volgende toe te voegen aan 1 l water: NaCl, 7,9 g (definitief = 135 mM); KCl, 0,37 g (5,0 mM); CaCl2, 0,27 g (1,8 mM); MgCl2, 0,24 g (1,2 mM); HEPES, 2,38 g (10 mM); en glucose, 1,8 g (10 mM). Stel de pH in op 7,40 met NaOH (zie Materiaalopgave).</li>
		<li>Filtreer de oplossing met een filter van 0,2 μm en bel continu met 100% O2 tijdens stap 2.1.6.-2.2.8.</li>
		<li>Dien heparine toe aan de rat of muis (500 E/kg, intraperitoneale injectie) en verdoof het dier 10 minuten later met 3% isofluraan. Zorg voor voldoende verdoving met een zachte knijp op het lichaam.</li>
		<li>Gebruik een scalpel om een verticale incisie van 1-1,5 cm in de middelste claviculaire lijn te maken voor een linker thoracotomie en het hart bloot te stellen.</li>
		<li>Verzamel het hart door te knippen met een schaar op het niveau van de aortaboog en plaats het hart onmiddellijk in ijskoude Tyrode-oplossing. OPMERKING: Voorzichtigheid is geboden om het hart niet te beschadigen tijdens het verzamelen van het hart.</li>
		<li>Cannuleer de aorta van het hart met een stompe naald (18 G voor ratten; 23 G voor muizen) aangesloten op een gemodificeerd Langendorff-perfusiesysteem (zie Materiaaltabel) in de constante stroomsnelheidsmodus. Pas het debiet aan om de perfusiedruk op 70-80 mmHg te houden. OPMERKING: Eventuele bubbels in de perfusienaald moeten vóór de aortacantnulatie worden verwijderd. Het gebruik van een ontleedmicroscoop vergemakkelijkt de cannulatie.</li>
		<li>Plaats het gecannuleerde hart in een met siliconenelastomeer gecoateplastic schaal van 9, 10 cm met de linker ventrikel naar boven gericht en perfuseer het hart 9,12 met O2-bubbels Tyrode-oplossing bij 37 °C.</li>
		<li>Controleer de juiste aortacantnulatie aan het begin van de perfusie door de bloeduitspoeling van het hart tijdens de eerste twee tot drie hartslagen en de verandering van de hartkleur van rood naar bleek te observeren.</li>
		<li>Plaats de elektroden van een ECG-systeem voor kleine dieren (zie Materiaaltabel) rond het hart door ze in de siliconenelastomeerlaag in de schaal te brengen (figuur 1). Neem ECG op met behulp van compatibele software.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer adrenerge receptorstimulatie en geprogrammeerde elektrische stimulatie uit om ventriculaire tachyaritmieën te induceren.<ol><li>Na succesvolle aorta-cannulatie, blijf het hart gedurende 20 minuten doordringen met Tyrode-oplossing om de hartvoorbereiding te stabiliseren.</li>
		<li>Voeg 1 μM isoproterenol (zie materiaaltabel) toe aan de Tyrode-oplossing die wordt gebruikt voor hartperfusie in stap 2.2.3.-2.2.8.</li>
		<li>Stimuleer na 10 minuten isoproterenolperfusie het hart aan de top met twee platina-elektroden aangesloten op een elektrische stimulator (zie Materiaaltabel).</li>
		<li>Begin met de stimulatieprocedure (figuur 2), die 10 opeenvolgende stimuli omvat (S1, 5 V, intervallen van 100 ms) die worden gevolgd door een extra stimulus (S2) met een initieel interval van 80 ms. Verminder het S2-interval telkens met 2 ms totdat de hartslag niet langer kan worden vastgelegd (d.w.z. het bereiken van de effectieve refractaire periode van het hart, ERP)13.</li>
		<li>Controleer alle geïnduceerde ventriculaire tachyaritmieën (inclusief ventriculaire tachycardie en fibrillatie) door ECG.</li>
		<li>Als er geen aritmieën worden geïnduceerd door de bovenstaande procedure, voeg dan nog een extra stimulus (S3) toe na S2 met dezelfde initiële (80 ms) en afname (met 2 ms) intervallen totdat het ERP is bereikt.</li>
		<li>Als ventriculaire tachyaritmieën nog steeds niet worden geïnduceerd, voeg dan nog een extra stimulus (S4) toe na S3 met dezelfde initiële en afnemende intervallen totdat het ERP is bereikt.</li>
		<li>Als ventriculaire tachyaritmieën nog steeds niet worden geïnduceerd (zoals verwacht bij controle gezonde harten), stop dan met het elektrische stimulatieprotocol en beschouw het hart als niet-induceerbaar.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Virani, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics-2020+update%3A+A+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 141 (9), 139(2020).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte-specific+deletion+of+%CE%B2-catenin+protects+mouse+hearts+from+ventricular+arrhythmias+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte-specific deletion of β-catenin protects mouse hearts from ventricular arrhythmias after myocardial infarction.</a> Scientific Reports. 11 (1), 17722(2021).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+exercise+training+on+the+FNDC5%2FBDNF+pathway+in+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Effect of exercise training on the FNDC5/BDNF pathway in spontaneously hypertensive rats.</a> Physiological Reports. 7 (24), 14323(2019).</li>
<li>Lin, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+Nod1%2FRIP2+signaling+is+essential+for+cardiac+hypertrophy+but+requires+mitochondrial+antiviral+signaling+protein+for+signal+transductions+and+energy+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Innate immune Nod1/RIP2 signaling is essential for cardiac hypertrophy but requires mitochondrial antiviral signaling protein for signal transductions and energy balance.</a> Circulation. 142 (23), 2240-2258 (2020).</li>
<li>Karunakaran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPK1+expression+associates+with+inflammation+in+early+atherosclerosis+in+humans+and+can+be+therapeutically+silenced+to+reduce+NF-%CE%BAB+activation+and+atherogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">RIPK1 expression associates with inflammation in early atherosclerosis in humans and can be therapeutically silenced to reduce NF-κB activation and atherogenesis in mice.</a> Circulation. 143 (2), 163-177 (2021).</li>
<li>Gharibeh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA6+is+a+regulator+of+sinus+node+development+and+heart+rhythm%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">GATA6 is a regulator of sinus node development and heart rhythm.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (1), 2007322118(2021).</li>
<li>Lu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+indirect+suppression+of+Scn5a+gene+expression+mediates+cardiac+Na%2B+channel+inhibition+by+Wnt+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Direct and indirect suppression of Scn5a gene expression mediates cardiac Na+ channel inhibition by Wnt signalling.</a> Canadian Journal of Cardiology. 36 (4), 564-576 (2020).</li>
<li>Liang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+phosphoinositide+3-kinase+%7Balpha%7D%2C+protein+kinase+C%2C+and+L-type+Ca2%2B+channels+in+mediating+the+complex+actions+of+angiotensin+II+on+mouse+cardiac+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Role of phosphoinositide 3-kinase {alpha}, protein kinase C, and L-type Ca2+ channels in mediating the complex actions of angiotensin II on mouse cardiac contractility.</a> Hypertension. 56 (3), 422-429 (2010).</li>
<li>Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+quiescent+cardiomyocytes+to+pacemaker+cells+by+expression+of+Tbx18%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18.</a> Nature Biotechnology. 31 (1), 54-62 (2013).</li>
<li>Kim, N. K., Wolfson, D., Fernandez, N., Shin, M., Cho, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+model+of+complete+atrioventricular+block+recapitulates+clinical+indices+of+bradycardia+and+provides+a+platform+to+test+disease-modifying+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A rat model of complete atrioventricular block recapitulates clinical indices of bradycardia and provides a platform to test disease-modifying therapies.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6930(2019).</li>
<li>Cingolani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+to+inhibit+the+calcium+channel+beta+subunit%3A+Physiological+consequences+and+pathophysiological+effects+in+models+of+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Gene therapy to inhibit the calcium channel beta subunit: Physiological consequences and pathophysiological effects in models of cardiac hypertrophy.</a> Circulation Research. 101 (2), 166-175 (2007).</li>
<li>Ionta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHOX2+overexpression+favors+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiac+pacemaker+cells%2C+improving+biological+pacing+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SHOX2 overexpression favors differentiation of embryonic stem cells into cardiac pacemaker cells, improving biological pacing ability.</a> Stem Cell Reports. 4 (1), 129-142 (2015).</li>
<li>Guss, S. B., Kastor, J. A., Josephson, M. E., Schare, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ventricular+refractoriness.+Effects+of+cycle+length%2C+pacing+site+and+atropine%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Human ventricular refractoriness. Effects of cycle length, pacing site and atropine.</a> Circulation. 53 (3), 450-455 (1976).</li>
<li>Segel, L. D., Ensunsa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albumin+improves+stability+and+longevity+of+perfluorochemical-perfused+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts.</a> The American Journal of Physiology. 254, 1105-1112 (1988).</li>
<li>Hong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLRP3+inflammasome+as+a+potential+treatment+in+ischemic+stroke+concomitant+with+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">NLRP3 inflammasome as a potential treatment in ischemic stroke concomitant with diabetes.</a> Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 121(2019).</li>
<li>Lin, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-NLRP3+inflammasome+activation+exacerbates+cardiac+dysfunction+after+ischemic+stroke+in+a+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Macrophage-NLRP3 inflammasome activation exacerbates cardiac dysfunction after ischemic stroke in a mouse model of diabetes.</a> Neuroscience Bulletin. 36 (9), 1035-1045 (2020).</li>
<li>Lin, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral-cardiac+syndrome+and+diabetes%3A+Cardiac+damage+after+ischemic+stroke+in+diabetic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cerebral-cardiac syndrome and diabetes: Cardiac damage after ischemic stroke in diabetic state.</a> Frontiers in Immunology. 12, 737170(2021).</li>
<li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li>
<li>Allison, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroconductive+nanoengineered+biomimetic+hybrid+fibers+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry.+B%22%5BJournal%5D)">Electroconductive nanoengineered biomimetic hybrid fibers for cardiac tissue engineering.</a> Journal of Materials Chemistry. B. 5 (13), 2402-2406 (2017).</li>
<li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+human+cardiac+myocytes+for+medical+research%3A+Promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">De novo human cardiac myocytes for medical research: Promises and challenges.</a> Stem Cells International. 2017, 4528941(2017).</li>
<li>Liang, W., Lu, A., Davis, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-based+treatment+of+acquired+heart+block%3A+The+battle+for+tomorrow+has+begun%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation.+Arrhythmia+and+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-based treatment of acquired heart block: The battle for tomorrow has begun.</a> Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 10 (5), 005331(2017).</li>
<li>McLaughlin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+human+recombinant+collagen+matrices+limit+adverse+remodeling+and+improve+cardiac+function+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Injectable human recombinant collagen matrices limit adverse remodeling and improve cardiac function after myocardial infarction.</a> Nature Communications. 10 (1), 4866(2019).</li>
<li>Villanueva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyoxalase+1+prevents+chronic+hyperglycemia+induced+heart-explant+derived+cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Glyoxalase 1 prevents chronic hyperglycemia induced heart-explant derived cell dysfunction.</a> Theranostics. 9 (19), 5720-5730 (2019).</li>
<li>Kanda, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+paracrine+repair+of+injured+myocardium+using+microfluidic-based+cocooning+of+heart+explant-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Deterministic paracrine repair of injured myocardium using microfluidic-based cocooning of heart explant-derived cells.</a> Biomaterials. 247, 120010(2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Verschillende stappen zijn van cruciaal belang voor het succes van de langendorff-doordrenkte, geïsoleerde hartpreparaat. Ten eerste is het belangrijk om schade aan het hart tijdens het verzamelen van het hart te voorkomen (bijvoorbeeld als gevolg van per ongeluk knijpen of knippen met de schaar). Ten tweede is het van cruciaal belang om het verzamelde hart zo snel mogelijk in koude Tyrode-oplossing te plaatsen, omdat dit de hartslag zal stoppen en het zuurstofverbruik van het hart zal verminderen. Ten derde mag het inbr...

Hart- en vaatziekten zijn wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak en eisten alleen al in 2017 het leven van 18 miljoen mensen1. Knaagdieren, vooral muizen en ratten, zijn het meest gebruikte model geworden in cardiovasculair onderzoek vanwege het gebruiksgemak en de beschikbaarheid van verschillende transgene overexpressie- of knock-outlijnen. Knaagdiermodellen zijn van fundamenteel belang geweest voor het begrijpen van de ziektemechanismen en voor het identificeren van potentiële nieuwe therapeutische doelen bij myocardinfarct2, hypertensie3, hartfalen4 en atherosclerose5. Het gebruik van knaagdieren in studies van hartritmestoornissen wordt echter beperkt door hun kleine hartomvang en snellere hartslag in vergelijking met menselijke of grote diermodellen. Daarom zijn spontane dodelijke aritmieën bij muizen of ratten na een hartinfarct zeldzaam2. Onderzoekers worden gedwongen zich te concentreren op indirecte secundaire veranderingen die een pro-aritmisch substraat kunnen weerspiegelen, zoals fibrose of genexpressie, zonder betekenisvolle veranderingen in aritmielast of pro-aritmische neigingen te vertonen. Om deze beperking te overwinnen, wordt in dit protocol een methode beschreven die een betrouwbare beoordeling mogelijk maakt van de gevoeligheid van muizen- en rattenharten voor ventriculaire tachyaritmieën na genetische modificatie 6,7 of myocardinfarct2. Deze methode combineert adrenerge receptorstimulatie met geprogrammeerde elektrische stimulatie om ventriculaire tachyaritmieën te induceren in geïsoleerde, langendorff-doordrenkte8 muizen- en rattenharten.
Standaardbenaderingen voor virale genoverdracht in myocardineweefsel van knaagdieren omvatten vaak de blootstelling van het hart door thoracotomie 9,10,11, wat een invasieve procedure is en geassocieerd is met vertraagd herstel van de dieren na de procedure. Dit artikel beschrijft een methode van directe intramyocardiale injectie van het virus onder begeleiding van echografie beeldvorming voor de overexpressie van transgenen. Deze minder invasieve procedure zorgt voor een sneller herstel van het dier na virale injectie en minder weefselletsel, in vergelijking met thoracotomie, vermindert postoperatieve pijn en ontsteking bij het dier en maakt dus een betere beoordeling van de effecten van transgene genen op de hartfunctie mogelijk.

<table><tbody><tr><td>30 G 1/2 PrecisionGlide Needle</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>adeno-associated virus (AAV9-GFP)</td><td>Vector Biolabs</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>adenovirus (Ad-GFP)</td><td>Vector Biolabs</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>adenovirus (Ad-Wnt3a)</td><td>Vector Biolabs</td><td>ADV-276318</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety cabinet (Level II)</td><td>Microzone Corporation</td><td>N/A</td><td>Model #: BK-2-4</td></tr><tr><td>Buprenorfine</td><td>Vetergesic</td><td>DIN 02342510</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>102378</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Haarklipper</td><td>WAHL Clipper Corporation</td><td>78001</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton-spuit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20701</td><td>705 LT, volume 50 &mu;L</td></tr><tr><td>Verwarmingskussen</td><td>Life Brand</td><td>E12107</td><td></td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Fresenius Kabi</td><td>DIN 02264315</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Fresenius Kabi Ltd.</td><td>M60303</td><td></td></tr><tr><td>Isoproterenol hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1351005</td><td></td></tr><tr><td>LabChart 8 software</td><td>ADInstruments Inc.</td><td>Version 8.1.5</td><td>voor ECG-opname</td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Muizen (Ctnnb1flox/flox)</td><td>Jackson Labs</td><td>4152</td><td></td></tr><tr><td>Muizen (&alpha;MHC-MerCreMer)</td><td>Jackson Labs</td><td>5650</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Leica</td><td>S9i</td><td>voor Langendorff-systeem</td></tr><tr><td>MS400 transducer</td><td>VisualSonic Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Oogzalf</td><td>Systane</td><td>DIN 02444062</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Drukmeter</td><td>NETECH</td><td>DigiMano 1000</td><td>voor Langendorff-systeem</td></tr><tr><td>Pomp</td><td>Cole-Parmer</td><td>UZ-77924-65</td><td>voor Langendorff-systeem</td></tr><tr><td>Ratten (Sprague-Dawley, mannelijk)</td><td>Charles River</td><td>400</td><td></td></tr><tr><td>Scalpelbladen</td><td>Fine Science Tools</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Scalpelgreep</td><td>Fine Science Tools</td><td>10007-12</td><td></td></tr><tr><td>Siliconen elastomeer</td><td>Down Inc.</td><td>Sylgard 184</td><td>voor Langendorff-systeem</td></tr><tr><td>Klein dier ECG-systeem</td><td>ADInstruments Inc.</td><td>N/A</td><td>Powerlab 8/35 en Animal Bio Amp</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>IonOptix</td><td>MyoPacer EP</td><td></td></tr><tr><td>VEVO3100 Preclinical Imaging System</td><td>VisualSonic Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

virale transgene expressie in knaagdierharten en de beoordeling van het risico op hartritmestoornissen

Viral Transgene Expression in Rodent Hearts and the Assessment of Cardiac Arrhythmia Risk

Hartziekten zijn wereldwijd de belangrijkste oorzaak van morbiditeit en mortaliteit. Vanwege het gebruiksgemak en de overvloed aan transgene stammen, zijn knaagdieren essentiële modellen geworden voor cardiovasculair onderzoek. Spontane dodelijke hartritmestoornissen die vaak sterfte veroorzaken bij patiënten met hartaandoeningen zijn echter zeldzaam in knaagdiermodellen van hartaandoeningen. Dit is voornamelijk te wijten aan de soortverschillen in cardiale elektrische eigenschappen tussen mens en knaagdier en vormt een uitdaging voor de studie van hartritmestoornissen met behulp van knaagdieren. Dit protocol beschrijft een aanpak om efficiënte transgene expressie mogelijk te maken bij muis- en rattenventrikelmyocardium met behulp van echocardiografiegeleide intramusculaire injecties van recombinant virus (adenovirus en adeno-geassocieerd virus). Dit werk schetst ook een methode om een betrouwbare beoordeling van de cardiale gevoeligheid voor aritmieën mogelijk te maken met behulp van geïsoleerde, Langendorff-doordrenkte muizen- en rattenharten met zowel adrenerge als geprogrammeerde elektrische stimulaties. Deze technieken zijn van cruciaal belang voor het bestuderen van hartritmestoornissen geassocieerd met nadelige hartremodellering na verwondingen, zoals een hartinfarct.

Bij injectie volgens het hier beschreven protocol (figuur 1) klopt een geïsoleerd ratten- of muizenhart ritmisch en stabiel gedurende ten minste 4 uur. Als het experimentele ontwerp een langere periode van hartperfusie vereist, is het nuttig om albumine toe te voegen aan de perfusieoplossing om het optreden van myocardineem na langdurige perfusie te verminderen14. De opname van isoproterenol in de perfusieoplossing bootst de activering van het sympathische zenuwstelse...

Het huidige protocol beschrijft methoden voor transgene expressie in ratten- en muizenharten door directe intramyocardiale injectie van het virus onder echocardiografiebegeleiding. Methoden voor de beoordeling van de gevoeligheid van harten voor ventriculaire aritmieën door de geprogrammeerde elektrische stimulatie van geïsoleerde, langendorff-doordrenkte harten worden hier ook uitgelegd.

Virale transgene expressie in knaagdierharten en de beoordeling van het risico op hartritmestoornissen

Heart disease is the leading cause of morbidity and mortality worldwide. Due to the ease of handling&#160;and abundance of transgenic strains, rodents ...

Dit protocol stelt de gebruiker in staat om efficiënte transgene expressie in het ventriculaire myocardium te bereiken, waardoor genexpressiestudies worden vergemakkelijkt om hartritmestoornissen en functie in het ventriculaire weefsel te onderzoeken. De techniek voor virale transgene expressie is minimaal invasief voor het dier en veroorzaakt minder schade en verminderde hersteltijd dan conventionele benaderingen waarbij een thoracotomie betrokken is. De techniek voor het induceren van aritmieën in kleine knaagdierharten is nuttig voor het beoordelen van de gevoeligheid voor aritmieën in kleine diermodellen van hartaandoeningen.De procedure wordt gedemonstreerd door dokter Alice Lu, een postdoctorale fellow uit het lab. Steriliseer om te beginnen het linker onderste borstgebied van de verdoofde muis met afwisselende rondes van een scrub op basis van jodium of chloorhexidine, in alcohol, drie keer in een cirkelvormige beweging. Breng onder begeleiding van echografie de naald van de spuit met het virus in de borst van het dier.Benader de naaldpunt in de linker ventriculaire voorste vrije wand en injecteer langzaam 10 tot 15 microliter van het virus. Controleer de succesvolle injectie in echografiebeelden door de verhoogde helderheid in de buurt van de punt van de naald. Trek de naald uit het hart en breng in andere delen van de linker ventrikel in voor een tweede en derde injectie van dezelfde hoeveelheid virus.Om Langendorff-perfusie van het muizenhart uit te voeren, plaatst u het gecannuleerde hart in een met siliconenelastomeer gecoate plastic schaal van 10 centimeter, met de linker ventrikel naar boven gericht. Cannuleer de aorta van het hart met een stompe naald aangesloten op een gemodificeerd Langendorff-profusiesysteem in de constante stroomsnelheidsmodus. Perfuseer het hart met zuurstofbellige Tyrode-oplossing bij 37 graden Celsius.Controleer aan het begin van de perfusie de juiste aorta-cannulatie door de bloeduitwassing van het hart tijdens de eerste twee tot drie hartslagen te observeren en de hartkleur van rood naar bleek te veranderen. Pas het debiet aan om de perfusiedruk op 70 tot 80 millimeter kwik te houden. Plaats na bevestiging de elektroden van een ECG-systeem voor kleine dieren rond het hart door ze in de siliconenelastomeercoating in de schaal te brengen.Neem vervolgens het ECG op met behulp van compatibele software. Voer vervolgens adrenerge receptorstimulatie uit en perfuseer het hart met isoproterenol en Tyrode-oplossing. Voer na 10 minuten geprogrammeerde elektrische stimulatie uit om ventriculaire tachyaritmieën te induceren door het hart aan de top te stimuleren met twee platina-elektroden aangesloten op een elektrische stimulator.Start de stimulatieprocedure met initiële 10 opeenvolgende stimuli, S1, gevolgd door een extra stimulus, S2, met een initieel interval van 80 milliseconden. Verminder vervolgens herhaaldelijk het S2-interval met twee milliseconden per keer totdat de hartslag niet langer kan worden vastgelegd of de effectieve refractaire periode van het hart, of ERP, is bereikt. Controleer alle geïnduceerde ventriculaire tachyaritmieën, waaronder ventriculaire tachycardie en fibrillatie, door middel van ECG.Als er geen aritmieën worden geïnduceerd. voeg nog een extra stimulus toe, S3, na S2, met dezelfde parameters totdat het ERP is bereikt. Als ventriculaire tachyaritmieën nog steeds niet worden geïnduceerd, stop dan met de elektrische stimulatie en beschouw het hart als niet-induceerbaar.Tijdens de geprogrammeerde elektrische stimulatie wordt de succesvolle pacing van het hart geverifieerd door de één-op-één opname van de hartslag tijdens de opeenvolgende S1-stimuli en het langdurige QRS-complex tijdens S1-pacing. Deze gecombineerde adrenerge en elektrische stimulaties veroorzaakten geen ventriculaire tachyaritmieën in gezonde, schijngestuurde wild-type muisharten, of in controle adenovirus-GFP-geïnjecteerde rattenharten. Daarentegen induceerde hetzelfde protocol ventriculaire tachyaritmieën bij 77% van de wild-type muisharten na een hartinfarct en bij drie van de vier ratten na intramyocardiale injectie van Ad-Wnt3a.Zorg er tijdens het inbrengen van de naald voor dat de punt van de naald in de vrije wand is ingebed en niet in de ventrikel. Ook het beveiligen en cannuleren van de aorta van het hart is de meest kritieke stap. Na deze procedures kunnen harten worden gebruikt voor standaard histologische studies of moleculaire biologie-assays.Als alternatief kunnen levende cellen worden geïsoleerd om eencellige elektrofysiologische studies uit te voeren.

viral-transgene-expression-rodent-hearts-assessment-cardiac

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Telemetrische ECG heeft zich ontpopt als een essentieel instrument bij de beoordeling van diermodellen voor hartritmestoornissen en plotselinge hartdood. Hier presenteren wij een stapsgewijze handleiding voor telemetrische ECG-opnames voor toepassing in de lange termijn ambulante ECG monitoring in muizen.

Ambulante ECG opnemen in Muizen

Een methode van gen-overdracht voor de behandeling van ischemisch hartfalen wordt beschreven met behulp van een varkens-model van een myocardinfarct. Onze eenvoudige en reproduceerbare methode stelt ons in staat om de effectiviteit van verschillende gen-overdracht gemakkelijk te evalueren met een zeer eenvoudige en reproduceerbare manier.

Gene Transfer voor ischemisch hartfalen in een preklinisch model

In this video, we demonstrate recombinant adeno associated virus-based gene delivery in the mouse pup. This method helps in studying gene expression in the targeted cells.

Recombinant Adeno Associated Virus Based Gene Delivery: A Technique for Transgene Delivery and Cardiac-Specific Expression in Rodent Model

Dit protocol beschrijft een methode voor live celbeeldvorming met behulp van primaire neonatale rattencardiomyocyten na lentivirale en adenovirale transductie met behulp van confocale spinning disk microscopie. Dit maakt gedetailleerde observaties van cellulaire processen in levende cardiomyocyten mogelijk.

Live cell imaging van primaire Rat Neonatale Cardiomyocytes Na Adenovirale en Lentiviral Transduction via confocale draaiende schijf Microscopie

In dit manuscript wordt een methode beschreven om recombinant adeno-geassocieerd virus 9 (rAAV9) vectoren te bereiden voor het manipuleren van genexpressie in het muizenhart.

Voorbereiding van de rAAV9 tot overexpressie of Knockdown Genes in Mouse Hearts

Hier presenteren we een protocol voor cardiale-specifieke genetische manipulatie in muizen. Onder verdoving, werden de muis harten externalized door de Vierde intercostale ruimte. Vervolgens blot adenovirussen coderen specifieke genen werden ingespoten met een injectiespuit in het myocardium, gevolgd door eiwit expressie meting via in vivo imaging en Western analyse.

Een eenvoudige en efficiënte methode voor In Vivo Cardiac-specifieke genetische manipulatie door Intramyocardial injectie in muizen

Hier presenteren we een protocol voor de modulatie van het intracardiac autonome zenuwstelsel en de beoordeling van de invloed daarvan op fundamentele electrofysiologie, arrhythmogenesis en kamp dynamiek met behulp van een ex vivo Langendorff setup.

Impact van Intracardiac neuronen op cardiale electrofysiologie en Arrhythmogenesis in een Ex Vivo Langendorff systeem

Dit werk rapporteert een methode voor het regelen van het hartritme van intacte muizen van transgene channelrhodopsine-2 (ChR2) muizen met behulp van lokale fotostimulatie met een micro-LED-array en gelijktijdige optische mapping van epicardiale membraanpotentiaal.

Geavanceerd hartritmebeheer door toepassing van optogenetische multi-site fotostimulatie in muizenharten

Myocardiale gentherapie voor ischemische hartziekten is veelbelovend voor toekomstige therapieën. Hier introduceren we een groot diermodel voor het evalueren van de werkzaamheid van gentherapie in het ischemische hart.

Groot diermodel voor het evalueren van de werkzaamheid van de gentherapie in ischemisch hart

Dit protocol introduceert dual-dye optische mapping van muizenharten verkregen van wildtype en knock-in dieren die zijn aangetast door catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie, inclusief elektrofysiologische metingen van transmembraanspanning en intracellulaire Ca2+ transiënten met hoge temporele en ruimtelijke resolutie.

Dual-Dye optische mapping van harten van RyR2R2474S Knock-in muizen van catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie

Dit protocol presenteert een gedetailleerd methodologisch kader voor op elektroporatie gebaseerde transgenese van hartcellen in zich ontwikkelende muizenharten. De video-items die hier worden aangeboden, vergemakkelijken het leren van deze veelzijdige techniek.

Een efficiënte transgenesebenadering voor genafgifte in het embryonale hart van muizen

Leer een minimaal invasieve techniek voor virale transgene expressie in knaagdierharten met echogeleide intramyocardiale injectie. Deze methode maakt efficiënt genexpressieonderzoek en beoordeling van hartritmestoornissen mogelijk.

Virale transgene expressie in knaagdierharten en de beoordeling van het risico op hartritmestoornissen

Meer video's verkennen