Name: Live imaging van microtubulidynamica in glioblastoomcellen die het zebravisbrein binnendringen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Leer microtubulidynamica in glioblastoomcellen bestuderen tijdens herseninvasie met behulp van zebrafish als model. Deze methode biedt hoge resolutie intravitaal beeldvorming voor in vivo analyse van kankercelgedrag.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We zijn Dr. P. Herbomel (Institut Pasteur, Frankrijk) en zijn laboratorium, in het bijzonder Valérie Briolat, en Emma Colucci-Guyon zeer dankbaar voor het leveren van de zebravislijnen en de plastic mal voor micro-injectieplaten, en voor hun waardevolle expertise over experimentele procedures voor zebravissen. We bedanken dankbaar de UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, ondersteund door het Franse nationale onderzoeksbureau France BioImaging, en ANR-10-INBS-04; Investeringen voor de toekomst). Dit werk werd ondersteund door de Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), het Centre National de la Recherche Scientifique, en Institut Pasteur en door de gulle giften van mevrouw Marguerite MICHEL en de heer Porquet.

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Het in beeld brengen van tumor xenografts met eencellige resolutie zal waarschijnlijk een onmisbaar hulpmiddel worden om ons begrip van GBM-biologie te verbeteren. Live beeldvorming in PDX-modellen van muizen heeft geleid tot waardevolle ontdekkingen over hoe GBM collectief het hersenweefsel binnendringt18. Tot op heden is de spatiotemporale resolutie echter niet hoog genoeg om de dynamiek van eiwitten die de GBM-invasie beheersen te onthullen. We redeneerden dat door de orthotopische engrafting v...

Celmotiliteit is een stereotiep proces dat polariteitsasvorming en krachtgenererende cytoskeletale herschikkingen vereist. Actinepolymerisatie en de associatie met myosine worden erkend als de belangrijkste bijdragen aan uitsteek- en contractiele krachten die nodig zijn voor celbeweging1. Microtubuli worden beschouwd als de belangrijkste actoren in celpolarisatie en directionele persistentie tijdens migratie2. In de afgelopen jaren is ook aangetoond dat MT's uitsteeksels creëren en stabiliseren om mechanocompressieve krachten te ondersteunen tijdens celinvasie in 3D3. Meer recent zijn MT's direct betrokken geweest bij mechanotransductie bij focale verklevingen en mechanosensitive migration4. De dynamische instabiliteit die MT-plus einddynamica kenmerkt, bestaat uit herhaalde fasen van polymerisatie (groei) en depolymerisatie (krimp), die worden gecontroleerd door een overvloed aan microtubule-bindende eiwitten en intracellulaire signaleringscascades, zoals die worden geregeld door RHO-GTPases 5,6,7. De rol van het MT-netwerk in celmigratie en invasie heeft het onderzoek naar MT-dynamiek tot een belangrijk element gemaakt om de mechanismen van immuuncel homing, wondgenezing en kankerinvasie beter te begrijpen.
Het vermogen van kankercellen om te ontsnappen aan de primaire tumorkern, zich te verspreiden in de weefsels en secundaire tumoren te genereren, is een cruciale stap in het voorkomen van wereldwijd succes in de oorlog tegen kanker die 50 jaar geleden 8,9 werd verklaard. Een van de grootste obstakels is het begrijpen hoe kankercellen actief het weefsel binnendringen. Belangrijke invasiemechanismen vertrouwen op dezelfde principes als die voor niet-tumorachtige celmigratie10. Er zijn echter specifieke kenmerken van kankercelmigratie naar vorengekomen 11, waardoor de behoefte aan een betere karakterisering van dit type migratie is ontstaan. In het bijzonder, omdat de tumormicro-omgeving verschijnt als een belangrijke speler in kankerprogressie12, is het observeren en analyseren van kankercelinvasie in een relevante fysiologische context essentieel om de mechanismen van kankercelverspreiding te ontrafelen.
MT's staan centraal in de progressie van kanker, om zowel proliferatie als invasie in stand te houden. Nauwkeurige analyse van MT-dynamica in situ kan helpen bij het identificeren van MT-veranderende agentia (MTA) in beide processen. MT-dynamiek varieert drastisch bij een verandering in de omgeving. In vitro voorkomt behandeling met MT-destabiliserende middelen zoals nocodazol de vorming van celuitsteeksels wanneer cellen zijn ingebed in gels in 3D, terwijl het weinig effect heeft op 2D-celmigratie13,14. Hoewel technisch uitdagend, maakt vooruitgang in intravitale beeldvorming in vivo analyse van MT-dynamiek tijdens invasie van kankercellen mogelijk. De observatie van MT's in subcutaan xenogetransplanteerde fibrosarcoomcellen bij muizen onthulde bijvoorbeeld dat tumor-geassocieerde macrofagen de MT-dynamiek in tumorcellen beïnvloeden15. Deze muismodellen omvatten echter uitgebreide chirurgische procedures en blijven onbevredigend voor minder toegankelijke kankers, zoals de zeer invasieve hersentumor GBM.
Ondanks een sombere gemiddelde overlevingstijd van15 maanden 16, is er weinig bekend over de verspreidingswijze van GBM in het hersenparenchym of de belangrijkste moleculaire elementen die GBM-celinvasie in het hersenweefsel ondersteunen. Verbetering van het muis orthotopisch xenograft (PDX) model en de oprichting van schedelvensters boden nieuwe perspectieven voor GBM celinvasiestudies17,18. Vanwege de suboptimale beeldvormingskwaliteit heeft dit model echter meestal longitudinale beeldvorming van oppervlakkige xenografts mogelijk gemaakt en is het tot nu toe niet met succes gebruikt om subcellulaire beeldvorming van cytoskeleteiwitten te bestuderen. Bovendien zijn in de nasleep van het "3Rs" -bevel om het gebruik van knaagdieren te verminderen en te vervangen door lagere gewervelde dieren, alternatieve modellen opgesteld.
Gebruikmakend van de primitieve immuniteit waargenomen bij zebravis (Danio rerio) larven, werd orthotopische injectie van GBM-cellen in het visbrein ontwikkeld 19,20,21. Injectie in de buurt van de ventrikels in de zich ontwikkelende middenhersenenvatvatting het grootste deel van de menselijke GBM-pathofysiologie21, en hetzelfde voorkeurspatroon van GBM-invasie als bij menselijke co-optie wordt waargenomen22. Dankzij de transparantie van de vislarven maakt dit model de visualisatie mogelijk van GBM-cellen die de hersenen binnendringen vanuit de peri-ventriculaire gebieden waar de meeste GBM's worden verondersteld te ontstaan23.
Omdat MT's essentieel zijn voor GBM-celinvasie in vitro24,25, is een betere karakterisering van MT-dynamica en de identificatie van belangrijke regulatoren tijdens celinvasie nodig. Tot op heden hebben de gegevens die zijn gegenereerd met het orthotopische model van zebravissen echter geen subcellulaire analyse van MT-dynamiek tijdens het invasieproces opgenomen. Dit artikel biedt een protocol om MT-dynamiek in vivo te bestuderen en de rol ervan tijdens de invasie van hersenkanker te bepalen. Na stabiele microtubule-etikettering worden GBM-cellen micro geïnjecteerd met 3 dpf in de hersenen van zebravislarven en in realtime in beeld gebracht met een hoge spatio-temporele resolutie tijdens hun progressie in het hersenweefsel. Live beeldvorming van fluorescerende MT's maakt de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van MT plus-end dynamica mogelijk. Bovendien maakt dit model het mogelijk om het effect van MTA's op MT-dynamica en op de invasieve eigenschappen van GBM-cellen in realtime te beoordelen. Dit relatief niet-invasieve protocol in combinatie met een groot aantal larven dat tegelijkertijd wordt behandeld en het gemak van medicijntoepassing (in het viswater) maakt het model een aanwinst voor preklinisch testen.

<table><tbody><tr><td>Glioblastoma celcultuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runder serum</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF00-01</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Modified Eagle's medium</td><td>Eurobio</td><td>CM1MEM18-01</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Penicilline &ndash;streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>U-87 MG</td><td>ECACC</td><td>89081402-1VL</td><td>Cellen</td></tr><tr><td>Lentivirus productie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD bioscience</td><td></td><td>Instrument</td></tr><tr><td>BD FACSDiva software v8.0</td><td>BD bioscience</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>HEK-293T</td><td>Merck</td><td>12022001</td><td>Cellen</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12259</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12260</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Optima XPN-80</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Celpassage en kleuring</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>Hoechst 34580</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63493</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05%)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Zebravis houderij</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie stereomicroscoop LEICA M165FC</td><td>LEICA</td><td>https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Methyleenblauw hydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4159</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>N-Phenylthioureum (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629-25G</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>Transfer Pipettes fijne tips</td><td>Samco Scientific</td><td>232</td><td>Apparatuur</td></tr><tr><td>Transfer Pipettes Large Bulb 3 mL</td><td>Samco Scientific</td><td>225</td><td>Apparatuur</td></tr><tr><td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#: A5040</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>Volvic Bronwater</td><td>DUTSCHER DOMINIQUE SAS</td><td>999556</td><td>Reagens</td></tr><tr><td>Xenotransplantatie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>TPP</td><td>92024</td><td>Apparatuur</td></tr><tr><td>Borosilicaat glas capillaire (1.0 ODx0.58IDx150L mm)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>(#30-0017 GC100-15</td><td>Apparatuur</td></tr><tr><td>CellTram olie vario microinjector</td><td>Eppendorf</td><td>5176000.025</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Microloading pipet tips (Microloader) 20&micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp;5242956003</td><td>Apparatuur</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>NARISHIGE</td><td>https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html</td><td>Apparatuur</td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>Sigma</td><td>M8410-100ml</td><td>Apparatuur</td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Olympus</td><td>KL 2500 LCD</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Universele capillaire houder</td><td>Eppendorf</td><td>5176190002</td><td>Apparatuur</td></tr><tr><td>Vertical Pipette puller</td><td>KOPF (Roucaire)</td><td>Model 720</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Intravitale beeldvorming</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5 cm glazen bodem video-imaging dish</td><td>MatTek Life Sciences, MA, USA</td><td>P35G-1,5-14-C</td><td>Apparatuur</td></tr><tr><td>Acquisitiesoftware: NIS-Elements-AR versie 5.21</td><td>Nikon</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>Heat-Block</td><td>Techne</td><td>DRI-BLOCK DB-2D</td><td>Apparatuur</td></tr><tr><td>Microscoopkop Nikon Ti2E</td><td>Nikon</td><td></td><td>Instrument</td></tr><tr><td>sCMOS camera Prime 95B</td><td>Photometrics</td><td></td><td>Instrument</td></tr><tr><td>sCMOS camera Orca Flash 4</td><td>Hammatsu</td><td></td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Ultrapuur lage smeltpunt agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit</td><td>Hammatsu</td><td></td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Geneesmiddelbehandeling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404-2MG</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>Beeldanalyse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 9.5.1 software</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>ImarisFileConverter 9.5.1</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>Software</td></tr></tbody></table>

live imaging van microtubulidynamica in glioblastoomcellen die het zebravisbrein binnendringen

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

Met een sombere mediane overlevingstijd in echte populaties - tussen 6 en 15 maanden - is glioblastoom (GBM) de meest verwoestende kwaadaardige hersentumor. Falen van de behandeling is voornamelijk te wijten aan de invasiviteit van GBM-cellen, wat spreekt voor de behoefte aan een beter begrip van GBM-beweeglijke eigenschappen. Om het moleculaire mechanisme ter ondersteuning van GBM-invasie te onderzoeken, zijn nieuwe fysiologische modellen nodig die een diepgaande karakterisering van eiwitdynamiek tijdens de invasie mogelijk maken. Deze observaties zouden de weg vrijmaken voor de ontdekking van nieuwe doelen om tumorinfiltratie te blokkeren en de resultaten voor patiënten te verbeteren. Dit artikel meldt hoe een orthotopisch xenograft van GBM-cellen in de hersenen van zebravissen subcellulaire intravitale live beeldvorming mogelijk maakt. Gericht op microtubuli (MT's), beschrijven we een procedure voor MT-etikettering in GBM-cellen, micro-injectie van GBM-cellen in de transparante hersenen van 3 dagen na bevruchting (dpf) zebravislarven, intravitale beeldvorming van MT's in de verspreidende xenografts, het veranderen van MT-dynamiek om hun rol tijdens GBM-invasie te beoordelen en het analyseren van de verkregen gegevens.

Om de rol van MT's tijdens in vivo GBM-invasie te analyseren, beschrijven we hier de belangrijkste stappen om stabiele MT-etikettering in GBM-cellen uit te voeren door lentivirale infectie, orthotopische xenotransplantatie van GBM-cellen in 3 dpf zebravislarven, intravitale beeldvorming met hoge resolutie van MT-dynamiek, MTA-behandeling en de effecten ervan op GBM-invasie, en beeldanalyse van MT-dynamiek en in vivo invasie (figuur 1). MT-dynamiek wordt ge...

We rapporteren een techniek die live beeldvorming mogelijk maakt van microtubule dynamica in glioblastoom (GBM) cellen die een gewerveld hersenweefsel binnendringen. Door de orthotopische injectie van fluorescerend gelabelde GBM-cellen te koppelen aan een transparant zebravisbrein met intravitale beeldvorming met hoge resolutie, kan de cytoskeletdynamiek worden gemeten tijdens in situ kankerinvasie.

Live imaging van microtubulidynamica in glioblastoomcellen die het zebravisbrein binnendringen

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...

Deze methode is gewijd aan het onderzoek naar de rol van microtubuli tijdens de invasie van hersenkanker door de atopische injectie van hersenkankercellen in zebravissen te koppelen aan de subcellulaire intravitale beeldvorming. Het belangrijkste voordeel van de techniek ligt in de hoge ruimtelijke temporele resolutie waarbij het microtubulicytoskelet wordt verkregen. Het is uniek voor in vivo invasiemodellen voor hersenkanker en het maakt diepgaande microtubule dynamica-analyse mogelijk.De subcellulaire beeldvorming van in situ hersenkankercelinvasie kan worden gebruikt voor de analyse van elk eiwit dat mogelijk betrokken is bij kankerinvasie. Om te beginnen, was de glioblastoomcellen gekweekt op 37 graden Celsius met PBS. Maak de cellen los door één milliliter van 0,05% Trypsine EDTA toe te voegen en gedurende vijf tot 10 minuten bij 37 graden Celsius in de celincubator te broeden totdat alle cellen volledig zijn losgemaakt.Resuspendeer de cellen in vijf milliliter volledig glioblastoomcelmedium in een centrifugebuis van 50 milliliter. Voeg 45 milliliter ijskoude PBS toe en centrifugeer gedurende vijf minuten op 134 maal G. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de cellen met é

live-imaging-microtubule-dynamics-glioblastoma-cells-invading

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In deze video, demonstreren we een methode om de ontwikkeling van gewervelde hersenen te analyseren in levende zebravis embryo's bij enkele cel resolutie door confocale microscopie. Dit omvat de methode waarmee we injecteren van de single-cell zebravis embryo en vervolgens monteren en het imago van de zich ontwikkelende hersenen.

Live-Imaging van de zebravis embryonale Brain door confocale microscopie

Dit protocol beschrijft beeldvorming van individuele neuronen of neurale cellen in levende zebravis embryo's. Deze methode wordt gebruikt om cellulaire gedrag en actine lokalisatie met behulp van fluorescentie confocal time-lapse microscopie bestuderen.

Live-Imaging van celbeweeglijkheid en actine cytoskelet van individuele neuronen en neurale cellen in de zebravis embryo&#39;s

De sleutel tot het begrijpen van de morfogenetische processen die de vroege embryo vorm is de mogelijkheid om beeld-cellen met een hoge resolutie. We beschrijven hier een techniek voor het etiketteren van enkele cellen of kleine clusters van cellen in zijn geheel zebravis embryo's met membraan-gerichte Green Fluorescent Protein.

Etikettering en Imaging Cellen in de zebravis achterhersenen

Hoewel het perifere zenuwstelsel (PNS) in staat is om significant herstel na een blessure, is weinig bekend over de cellulaire en moleculaire mechanismen die dit fenomeen regeren. Met behulp van levende, transgene zebravis en een reproduceerbare zenuw doorsnijding test, kunnen we dynamische gliacel gedrag te bestuderen tijdens zenuw degeneratie en regeneratie.

Motor Nerve doorsnijding en Time-lapse beeldvorming van gliacellen Gedrag Live zebravis

De transplantatie van kankercellen is een belangrijk instrument voor de identificatie van kankermechanismen en therapeutische reacties. Huidige technieken zijn afhankelijk van immuun-incompetente dieren. Hier beschrijven we een methode om zebravis tumorcellen te transplanteren in immuun-competente embryo's voor de langetermijnanalyse van tumorcelgedrag en in vivo drugresponsen.

Transplantatie van zebravis-pediatrische hersentumoren in immuungecompetente gastheren voor langdurige studie van tumorcellen gedrag en drugrespons

Hier, laten we het proces van het creëren van een cellulaire elektrische spanning verslaggever zebrafish lijn om te visualiseren van embryonale ontwikkeling, beweging, en vis tumor cellen in vivo.

Visualisatie van cellulaire elektrische activiteit in de zebravis vroege embryo's en tumoren

Hier beschrijven we live-cel beeldvormingstechnieken voor het kwantitatief meten van de migratie en invasie van de cellen van de stam van tumor van de hersenen van glioblastoma na verloop van tijd en onder meerdere behandeling voorwaarden.

Live-cel Imaging tests studie Glioblastoma Brain Tumor stamcel migratie en invasie

Hier presenteren we een methode om de zebravis embryonale hersenen in vivo tot larvale en juveniele stadia in beeld te brengen. Deze microinvasieve procedure, aangepast aan elektrofysiologische benaderingen, biedt toegang tot cellulaire en subcellulaire details van volwassen neuronen en kan worden gecombineerd met optogenetica en neurofarmacologische studies voor het karakteriseren van hersenfunctie en medicamenteuze interventie.

In vivo beeldvorming van volledig actief hersenweefsel in wakkere zebravislarven en juvenielen door schedel- en huidverwijdering

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor in vivo beeldvorming van de hele hersenen van larvale zebravissen met behulp van driedimensionale fluorescentiemicroscopie. De experimentele procedure omvat monstervoorbereiding, beeldacquisitie en visualisatie.

In Vivo Beeldvorming van de hele hersenen van zebravislarven met behulp van driedimensionale fluorescentiemicroscopie

We demonstreren een methode die gebruik maakt van snelle confocale scanscopie om live beeldvorming uit te voeren van microgliacellen in het zich ontwikkelende optische tectum van zebravissen, waardoor de dynamiek van deze cellen in vivo kan worden geanalyseerd.

Live beeldvorming en karakterisering van de dynamiek van microglia in het zebravisembryo

Leer microtubulidynamica in glioblastoomcellen bestuderen tijdens herseninvasie met behulp van zebrafish als model. Deze methode biedt hoge resolutie intravitaal beeldvorming voor in vivo analyse van kankercelgedrag.

Live imaging van microtubulidynamica in glioblastoomcellen die het zebravisbrein binnendringen

Meer video's verkennen