Name: Endotheelceltranscytosetest als een in vitro model om de permeabiliteit van de binnenste bloed-retinale barrière te evalueren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Leer een endotheelceltranscytosetest om de permeabiliteit van de binnenste bloed-retinale barrière te evalueren met behulp van humane retinale microvasculaire endotheelcellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies (R01 EY028100, EY024963 en EY031765) aan JC. ZW werd ondersteund door een Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.

Alle dierproeven werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) in het Boston Children's Hospital voor het genereren van lichtmicroscopie en EM-beelden (figuur 3). Protocollen voor de in vivo studies kunnen worden verkregen van Wang et al.24. Alle experimenten met menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen (HRMECs) werden goedgekeurd door het Institutional Biosafety Committee (IBC) in het Boston Children's Hospital.
1. Bereiding van reagentia
<ol><li>Oplossing voor het coaten van weefselkweekschaal: Bereid 0,1% gelatine-oplossing door 1 ml gelatine-stamoplossing (40% -50%) op te lossen in 500 ml steriele weefselkweekklasse 1x PBS (pH = 7,4). Filtreer de oplossing door een filter van 0,22 μm. Bewaar 0,1% gelatine-oplossing bij 2-8°C. Het kan voor onbepaalde tijd bij de genoemde temperatuur in steriele toestand worden bewaard.</li>
	<li>Groeimedium: Bereid 500 ml endotheelcelgroei compleet medium (BAVA) voor door EGM-supplementen op te lossen in het basale medium (EBM) voor endotheelcelgroei volgens de instructies van de fabrikant (Tabel met materialen). Aliquot groeimedium in buizen van 50 ml en bewaar de buizen bij 4 °C. De houdbaarheid van het groeimedium is 12 maanden bij 4 °C.</li>
	<li>Trypsine-oplossing: Voor 0,25% trypsine-EDTA-oplossing, aliquot uit de voorraadflacon in buisjes van 50 ml en bewaren bij 4 °C (tot 2 weken) of −20 °C (tot 24 maanden).</li>
</ol>2. Kweken van HRMECs
<ol><li>Initiële celkweek<ol><li>Laag celkweek Petrischalen (100 mm diameter x 20 mm hoogte) met 5 ml 0,1% gelatine-oplossing onder een laminaire stromingskap en houd ze ongestoord in de kap gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) voor een uniforme coating. OPMERKING: Gelatinecoating van gerechten verbetert de celaanhechting. Als alternatief kunnen ook T75-kweekkolven met gelatine worden gebruikt.</li>
		<li>Voordat u de cellen zaait, aspirateert u de gelatine-oplossing met behulp van een vacuümpomp. De vacuümdruk van de gebruikte aspirator was tot 724 mmHg. OPMERKING: Aspiratie moet onmiddellijk vóór het zaaien van cellen worden gedaan om uitdroging van de coatingoplossing te voorkomen.</li>
		<li>Ontdooi een bevroren injectieflacon met HRMECs (uit opslag in vloeibare stikstof) hetzij met behulp van een waterbad bij 37 °C, hetzij door een warm groeimedium aan de injectieflacon toe te voegen. Eenmaal ontdooid, breng de celsuspensie over naar 9 ml groeimedium (ervan uitgaande dat de ontdooide injectieflacon HRMECs 1 ml is). OPMERKING: De HRMECs werden commercieel verkregen (Materiaaltabel). Het groeimedium dat aan de cellen wordt toegevoegd, moet voor gebruik altijd worden voorgewarmd tot 37 °C.</li>
		<li>Draai de cellen op 200 x g gedurende 5 minuten bij RT en zuig het supernatant voorzichtig op om te voorkomen dat de celpellet wordt verwijderd.</li>
		<li>Resuspenseer de celkorrel in 10 ml groeimedium en breng de resulterende suspensie over op een met gelatine beklede petrischaal. Bewaar de cellen in de incubator op 37 °C en 5% CO2. Doorgaans zijn HRMECs 70% -80% confluent na 72 h. OPMERKING: Het groeimedium wordt om de dag vervangen.</li>
	</ol></li>
	<li>Subcultuur van HRMECs op doorlatende membraaninzetstukken<ol><li>Bereid celkweekfilterinzetstukken (6,5 mm inzetstukken met polycarbonaatmembraan van 0,4 μm poriegrootte, geplaatst in een plaat met 24 putten) voor het zaaien van HRMECs door elke insert (apicale kamer) gedurende 30 minuten te coaten met 200 μL 0,1% gelatine-oplossing onder een laminaire stromingskap. Zorg ervoor dat de oplossing het volledige bodemoppervlak van het filterelement bedekt. OPMERKING: Elke put heeft een apicale en basolaterale kamer gescheiden door een poreus membraan.</li>
		<li>Haal de petrischaal met gekweekte HRMECs (stap 2.1.5.) uit de couveuse en adem de groeimedia op. Spoel de cellen voorzichtig 2x met 10 ml 1x PBS onder een laminaire stromingskap om potentiële zwevende / dode cellen te verwijderen.</li>
		<li>Dissociëren van de cellen met 0,5-1 ml trypsine-EDTA-oplossing en plaats de petrischaal gedurende 5 minuten in de incubator (37 °C en 5% CO2).</li>
		<li>Doof de trypsine-activiteit door 4,5-9 ml groeimedia toe te voegen en breng de celsuspensie over in een buis van 15 ml met behulp van een pipet van 10 ml.</li>
		<li>Draai de cellen op 200 x g gedurende 5 minuten bij RT, verwijder voorzichtig het supernatant en resuspenseer de pellet in 3 ml groeimedia.</li>
		<li>Tel het aantal cellen met behulp van een handmatige hemocytometer of een geautomatiseerde celteller en zaad met een dichtheid van 4 x 104 cellen per filterinzetstuk (d.w.z. 1,25 x 105 cellen / cm2). Het volume van de celsuspensie voor elke insert is 250 μL.</li>
		<li>Ontlucht de coatingoplossing uit de putten met doorlatende inzetstukken en breng 250 μL van de celsuspensie per insert (apicale kamer) over. Voeg alleen medium (d.w.z. zonder cellen) toe aan een van de inserts, die zal worden gebruikt als een "blanco besturingselement" voor TEER-metingen. Voeg tegelijkertijd ook 750 μL medium per put toe, in de basolaterale kamers.</li>
		<li>Houd de 24-wells plaat met doorlatende inserts in de incubator (37 °C en 5% CO2) gedurende 7-12 dagen totdat de gekweekte cellen volledig confluent worden en de gewenste TEER-waarde van ~ 20 Ω·cm2 is bereikt.</li>
		<li>Verander het groeimedium om de dag. Tijdens de mediaverandering, adem de media zorgvuldig op om verstoring van de celmonolaag te minimaliseren en voeg respectievelijk 250 μL en 750 μL verse media per put toe aan de apicale en basolaterale kamers. OPMERKING: Groeimedium wordt veranderd voor zowel de apicale als de basolaterale kamers van de putten.</li>
	</ol></li>
</ol>3. TEER-metingen (figuur 4)
<ol><li>Meet op dag 14 na het zaaien van cellen (stap 2.2.9.) de TEER voor HRMECs met behulp van een epitheliaal volt-ohm meter (EVOM) elektrische weerstand (ER) systeem (Tabel van materialen) als volgt.</li>
	<li>Laad het ER-systeem vooraf op en controleer de functionaliteit van de meter met behulp van de STX04-testelektrode. Kalibreer, indien nodig.</li>
	<li>Sluit de elektrode aan op de meter en breng de elektrode in evenwicht door deze eerst gedurende 15-20 minuten in 70% ethanol te weken en vervolgens kort onder te dompelen in het groeimedium van de celcultuur.</li>
	<li>Houd in de tussentijd de celbevattende 24-wellsplaat in de laminaire stromingskap op RT gedurende 15-20 minuten voor temperatuurbalancering. OPMERKING: TEER-metingen worden beïnvloed door de temperatuur, dus de equilibratiestap is essentieel.</li>
	<li>Voeg voor TEER-meting vers groeimedium toe aan zowel de apicale (250 μL) als de basolaterale (750 μL) kamers van de putten.</li>
	<li>Voer TEER-metingen uit door de elektrode zorgvuldig onder te dompelen, zodat de kortere punt in het inzetstuk zit en de langere punt de bodem van de put raakt. Meet eerst de weerstand over het lege besturingselement. Meet voor elke insert TEER in drievoud. OPMERKING: Voor het spoelen van de elektrode tussen de metingen door wordt kweekmedium gebruikt. Zorg ervoor dat de elektrode in een hoek van 90° ten opzichte van de onderkant van het inzetstuk wordt gehouden voor stabiele metingen.</li>
	<li>Bereken de elektrische weerstand (in Ω,cm2) over de monolaag met behulp van de formule TEER = nettoweerstand (Ω) x oppervlakte van het filterinzetstuk (cm2); hier is de nettoweerstand het verschil tussen de weerstand van elke put (groeimedium met cellen) en de blanco put (alleen groeimedium).</li>
	<li>Voer de verdere behandeling van de cellen pas uit nadat de TEER-waarde ~20 Ω·cm2 heeft bereikt. Als het gewenste TEER-niveau niet wordt bereikt, bewaar de plaat dan in de incubator en meet de TEER de volgende dag. OPMERKING: HRMEC-confluentie kan ook worden gevalideerd door morfologisch onderzoek van de celvorm (onder een microscoop) met typische kasseimorfologie en / of door de aanwezigheid van celverbindingseiwitten met immunohistochemische kleuring afzonderlijk.</li>
</ol>4. Transcytosetest
<ol><li>Clathrin-gemedieerde in vitro transcytose assay met Cy3-tagged transferrine (Figuur 5)<ol><li>Bij het bereiken van confluency met TEER-waarden rond 20 Ω·cm2, ontneemt serum de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2 met behulp van 0,5% FBS in EBM (serumgedroogd medium) in beide kamers (apicale kamer: 250 μL en basolaterale kamer: 750 μL) voorafgaand aan de behandeling met het ligand. Serum-gereduceerde EBM werd gebruikt tijdens de test.</li>
		<li>Incubeer de cellen (met behulp van het serumgecomduceerde medium in stap 4.1.1.) in de apicale kamer met fluorescerend (cyanine 3)-gelabeld transferrineligand (Cy3-Tf) (eindconcentratie van 40 μg/ml) gedurende 60 minuten bij 37 °C. OPMERKING: Platen die Cy3-Tf bevatten, moeten worden beschermd tegen licht om fotobleaching van Cy3-Tf te voorkomen door er aluminiumfolie in te wikkelen en het experiment uit te voeren in een celkweekkap met de lichten uitgeschakeld.</li>
		<li>Leg na 1 uur de plaat op ijs en was de monolaag apisch en basolateraal 4x (3-5 min per wasbeurt) met het serumgecomduceerde medium op RT om de vrije ongebonden Cy3-Tf te verwijderen. OPMERKING: Wassen is essentieel om vrije tracermoleculen te verwijderen en een nauwkeurige aflezing van transcytose mogelijk te maken zonder mogelijke lekkage van de paracellulaire route.</li>
		<li>Voeg vers serumgecomproduceerd medium (zoals in stap 4.1.1.) toe aan de grondig gewassen filterinzetstukken met cellen en breng de inserts over naar verse putten van de 24-wellsplaat met voorverwarmd serumgecomprimeerd medium.</li>
		<li>Incubeer de cellen nog eens 90 minuten in de incubator (37 °C en 5% CO2) en verzamel vervolgens het medium uit de basolaterale kamer.</li>
		<li>Noteer de fluorescentie-intensiteit van de oplossing uit de basolaterale kamer met behulp van een fluorescentiedetector. De niveaus van fluorescentie-intensiteit, gemeten als relatieve fluorescerende eenheden (RFU), geven de hoeveelheid Cy3-Tf-complex transcytosen aan die via clathrin-afhankelijke transcytose over de HRMEC-monolaag is getranscytoseerd.</li>
	</ol></li>
	<li>Caveolae-gemedieerde in vitro transcytosetest met behulp van HRP (figuur 6)<ol><li>Bij het bereiken van volledige confluency met TEER-waarden rond 20 Ω cm2, ontneemt serum de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2 met behulp van 0,5% FBS-bevattend EBM-medium (serumgedroogd medium) vóór de behandeling (zoals in stap 4.1.1.). Serum-gereduceerd EBM-medium werd gedurende de gehele test gebruikt.</li>
		<li>Behandel de cellen in de apicale kamer met de gewenste behandelingen en voertuigcontroles. OPMERKING: Hier hebben we Wnt-modulatoren als voorbeeld gebruikt om de regulatie van caveolae-gemedieerde transcytose door de Wnt-signaleringsroute in HRMECs aan te tonen: humaan recombinant Norrin en Wnt-remmer XAV939. In een typisch experiment werden cellen gedurende 24 uur behandeld in een incubator (37 °C en 5% CO2) met de volgende concentraties: Norrin (125 ng/ml), Norrin (125 ng/ml) + XAV939 (10 μM) en voertuigbesturingsoplossing. Daarnaast werd ook Wnt3a-geconditioneerd medium (geproduceerd uit L Wnt-3A-cellen) gebruikt.</li>
		<li>Incubeer de cellen in de apicale kamer met HRP (5 mg/ml) gedurende 15 minuten bij 37 °C.</li>
		<li>Plaats daarna de 24-wells plaat op ijs en was de apicale en basolaterale kamers intensief 6x met P-buffer (10 mM HEPES pH = 7,4, 1 mM natriumpyruvaat, 10 mM glucose, 3 mM CaCl2, 145 mM NaCl) om de vrije extracellulaire HRP te verwijderen. OPMERKING: Wassen is essentieel om vrije tracermoleculen te verwijderen en een nauwkeurige aflezing van transcytose mogelijk te maken zonder mogelijke lekkage van de paracellulaire route.</li>
		<li>Voeg vers serumgecomprimeerd medium (zoals in stap 4.1.1.) toe aan de apicale kamer en breng de inzetstukken over in een nieuwe put met voorverwarmde media.</li>
		<li>Incubeer de monolaag nog eens 90 minuten in de incubator bij 37 °C en 5% CO2 voordat u het medium uit de basolaterale kamer verzamelt.</li>
		<li>Voeg aan het verzamelde medium 100 μL HRP fluorogeen peroxidasesubstraat (Materiaaltabel) toe volgens de instructies van de fabrikant en incubeer bij RT gedurende 10 minuten voordat u de reactie stopt met 100 μL Stop-oplossing.</li>
		<li>Detecteer de niveaus van hrp-substraatreactieproduct in de media met behulp van een fluorescentieplaatlezer. Meet de fluorescentie-intensiteit bij 420 nm emissiegolflengte (met 325 nm excitatie) en als relatieve fluorescerende eenheden (RFU). De waarden geven het niveau van HRP-transcytosen aan dat door de HRMEC-laag wordt getranscytoseerd door middel van caveolae-gemedieerde transcytose. OPMERKING: Het fluorescerende product dat hier wordt gebruikt (materiaaltabel) maakt geen fotobleach. Lichtbescherming tegen fotobleaching is niet nodig.</li>
	</ol></li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten of financiële belangen te onthullen.

BRB speelt een essentiële rol in de gezondheid en ziekte van het netvlies. In vitro technieken die de vasculaire permeabiliteit beoordelen, zijn cruciale hulpmiddelen gebleken in studies met betrekking tot de ontwikkeling en functie van barrières (BRB/BBB). De hier beschreven procedure kan worden gebruikt om de moleculaire mechanismen te bestuderen die ten grondslag liggen aan EC-transcytose of om gerelateerde moleculaire modulatoren te evalueren die de BRB-permeabiliteit beïnvloeden. In vitro EC-transc...

Het menselijk netvlies is een van de meest energie-eisende weefsels in het lichaam. Een goede werking van het neurale netvlies vereist een efficiënte toevoer van zuurstof en voedingsstoffen, samen met een beperkte flux van andere potentieel schadelijke moleculen om de retinale omgeving te beschermen, die wordt gemedieerd via de bloed-retinale barrière (BRB)1. Vergelijkbaar met de bloed-hersenbarrière (BBB) in het centrale zenuwstelsel, fungeert de BRB als een selectieve barrière in het oog en reguleert de beweging van ionen, water, aminozuren en suiker in en uit het netvlies. BRB handhaaft ook retinale homeostase en zijn immuunprivilege door blootstelling aan circulatoire factoren zoals immuuncellen, antilichamen en schadelijke pathogenen te voorkomen2. BRB-disfunctie draagt bij aan de pathofysiologie van verschillende vasculaire oogziekten, zoals diabetische retinopathie, leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), retinopathie van prematuriteit (ROP), retinale ader occlusie en uveïtis, resulterend in vasogeen oedeem en daaropvolgend verlies van het gezichtsvermogen 3,4,5.
De BRB bestaat uit twee afzonderlijke barrières voor twee verschillende oculaire vasculaire netwerken, respectievelijk: de retinale vasculatuur en de fenestrated choriocapillaris onder het netvlies. De binnenste BRB (iBRB) bestaat voornamelijk uit retinale microvasculaire endotheelcellen (RMEC's) die de retinale microvasculatuur bekleden, die de binnenste retinale neuronale lagen voedt. Aan de andere kant vormt het retinale pigmentepitheel het belangrijkste onderdeel van de buitenste BRB, die tussen het neurosensorische netvlies en choriocapillaris2 ligt. Voor de iBRB vindt moleculair transport over RMEC's plaats via zowel paracellulaire als transcellulaire routes (figuur 1). De hoge mate van stofselectiviteit in de iBRB is afhankelijk van (i) de aanwezigheid van junctionele eiwitcomplexen die het paracellulaire transport tussen aangrenzende endotheelcellen (EC's) beperken, en (ii) lage expressieniveaus van caveolae-mediatoren, transporters en receptoren in de endotheelcellen die lage transcellulaire transportsnelheden handhaven 1,6,7,8 . Junctionele complexen die de paracellulaire flux reguleren, bestaan uit tight junctions (claudins, occludins), adherens junctions (VE cadherins) en gap junctions (connexinen), waardoor de doorgang van water en kleine in water oplosbare verbindingen mogelijk is. Terwijl kleine lipofiele moleculen passief diffunderen over het binnenste van RMEC's, wordt de beweging van grotere lipofiele en hydrofiele moleculen gereguleerd door ATP-aangedreven trans-endotheelroutes, waaronder vesiculaire transport- en membraantransporters 5,9.
Vesiculaire transcytose kan worden gecategoriseerd als caveolin-gemedieerde caveolaire transcytose, clathrine-afhankelijke (en receptor-gemedieerde) transcytose en clathrin-onafhankelijke macropinocytose (figuur 2). Deze vesiculaire transportprocessen omvatten blaasjes van verschillende grootte, waarbij macropinosomen de grootste zijn (variërend van 200-500 nm) en caveolae de kleinste (gemiddeld 50-100 nm), terwijl clathrin-gecoate blaasjes variëren van 70-150 nm10. Caveolae zijn kolfvormige lipiderijke plasmamembraaninvaginaties met een eiwitlaag, voornamelijk samengesteld uit caveolin-1 die lipidemembraancholesterol en andere structurele en signaaleiwitten bindt via hun caveolin-steigerdomein11. Caveolins werken samen met perifeer gehechte cavin om caveolae-stabilisatie op het plasmamembraan te bevorderen12. Caveolar membranen kunnen ook receptoren dragen voor andere moleculen zoals insuline, albumine en circulerende lipoproteïnen, waaronder high-density lipoprotein (HDL) en low-density lipoprotein (LDL) om hun beweging over endotheelcellen te ondersteunen13. Tijdens de ontwikkeling hangt de vorming van functionele BRB af van de onderdrukking van EC-transcytose8. Volwassen retinaal endotheel heeft daarom relatief lage niveaus van caveolae-, caveolin-1- en albuminereceptoren ten opzichte van andere endotheelcellen onder fysiologische omstandigheden, wat bijdraagt aan de barrière-eigenschappen 4,9.
Omdat iBRB-afbraak een belangrijk kenmerk is van veel pathologische oogaandoeningen, is het essentieel om methoden te ontwikkelen om de retinale vasculaire permeabiliteit in vivo en in vitro te beoordelen. Deze methoden helpen waarschijnlijk inzicht te geven in de mechanismen van gecompromitteerde BRB-integriteit en beoordelen de werkzaamheid van potentiële therapeutische doelen. Huidige in vivo beeldvorming of kwantitatieve vasculaire lekkagetests maken meestal gebruik van fluorescerende (natriumfluoresceïne en dextran), colorimetrisch (Evans Blue-kleurstof en mierikswortelperoxidase [HRP] substraat) of radioactieve tracers14 om extravasatie van de vasculatuur naar omliggende retinale weefsels te detecteren met microscoopbeeldvorming of in geïsoleerd weefsellysaat. Een ideale tracer voor het kwantificeren van vasculaire integriteit moet inert en groot genoeg zijn om gecompromitteerde bloedvaten vrij te doordringen terwijl ze beperkt zijn tot gezonde en intacte haarvaten. Methoden die natriumfluoresceïne of fluoresceïne isothiocyanaat-geconjugeerde dextran (FITC-dextran) gebruiken in levende fundus fluoresceïneangiografie (FFA) of geïsoleerde retinale flat mounts worden veel gebruikt voor het kwantificeren van retinale extravasatie in vivo of ex vivo. FITC-dextran heeft het voordeel dat het beschikbaar is in verschillende molecuulgewichten, variërend van 4-70 kDa voor grootteselectieve studies 15,16,17. FITC-albumine (~68 kDa) is een alternatieve grootschalige eiwittracer van biologische relevantie voor vasculaire lekkagestudies18. Evans Blue-kleurstof, geïnjecteerd intracardiaal19, retro-orbitaal of door de staartader20, vertrouwt ook op zijn binding met endogene albumine om een groot molecuul te vormen dat kan worden gekwantificeerd door meestal spectrofotometrische detectie of, minder vaak, fluorescentiemicroscopie in platte mounts20,21. Deze kwantitatieve of lichte beeldvormingsmethoden maken echter vaak geen onderscheid tussen paracellulair transport en trans-endotheeltransport. Voor de specifieke analyse van transcytose met ultrastructurele visualisatie van getranscytoseerde blaasjes, worden tracermoleculen zoals HRP meestal gebruikt om transcytosed blaasjes te lokaliseren in endotheelcellen die kunnen worden waargenomen onder een elektronenmicroscoop 22,23,24 (figuur 3A-C).
De ontwikkeling en het gebruik van in vitro iBRB-modellen om de permeabiliteit van endotheelcellen te evalueren, zou een robuuste en hoge doorvoerbeoordeling kunnen bieden als aanvulling op in vivo experimenten en het onderzoek naar moleculaire regulatoren van vasculaire lekkage te ondersteunen. Veelgebruikte testen om het paracellulaire transport en de integriteit van tight junctions te beoordelen, zijn trans-endotheel elektrische weerstand (TEER), een maat voor ionische geleiding (figuur 4) 2,25, en in vitro vasculaire lekkagetest met behulp van fluorescerende tracers met een klein molecuulgewicht26. Bovendien zijn transferrine-gebaseerde transcytose-assays die BBB modelleren gebruikt om clathrin-afhankelijke transcytose27 te onderzoeken. Desondanks zijn de testen om BRB en, meer specifiek, retinale EC caveolaire transcytose in vitro te evalueren beperkt.
In deze studie beschrijven we een EC-transcytosetest met behulp van menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen (HRMECs) als een in vitro model om iBRB-permeabiliteit en EC-transcytose te bepalen. Deze test is gebaseerd op het vermogen van HRMECs om transferrine of HRP te transporteren via respectievelijk de receptor-gemedieerde of caveolae-afhankelijke transcytoseroutes (figuur 2). HRMECs gekweekt tot volledige confluentie in de apicale kamer (d.w.z. filterinzet) werden geïncubeerd met fluorescerend-geconjugeerd transferrine (Cy3-Tf) of HRP om de fluorescentie-intensiteit te meten die overeenkomt met de niveaus van transferrine of HRP die uitsluitend door EC-transcytose naar de onderste kamer worden overgebracht. De samenvloeiing van de celmonolaag kan worden bevestigd door TEER te meten, wat de tight junction-integriteitaangeeft 25. Om de TEER- en transcytosetesttechniek aan te tonen, werden bekende moleculaire modulatoren van vasculaire permeabiliteit en EC-transcytose gebruikt, waaronder vasculaire endotheelgroeifactor (VEGF)28 en die in Wnt-signalering (Wnt-liganden: Wnt3a en Norrin)29.

<table><tbody><tr><td>Biologische veiligheidskast&nbsp;</td><td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td><td>1286</td><td></td></tr><tr><td>Celcultuur petrischaal&nbsp;</td><td>Nest Biotechnology</td><td>704001</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugebuizen (15 mL)</td><td>Corning Inc.</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugebuizen (50 mL)</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>Cyanine 3-menselijke Transferrine&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>AB_2337082</td><td></td></tr><tr><td>Endotheelcel basaal medium-2 (EBM-2)</td><td>Lonza Bioscience</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>Endotheelcel groeimedium-2 (EGM-2) SingleQuots supplementen</td><td>Lonza Bioscience</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>EVOM Millicell elektrische weerstandssysteem-2 (ERS-2)</td><td>Millipore</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runder serum (FBS)</td><td>Lonza Bioscience</td><td>CC-4102B</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer (2-chip)</td><td>Bulldog Bio</td><td>DHC-N002</td><td></td></tr><tr><td>Mierikswortelperoxidase (HRP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8250</td><td></td></tr><tr><td>Menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen (HRMEC)</td><td>Cell Systems</td><td>ACBRI 181</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>L cellen (voor Control-geconditioneerd medium)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2648</td><td></td></tr><tr><td>L Wnt-3A cellen (voor Wnt3A-geconditioneerd medium)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr><tr><td>Lichtmicroscoop</td><td>Leica</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>Multimode Plate Reader</td><td>EnSight, PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) buffer (1x)</td><td>GIBCO</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substraat kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15169</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant menselijke Norrin (rhNorrin)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>3014-NR</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant menselijke Vasculaire endotheliale groeifactor (rhVEGF)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>Spuitfilter (0,22 &micro;m)</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Transwell inserts (6,5 mm transwell, 0,4 &micro;m pore polyester membraan inzet)</td><td>Corning Inc.</td><td>CLS3470-48EA</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25%) (1x)</td><td>GIBCO</td><td>25-200-072</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>Precision, Thermo Fisher Scientific</td><td>51221060</td><td></td></tr><tr><td>XAV939 (Wnt/β-catenine remmer)</td><td>Selleckchem</td><td>S1180</td><td></td></tr></tbody></table>

endotheelceltranscytosetest als een in vitro model om de permeabiliteit van de binnenste bloed-retinale barrière te evalueren

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Disfunctie van de bloed-retinale barrière (BRB) draagt bij aan de pathofysiologie van verschillende vasculaire oogziekten, vaak resulterend in retinaal oedeem en daaropvolgend verlies van het gezichtsvermogen. De binnenste bloed-retinale barrière (iBRB) bestaat voornamelijk uit retinaal vasculair endotheel met lage permeabiliteit onder fysiologische omstandigheden. Dit kenmerk van lage permeabiliteit wordt strak gereguleerd en gehandhaafd door lage snelheden van paracellulair transport tussen aangrenzende retinale microvasculaire endotheelcellen, evenals transcellulair transport (transcytose) erdoorheen. De beoordeling van retinale transcellulaire barrièrepermeabiliteit kan fundamentele inzichten verschaffen in iBRB-integriteit in gezondheid en ziekte. In deze studie beschrijven we een endotheelcel (EC) transcytosetest, als een in vitro model voor het evalueren van iBRB-permeabiliteit, met behulp van menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen (HRMECs). Deze test beoordeelt het vermogen van HRMECs om transferrine en mierikswortelperoxidase (HRP) te transporteren in respectievelijk receptor- en caveolae-gemedieerde transcellulaire transportprocessen. Volledig confluente HRMECs gekweekt op poreus membraan werden geïncubeerd met fluorescerend gelabeld transferrine (clathrin-afhankelijke transcytose) of HRP (caveolae-gemedieerde transcytose) om de niveaus van transferrine of HRP te meten die naar de onderste kamer werden overgebracht, wat wijst op transcytoseniveaus in de EC-monolaag. Wnt-signalering, een bekende route die iBRB reguleert, werd gemoduleerd om de caveolae-gemedieerde HRP-gebaseerde transcytose-testmethode te demonstreren. De hier beschreven EC-transcytosetest kan een nuttig hulpmiddel zijn voor het onderzoeken van de moleculaire regulatoren van EC-permeabiliteit en iBRB-integriteit in vasculaire pathologieën en voor het screenen van medicijnafgiftesystemen.

EM-beelden van retinaal vasculair endotheel tonen transcytotisch vesiculair transport en caveolaire blaasjes in endotheelcellen in vivo. EC-transcytose kan in vivo worden gevisualiseerd binnen retinale doorsneden met donkerbruin neerslag dat HRP-bevattende bloedvaten reflecteert onder een lichtmicroscoop (figuur 3A) en als elektrondicht neerslag indicatief voor HRP-bevattende transcytotische blaasjes (<strong class="xfig...

Dit protocol illustreert een in vitro endotheelceltranscytosetest als een model om de permeabiliteit van de binnenste bloed-retinale barrière te evalueren door het vermogen van menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen te meten om mierikswortelperoxidase over cellen te transporteren in caveolae-gemedieerde transcellulaire transportprocessen.

Endotheelceltranscytosetest als een in vitro model om de permeabiliteit van de binnenste bloed-retinale barrière te evalueren

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

Dit protocol biedt een nuttig celgebaseerd model voor het bestuderen van de functie en permeabiliteit van selectieve vasculaire barrières zoals bloed-retinale of bloed-hersenbarrière met een specifieke focus op endotheeltranscytose. Deze test is eenvoudig op te zetten en te gebruiken en vereist geen levende dieren. Het kan worden gebruikt voor het onderzoeken van verschillende moleculaire regulatoren van endotheelcelpermeabiliteit en transcytose die de integriteit van de binnenste bloed-retinale barrière beïnvloeden.Deze test kan inzicht geven in vasculaire biologie en oog- en hersenonderzoek, waardoor een beter begrip ontstaat van molecuulmechanismen die ten grondslag liggen aan BRB BBB-controle en het verkennen van potentiële medicijnafgifte over de barrières heen. Bereid om te beginnen de celkweekfilterinzetstukken voor het zaaien van menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen of HRMECs, door elke insert gedurende 30 minuten te coaten met 200 microliter 0,1% gelatine-oplossing onder een laminaire stromingskap. Zorg ervoor dat de oplossing het volledige bodemoppervlak van het filterelement bedekt.Neem een petrischaaltje met gekweekte HRMECs geïncubeerd bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide, en adem de groeimedia op. Spoel de cellen twee keer voorzichtig af met 10 milliliter 1X PBS onder de laminaire stromingskap om de potentiële zwevende of dode cellen te verwijderen. Dissocieer de cellen met 0,5 tot 1 milliliter 0,25% trypsine-EDTA-oplossing en plaats de petrischaal in de incubator op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 5 minuten.Doof de trypsineactiviteit door 4,5 tot 9 milliliter groeimedia toe te voegen en breng de celsuspensie over in een buis van 15 milliliter met behulp van een pipet van 10 milliliter. Draai de cellen op 200 keer g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant voorzichtig en resuspendeer de pellet in 3 milliliter groeimedia.Tel het aantal cellen met behulp van een handmatige hemocytometer of een geautomatiseerde celteller en zaad met een dichtheid van 40.000 cellen per filterinzetstuk. Het volume van de celsuspensie voor elke insert is 250 microliter. Aspirateer de coatingoplossing uit de putten met doorlatende inserts en breng 250 microliter van de celsuspensie per insert over en voeg vervolgens alleen medium toe aan een van de inserts, die zal worden gebruikt als een blanco controle voor transendotheliale elektrische weerstand, of TEER, meting.Voeg tegelijkertijd ook 750 microliter medium per put toe in de basolaterale kamers. Houd de 24-well plaat met doorlatende inserts in de incubator op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 7 tot 12 dagen totdat de gekweekte cellen volledig confluent worden en de gewenste TEER-waarde van ongeveer 20 ohm per vierkante centimeter is bereikt. Plaats vóór teer-metingen de celbevattende 24-wellsplaat gedurende 15 tot 20 minuten in de laminaire stromingskap bij kamertemperatuur voor temperatuurbalancering.Om de TEER voor HRMECs te meten, sluit u met behulp van een epitheliaal volt / ohm meter elektrisch weerstandssysteem de elektrode aan op de meter en balanceer de elektrode door deze eerst gedurende 15 tot 20 minuten in 70% ethanol te weken en vervolgens kort onder te dompelen in het egm-groeimedium celcultuur. Voer TEER-metingen uit door de elektrode zorgvuldig onder te dompelen, zodat de kortere punt in het inzetstuk zit en de langere punt de bodem van de put raakt. Meet eerst de weerstand over het lege besturingselement en meet vervolgens voor elke wisselplaat TEER in drievoud.Bij het bereiken van confluency met TEER-waarden rond 20 ohm vierkante centimeter, serum-ontnemen de cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide met behulp van 0,5% FBS in EBM in beide kamers voorafgaand aan de behandeling met het ligand. Serum-gereduceerde EBM werd gebruikt tijdens de test. Incubeer de cellen met behulp van het serum-gereduceerde medium in de apicale kamer met fluorescerende cyanine-3-tag om ligand gedurende 60 minuten bij 37 graden Celsius over te dragen.Nadat u de monolaag apisch en basolateraal 4 keer met het serumgecomduceerde medium hebt gewassen, voegt u vers medium toe aan de filterinzetstukken die de cellen bevatten en brengt u de inserts over naar verse putten van de 24-wellsplaat met voorgewarmd serum-gereduceerd medium. Incubeer de cellen nog eens 90 minuten in de incubator en verzamel vervolgens het medium uit de basolaterale kamer. Noteer de fluorescentie-intensiteit van de oplossing uit de basolaterale kamer met behulp van een fluorescentiedetector.Bij het bereiken van confluency met TEER-waarden rond 20 ohm vierkante centimeter, serum-ontnemen de cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide met behulp van 0,5% FBS in EBM in beide kamers voorafgaand aan de behandeling met het ligand. Serum-gereduceerde EBM werd gebruikt tijdens de test. Behandel vervolgens de cellen in de apicale kamer met de gewenste behandelingen en voertuigcontroles.Voeg 5 milligram per milliliter mierikswortelperoxidase, of HRP, toe aan de cellen en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg vers serumgecomproduceerd medium toe aan de apicale kamer en breng de inserts over naar een verse put met voorbewarmde media. Incubeer de monolaag nog eens 90 minuten in de incubator.Voeg na het verzamelen van medium uit de basolaterale kamer 100 microliter HRP fluorogeen peroxidasesubstraat toe aan het verzamelde medium en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Stop de reactie met 100 microliter stopoplossing en detecteer de niveaus van hrp-substraatreactieproduct in de media met behulp van een fluorescentieplaatlezer. Alvorens de in vitro transcytose-assays aan te tonen, wordt visualisatie van endotheelceltranscytose in het netvlies weergegeven als achtergrondinformatie.Hier toont de lichtmicroscoopafbeelding een met HRP gevuld bloedvatlumen van een 3 maanden oude wild-type muis retinale sectie gekleurd met DAB. HRP werd retro-orbitaal geïnjecteerd. Met HRP gevulde retinale vaten kunnen worden gezien als donkerbruin neerslag onder de lichtmicroscoop.Transmissie-elektronenmicroscoop ultradunne sectie toont HRP-gevulde transcytotische vaten met RMEC's die EC-transcytose over de binnenste bloed-retinale barrière weergeven. Hier reflecteert het grote blaasje mogelijk macropinosoom en een rode bloedcel aan de luminolzijde. TeM-afbeelding toont HRP-gevulde kleine transcytotische blaasjes, waarschijnlijk caveola-blaasjes, binnen het RMEC.Immunohistochemische kleuring van CAV-1-antilichaam en isolectine B4 toont de lokalisatie van CAV-1, een marker van caveola-blaasjes in retinale bloedvaten, in het 3 maanden oude wild-type muis netvlies. TeM-afbeelding van immunogoud-gelabeld CAV-1 in de retinale endotheelcellen wordt hier getoond met een vergroot beeld van CAV-1 positief caveola-blaasje. Voor clathrin-gemedieerde EC-transcytosetest in HRMECs met behulp van transferrine, hier, toont een fluorescentiemicroscoopafbeelding endocytosed Cy3-transferrine in rode kleur binnen HRMECs gekleurd met DAPI in blauw.Voor caveolae-gemedieerde EC-transcytose met behulp van HRP wordt Wnt-signalering hier als voorbeeld gebruikt om de test aan te tonen. Wnt-signalering bleek onlangs caveolae-gemedieerde EC-transcytose te reguleren. Cellen werden behandeld met Wnt-pathway activator Wnt3a-geconditioneerd medium en recombinant Norrin, met of zonder Wnt-signaleringsremmer XAV939 en hun reactieve controles.Wnt-activatoren verlaagden het niveau van de op HRP gebaseerde transcytose, die werden omgekeerd door XAV939. Correcte TEER-meting is cruciaal om de integriteit van de monolaag te bepalen. Het wordt sterk beïnvloed door verschillende factoren zoals onjuiste hantering, temperatuurschommelingen, kweekmedium, kweekduur, et cetera.Deze test kan worden gewijzigd als co-kweek- of 3D-organotypische kweeksystemen die in vivo omstandigheden nabootsen.

endothelial-cell-transcytosis-assay-as-an-vitro-model-to-evaluate

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video describes a permeability assay to evaluate the permeability of in vitro blood-brain barrier using sodium fluorescein molecules.

Blood-Brain Barrier Mimic Permeability Assay: An In Vitro Assay to Assess the Permeability of BBB Mimic to Tracer Molecules

This video demonstrates a method for assessing transendothelial electrical resistance (TEER) in mouse brain microvascular endothelial cells in vitro. A high TEER value indicates intact endothelial cell junctions, while the addition of activated T cells lowers the TEER value, reflecting disruption of the junctional barrier.

Assessing Transendothelial Electrical Resistance in an In Vitro Blood-Brain Barrier Model

Een<em&gt; In vivo</em&gt; Assay naar Blood Vessel Permeabiliteit Test

Vele therapeutische toepassingen vereisen een veilig en efficiënt transport van drugs vervoerders en hun lading over cellulaire barrières in het lichaam. Dit artikel beschrijft een aanpassing van bestaande methoden om de snelheid en het mechanisme van het vervoer van drugs nanocarriers (NC's) over cellulaire barrières, zoals de gastro-intestinale (GI) epitheel evalueren.

Modellen en methoden om vervoer van Drug Delivery Systems Across Cellular Barrières Evalueer

Het doel van deze studie was om de reproduceerbaarheid van een in vitro BBB model met een syngene ratten co-kweek van endotheelcellen en astrocyten valideren. De endotheelcellen monolaag gepresenteerd hoge TEER en lage LY permeabiliteit. Expressie van specifieke eiwitten TJ, functionele reacties op ontstekingen en functionaliteit van vervoerders en receptoren werden beoordeeld.

Oprichting van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van Rat bloed-hersenbarrière (BBB): een focus op BBB Ondoordringbaarheid en receptor-gemedieerd transport

Een methode om een in vitro model van de bloed-hersenbarrière te vestigen op basis van een co-cultuur van endotheelcellen van rattenhersenmicrovatsculair en astrocyten wordt beschreven en gevalideerd. Dit systeem bleek een geldige tool te zijn om het effect van nanoformulering op de trans-barrière penetratie van fluorescerende moleculen te bestuderen.

In Vitro Permeatie van FITC-geladen Ferritins Across een Rat bloed-hersenbarrière: een model om de Levering van Nanoformulated Molecules Studie

Hier beschrijven we een in vitro muismodel van de bloed-hersenbarrière dat gebruik maakt van impedantiecelspectroscopie, met een focus op de gevolgen voor de integriteit en permeabiliteit van endotheelcellen na interactie met geactiveerde T-cellen.

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van de bloed-hersen barrière met behulp van Impedantiespectroscopie: een focus op T-cel-endotheelcellen Interaction

Een low-cost, is makkelijk te gebruiken en krachtige systeem opgezet om potentiële behandelingen die bloed retinale barrière schending geïnduceerd door histamine kon verbeteren evalueren. Bloedvat lekkage Müller celactivering en de continuïteit van neuronale processen worden gebruikt om de schadereactie en de omkering van een potentieel geneesmiddel, lipoxine A4 beoordelen.

Een acute retinale model voor het evalueren van Blood Retina Barrier Breach en potentiële geneesmiddelen voor de behandeling

Hier presenteren we een muis hersenen vasculaire permeabiliteit assay gebruik intraperitoneale injectie van fluorescerende traceurs gevolgd door perfusie die gelden voor dierlijke modellen van de bloed - hersenbarrière dysfunctie. Een hemi-hersenen wordt gebruikt voor het beoordelen van permeabiliteit kwantitatief en anderzijds voor tracer visualisatie/immunokleuring. De procedure duurt 5-6 h voor 10 muizen.

Een In Vivo bloed - hersenbarrière permeabiliteit Assay in muizen met behulp van Fluorescently label Tracers

Hier beschrijven we de voorbereiding van van menselijke organoïden afgeleide intestinale epitheliale monolagen voor het bestuderen van de darmbarrièrefunctie, permeabiliteit en transport. Omdat organoïden de oorspronkelijke reactie van epitheelweefsel op externe stimuli vertegenwoordigen, combineren deze modellen de voordelen van uitbreidbaarheid van cellijnen en de relevantie en complexiteit van primair weefsel.

Organoïde-afgeleide epitheliale monolaag: een klinisch relevant in vitro model voor de darmbarrièrefunctie

Leer een endotheelceltranscytosetest om de permeabiliteit van de binnenste bloed-retinale barrière te evalueren met behulp van humane retinale microvasculaire endotheelcellen.

Endotheelceltranscytosetest als een in vitro model om de permeabiliteit van de binnenste bloed-retinale barrière te evalueren

Meer video's verkennen