Whole-Brain Single-Cell Imaging en Analyse van Intacte Neonatale Muizenhersenen Met behulp van MRI, Tissue Clearing en Light-Sheet Microscopie

Met ongeveer 100 miljoen cellen in het muizenbrein en de grootte van cellulaire resolutiebeelden in de hele hersenen die de terabyteschaal benaderen, zijn geavanceerde beeldanalysetools nodig om cellen nauwkeurig te kwantificeren. Onze computationele pijplijn kan beelden voorbewerken en kernen in de cortex van de muis kwantificeren met behoud van een redelijk compromis tussen celdetectienauwkeurigheid, beeldtijd en computationele middelen. De procedure wordt gedemonstreerd door Felix Kyere en Ian Curtin, afgestudeerde studenten uit mijn lab.

Monteer het monster om te beginnen in de juiste monstergroottehouder, zodat het monster is georiënteerd met de z-dimensie niet meer dan 5,2 millimeter diep vanwege de nominale werkafstand van de UltraMicroscope II-microscoop. Steek de houder vervolgens in de monsterhouder, zodat de schroef van de houder zich in een hoek van 45 graden bevindt ten opzichte van de steunen van de houder. Plaats vervolgens de houder in een zodanige positie dat het monster loodrecht op het lichtpad is gericht.

Stel daarna de zoombody op de microscoop in op 4x vergroting of hoger, wat 0,75 micrometer per pixel oplevert. Selecteer in de Inspector Pro-software een enkel lichtblad met een numerieke diafragmawaarde van ongeveer 0,08. Om ervoor te zorgen dat de axiale resolutie over de breedte van de afbeelding wordt gehandhaafd, selecteert u Horizontaal dynamisch scherpstellen en past u het aanbevolen aantal stappen toe, afhankelijk van de golflengte van de laser.

Pas vervolgens de fijnfocus voor elk kanaal aan ten opzichte van het registratiekanaal en het laservermogen per kanaal ten opzichte van de kanaaleigenschappen. Pas vervolgens de breedte van de lichte plaat aan op ongeveer 50% om ervoor te zorgen dat het plaatvermogen optimaal wordt verdeeld in de y-dimensie voor de steekproefgrootte. Stel daarna het aantal tegels in met betrekking tot de grootte van het monster met een aanbevolen overlap van 15% tussen tegels en leg afbeeldingen voor elk kanaal sequentieel vast voor elke stapel op een bepaalde tegelpositie.

Download en installeer eerst Conda environment manager voor Linux en NuMorph beeldverwerkingstools. Voer matlab uit op de opdrachtregel en NM_setup. m van NuMorph om softwarepakketten voor beeldanalyse te downloaden en te installeren die nodig zijn voor analyse.

Geef vervolgens voorbeeldnamen, invoer- en uitvoermappen, kanaalinformatie en light-sheet imaging-parameters op door het bestand NM_samples.m. te bewerken. Voor intensiteitsaanpassing, in NMp_template, stelt u intense aanpassing in op true en use_processed_images als onwaar wanneer u met een nieuwe set afbeeldingen werkt. Stel vervolgens save_images en save_samples in als waar.

Stel vervolgens tegelschaduw in op basis om arceringscorrectie toe te passen met behulp van het basisalgoritme, of handmatig om tegelschaduwcorrectie toe te passen met behulp van metingen van de UltraMicroscope II op specifieke breedten van lichtplaten. Voor het uitlijnen van afbeeldingskanalen stelt u in NMp_template channel_alignment in op true en kanaal alignment_method op translatie of elastieken. Stel vervolgens sift_refinement in als true en overlapwaarde van 0,15 om tegeloverlappingen tijdens de afbeelding overeen te laten komen.

Als u voorbewerkingsstappen wilt uitvoeren in MATLAB, geeft u de voorbeeldnaam op en stelt u de configuratie in op NM_config procesvoorbeeld. Voer vervolgens een van de voorbewerkingsstappen uit door NM_process configuratiesteek op te geven terwijl u de fase opgeeft met behulp van intensiteit, uitlijnen of naaien, en controleer de uitvoermap op uitvoerbestanden voor elk van de fasen. Begin met een 3D Atlas-afbeelding en een bijbehorende annotatieafbeelding die elke voxel aan een bepaalde structuur toewijst.

Lijn zowel de Atlas-afbeelding als het annotatiebestand uit om ervoor te zorgen dat ze correct overeenkomen in de juiste richting. Verwerk na het uitlijnen de bestanden in NuMorph om de invoer op te geven zoals beschreven in het manuscript door de opdracht uit te voeren. Stel resample_images in NMa_template in op true en resample_resolution op de Atlas.

Geef vervolgens het kanaalnummer op dat opnieuw moet worden bemonsterd met behulp van resample_channels. Stel daarna register_images in op true, geef de atlas_file op die overeenkomen met het bestand in de Atlas-map en stel registration_parameters in als standaard. Stel vervolgens save_registered_images in op true.

Stel voor kerndetectie, celtelling en classificatie zowel count_nuclei als classify_cells als waar. Stel vervolgens de count_method in op 3dunet en min_intensity om een minimale intensiteitsdrempel voor gedetecteerde objecten te definiëren. Stel vervolgens classify_method in op een drempelwaarde die is gebaseerd op een niet-gecontroleerde fluorescentie-intensiteit op centroïde posities, of SVM die een gesuperviseerde lineaire ondersteuningsvectormachineclassificatie modelleert.

Als u analysestappen wilt uitvoeren in MATLAB, geeft u de voorbeeldnaam op en stelt u de configuratie in op NM_config monster analyseren. Voer vervolgens een van de analysestappen uit door NM_analyze configuratiefase op te geven terwijl u de fase opgeeft met behulp van resample, register, count of classificeren en controleer de uitvoermap op uitvoerbestanden voor elk van de fasen. Stel in NMe_template update in op true en compare_structures_by op een van beide indexen.

Stel vervolgens het sjabloonbestand en de structuurtabel in die alle mogelijke structuurindexen en structuren specificeert die moeten worden geëvalueerd, terwijl u celtelling en celtypeclassificatie opgeeft. Weefselzuivering met behulp van het iDISCO+-protocol en neuronale laagspecifieke kernmarkers resulteerde in duidelijk gedefinieerde celgroepen van neuronen in de bovenste en onderste laag in de isocortex. Het tellen van cellen met NuMorph was afhankelijk van succesvolle voorbewerkingsstappen met intensiteitsaanpassing, kanaaluitlijning en stiksels.

Fouten in voorbewerkingsstappen kunnen echter leiden tot onjuist naaien, wat leidt tot onjuiste uitlijning en stiksels, en dus resulteren in afbeeldingen met een scherp en onscherp patroon. Om kernen uit specifieke hersengebieden te tellen, worden de gestikte afbeeldingen geannoteerd met behulp van Atlas, waardoor annotaties over hersengebieden kunnen worden gelegd. De centroïden van kernen werden gedetecteerd met een getraind 3D U-Net-model in NuMorph met ongeveer 12 miljoen totale kernen die TO-PRO-3-positief waren in de isocortex met ongeveer 2,6 miljoen hersen-twee-positieve en 1,6 miljoen CTIP2-positieve kernen.

Ongeveer 3,7 en 2,9 miljoen TO-PRO-3-positieve totale kernen in respectievelijk de basale ganglia en hippocampale allocortex werden gedetecteerd. De hersen-twee-positieve cellen gedetecteerd in deze twee hersengebieden waren echter verwaarloosbaar, en slechts ongeveer 1,5 in minder dan een miljoen CTIP2-positieve cellen werden elk gedetecteerd in de basale ganglia en hippocampale allocortex. Voer visuele kwaliteitscontroles uit tijdens acquisitie om een goede segmentatie te bereiken.

En de Conda-omgeving goed in te richten om ervoor te zorgen dat er geen fouten worden aangetroffen in een downstream-analyse. Naast het tellen van cellen, maakt deze pijplijn integratie mogelijk met andere segmentatietools die de celgrootte en -vorm meten, die vervolgens kunnen worden vergeleken tussen genotypegroepen. Met onze pijplijn kunnen we identificeren hoe de anatomie van de hersenen verandert bij cellulaire resolutie, wat leidt tot identificatie van celtypen en hersengebieden die belangrijk zijn voor het ziekterisico.