Experimenteel melanoom immunotherapiemodel met behulp van tumorvaccinatie met een hematopoëtisch cytokine

Dit protocol voorziet in een klinisch solide tumorimmunotherapiemodel en een onderzoeksplatform om de relatie tussen tumorcellen en infiltrerende immuuncellen te bestuderen. Dit op cellen gebaseerde tumorvaccin is handig, eenvoudig te gebruiken en kan worden gecombineerd met andere therapeutische modaliteiten zoals checkpointblokkade, om een additief of synergetisch effect te bereiken dat kan resulteren in krachtigere en hogere tumorimmuniteit. Ann Balancio, een onderzoekstechnicus uit mijn laboratorium, zal helpen om de procedure te demonstreren.

Om te beginnen kweek B16-F10 melanoomcellen in IMDM, met 10% warmte-inactieve FBS, 2 millimolar glutamine, 1 millimol natriumpyruvaat, 1 millimol MEM niet-essentiële aminozuren en 100 eenheden per milliliter elk van penicilline en streptomycine. Houd de cellijn op 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Zaai en oogst de B16-F10 cellen zoals beschreven in het tekstmanuscript.

Verwijder het kweekmedium en was de kolven eenmaal met PBS. Aspirateer PBS en voeg 5 milliliter van 0,25% trypsine-EDTA toe, gevolgd door hard op de rand van de kweekkolf te tikken. Voeg 15 milliliter kweekmedium toe om het trypsine-EDTA te neutraliseren en giet de inhoud van de kolf in een centrifugebuis van 50 milliliter.

Was het oppervlak van de afwas met 10 milliliter PBS en giet in dezelfde centrifugebuis van 50 milliliter. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 200 RCF. Gooi het supernatant weg en breek de celkorrel door met de vinger op de onderkant van de buis te tikken.

Voeg koude 10 milliliter PBS toe en pipetteer voorzichtig de celsuspensie. Tel vervolgens de cellen handmatig met behulp van een hemocytometer. Houd de cellen op ijs voor injectie.

Implanteer 500.000 cellen B16-F10 tumorcellen in 50 microliter koude PBS in de linkerflank, met behulp van een naald van 30 gauge. De dosis geïmplanteerde B16-F10-tumorcellen moet mogelijk worden aangepast in een bereik van 50.000 tot 500.000 cellen voor een succesvolle tumorontwikkeling. Meet na implementatie drie keer per week de lengte en breedte van de tumor met behulp van een elektronische digitale remklauw.

Bereken het tumorvolume en behandel de muizen met een tumorvaccin wanneer tumoren een grootte van twee millimeter hebben bereikt zoals beschreven in het tekstmanuscript. Met behulp van een röntgenbestralingstoestel ingesteld op 160 kilovolt en 25 milliamperes, bestraal cellen met 150 grijze doses gammastralen. Tel en controleer de levensvatbaarheid van de cel door trypan blue-kleuring vóór injectie.

Injecteer de muizen intradermaal met 1 miljoen bestraalde B16-Flt3L-cellen in 50 microliter koude PBS op dezelfde flank als de oorspronkelijke tumorimplantatie. Ongeveer een centimeter van de plaats van de primaire tumor op dag 3, 6 en 9 na de eerste celimplantatie. Markeer de injectieplaatsen van het vaccin met een gekleurde pen om ze te onderscheiden van de primaire tumor.

Als er aanvankelijk 50.000 B16-F10-cellen werden geïmplanteerd, wordt aanbevolen om een vaccinbehandeling uit te voeren op dag 8, 11 en 14. Operatief verwijderde de tumor met de huid van elke geëuthanaseerde muis en plaatste deze in een 24-putplaat met 1 milliliter van 10% FBS RPMI 1640 medium. Snijd de tumoren in kleine stukjes in twee milliliter digestiebuffer en incubeer gedurende 25 minuten bij 37 graden Celsius.

Voeg 10 milliliter van 10%FBS RPMI 1640 medium toe om de spijsvertering te stoppen. Breng de cellen over op een celzeef van 40 micrometer met behulp van een serologische pipet van 25 milliliter. Gebruik vervolgens de zuiger van een spuit van één milliliter om de weefsels te malen.

Centrifugeer de cellen op 500 RCF gedurende 5 minuten bij 4 graden Celsius. Resuspendeer de pellet in 5 milliliter van 40% dichtheid gradiëntspecifiek medium in PBS verdund tot 1x concentratie. Voeg de celsuspensie langzaam toe bovenop 5 milliliter van 80% dichtheid gradiëntspecifiek medium dat PBS bevat.

Centrifugeer naar de cellen bij 325 RCF met een lage reminstelling gedurende 23 minuten bij kamertemperatuur. Verzamel na centrifugatie zorgvuldig de leukocytenlaag op het grensvlak tussen 40% en 80% dichtheidsgradiëntspecifiek medium en passeer het door een 40 micrometer celzeef. Centrifugeer de cellen op 500 RCF gedurende 5 minuten bij 4 graden Celsius.

Incubeer de pellet in twee milliliter rode bloedcellysisbuffer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Voeg na incubatie 10 milliliter van 10% FBS RPMI 1640 medium toe om de RBC-lysisbuffer te doven. Centrifugeer de cellen op 400 RCF gedurende 5 minuten bij 4 graden Celsius.

Resuspendeer de cellen in 0,5 milliliter van 10% FBS RPMI 1640 medium en tel het totale aantal cellen voor gebruik voor verdere analyse. Verzamel de milt of de drainerende lymfeklieren als controles voor de gatingstrategie van immuuncelsubsets door flowcytometrie-analyse. Volg de celisolatiemethode die in het tekstmanuscript wordt beschreven.

Een zichtbare zwarte stip van de geïmplanteerde B16-F10-cellen werd meestal waargenomen op het huidoppervlak ongeveer drie dagen na de implantatie van de tumor. Muizen werden behandeld met een tumorvaccin drie, zes en negen dagen nadat de tumorknobbel de grootte van twee millimeter had bereikt of overschreden. Een significante vermindering van de tumorgroei werd waargenomen in de gevaccineerde muizengroep ongeveer twee weken na tumorimplantatie.

Cellen verzameld uit de leukocytenlaag bevatten veel tumorcellen, waardoor het moeilijk was om de lymfocytenpopulatie gemakkelijk te definiëren. Daarom werden splenocyten parallel gebruikt, voor een goede gating van intratumorale immuuncelsubsets in flowcytometrie-analyse. De gatingstrategieën van CD103 positief, CD11C positief DC, CD8 positief, CD4 positief en Treg werden samen met de compensatiematrix uitgezet.

Representatieve gegevens van verworven rekeningen en frequentie van elke populatie werden ook verstrekt. Intratumorale CD103-positieve, CD11C-positieve DC van gevaccineerde muizen vertoonde een significant verhoogde expressie van het co-stimulerende ligand CD86. Gevaccineerde muizen vertoonden ook een toename van tumorinfiltrerende CD8-positieve en CD4-positieve, Foxp3-negatieve cellen, evenals in CD8-positieve granzyme B-positieve en interferon gamma-positieve CTL's.

Houd voldoende afstand tussen de primaire tumor en het tumorvaccin. Deze fysieke scheiding is van cruciaal belang om mogelijke fusie tussen de twee tumorimplantaten te voorkomen.