De Peel-Blot-techniek: een cryo-EM-monstervoorbereidingsmethode om enkele lagen te scheiden van meerlagige of geconcentreerde biologische monsters
29 juni 2022
De peel-blot-techniek is een cryo-EM-rastervoorbereidingsmethode die het mogelijk maakt om meerlagige en geconcentreerde biologische monsters in enkele lagen te scheiden om de dikte te verminderen, de monsterconcentratie te verhogen en de beeldverwerking te vergemakkelijken.
De peel-blot-techniek maakt het mogelijk om meerlagige en geconcentreerde biologische cryo-EM-monsters in enkele lagen te scheiden om de dikte te verminderen, de concentratie te verhogen en de beeldverwerking te vergemakkelijken. Monsterconcentraties kunnen worden verhoogd voorafgaand aan de rastervoorbereiding en de peel-blot kan worden aangepast om te resulteren in een dichte verdeling van enkellaagse monsters voor zeer efficiënte gegevensverzameling. Stapel om te beginnen twee stukken filterpapier van 20-25 micrometer porieformaat en plaats ernaast een lange paraffinefilm met het papier naar boven gericht.
Leg een stuk submicron filterpapier op twee extra stukken filterpapier. Plaats de anti-capillaire tang met het gebogen been naar boven en het rechte been naar beneden en selecteer een raster van 600 mesh met de gladde of glanzende kant naar boven. Plaats de tang op een petrischaaltje of een ander verhoogd oppervlak om contact van het schone rooster met andere items te voorkomen.
Verwijder het papier van de paraffinefilm en trek aan de zijkanten om een kleine rand te creëren. Pipetteer twee druppels van 150 microliter, dus 4% trehalose-oplossing op ongeveer één tot twee centimeter van een korte kant van de paraffinefilm. De twee druppels moeten ongeveer een centimeter uit elkaar liggen.
Giet vervolgens op een aparte bank of op de vloer vloeibare stikstof in een kleine polystyreenschuimcontainer en plaats een kleine cryo-EM-roostercontainer in de vloeibare stikstof. Bedek de polystyreenschuimcontainer met pluisvrije doekjes. Om de koolstoffilm van het mica te laten zweven, gebruikt u dumont 5 tang en raakt u één kant van het mica aan in een lichte hoek naar beneden op een van de druppels trehalose-oplossing.
Beweeg de mica naar beneden om de waterspanning langzaam van de koolstoffilm af te laten komen. Laat de mica los zodra de koolstoffilm op het oppervlak van de druppel drijft. Inspecteer de koolstoffilm visueel om te voorkomen dat koolstof wordt gebruikt met schade in de vorm van breuken.
Plaats het rooster dat door de anti-capillaire tang wordt vastgehouden in een hoek van 20-30 graden in een trehalosedruppel op een positie ernaast en centreer het raster vervolgens onder de koolstoffilm. Pak de koolstoffilm op, houd het rooster in dezelfde richting en laat het rooster langzaam zakken op het oppervlak van de tweede druppel trehalose zonder de oppervlaktespanning van de druppel te breken. Dit verwijdert onnodige koolstoffilm die mogelijk rond de rand van het rooster naar de ruwe kant is gewikkeld.
Draai de anti-capillaire tang en plaats ze op een petrischaaltje met de koolstofzijde van het rooster naar beneden gericht. Pipetteer 1,3 microliter van het monster in de lichte trehalose meniscus bovenop het rooster. Pipetteer vervolgens de oplossing ongeveer 8-10 keer om de trehalose en het monster aan beide zijden van het rooster te mengen en te verdelen.
Pipetteer een of meer druppels trehalose-oplossing van 1,7 microliter op de paraffinefilm terwijl u de monstertrehalose-oplossing gedurende één minuut op het rooster incubeert. Draai het raster terug in zijn oorspronkelijke positie met de koolstoffilm naar boven gericht en druk het raster op het submicronfilterpapier met behulp van de anti-capillaire tang. Zodra de oplossing door het filterpapier is geabsorbeerd en de koolstoffilm plat ligt, wacht u drie seconden voordat u het rooster optilt en verticaal op de 1,7 microliter druppel trehalose-oplossing beweegt.
Deze stappen kunnen worden herhaald tussen één tot drie herhalingen of meer, afhankelijk van het monster. Dep het raster op de twee stukken filterpapier en til vervolgens het raster van het filterpapier op. Na ongeveer 13 seconden, afhankelijk van de luchtvochtigheid en monsterbuffer, dompelt u het rooster in de vloeibare stikstof in de kleine piepschuimcontainer en plaatst u het in de cryo-EM-rastercontainer of draagt u het rechtstreeks over voor cryo-EM-screening of gegevensverzameling.
Een 2D-kristalmonster van humaan leukotrieen C4-synthase onderworpen aan de peel-blot-methode wordt hier getoond. Het gebied links van de pijl werd grotendeels gereduceerd tot enkellaagse 2D-kristallen in een contactgebied tussen de koolstoffilm en de rasterbalk die werd afgepeld en vervolgens verschoven. Het gebied rechts van de pijl werd niet beïnvloed door de peel-blot.
De onderste helft van de afbeelding vertegenwoordigt de regio's met grote, meestal enkellaagse fosfolipidenbilagen als gevolg van het aanbrengen van de peel-blot. De bovenste helft bevond zich niet in een contactzone tussen de rasterbalk en de koolstoffilm en bevatte dus complete liposomen met twee fosfolipide bilayers. Het rastervierkant van een raster met 400 mazen toont de voetafdruk van de rasterbalk en de resulterende peel-blotted-gebieden, evenals de regio's die niet in contact waren met een rasterbalk of werden onderworpen aan minder peel-blot-iteraties.
Deze beelden toonden de blotting van een EM-raster bereid door de teruginjectie op een submicron filterpapier met behulp van zeer dunne koolstoffilm. De beelden zijn afzonderlijke frames bij het eerste contact met het membraan, 1.000 milliseconden na contact en 2.000 milliseconden na contact. De pijl geeft rastervierkanten aan waar de capillaire druk de koolstoffilm scheurde.
Het vermijden van breuken in de koolstoffilm en het combineren van submicron filterpapier met een trehalosedruppel van 1,7 microliter om te zuigen en vervolgens de lagen te scheiden, zijn belangrijke stappen. De peel-blotted monsters worden gebruikt voor cryo-EM-gegevensverzameling met hoge resolutie, gevolgd door beeldverwerking voor de structuurbepaling. De peel-blot maakt gestructureerde bepaling mogelijk van enkellaagse eiwit 2D-kristallen die voorheen te dik waren voor cryo-EM.
Bovendien kan het verschillende monsters concentreren in enkele lagen op koolstoffilm.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
De peel-blottechniek is een methode voor de preparatie van cryo-EM-grids waarmee meerlaagse en geconcentreerde biologische monsters kunnen worden gescheiden in enkele lagen. Deze methode vermindert de dikte, verhoogt de monsterconcentratie en vergemakkelijkt de beeldverwerking.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM)
- Biologische monstervoorbereiding
- Beeldverwerkingstechnieken
Achtergrond
- Meerlaagse biologische monsters kunnen de beeldkwaliteit belemmeren.
- Een verhoogde monsterconcentratie is essentieel voor een effectieve gegevensverzameling.
- Traditionele methoden scheiden lagen mogelijk niet adequaat.
- De peel-blot-techniek biedt een oplossing voor deze uitdagingen.
Doel van de studie
- Om de preparatie van cryo-EM-monsters te verbeteren.
- Om de efficiëntie van de gegevensverzameling uit biologische specimens te verhogen.
- Om betere beeldvorming te faciliteren door een verminderde monsterdikte.
Gebruikte methoden
- Het stapelen van filterpapieren om een geschikte omgeving voor monsterscheiding te creëren.
- Het gebruik van anti-capillaire pincetten voor de nauwkeurige hantering van monsters.
- Het gebruik van een rooster van 600 mesh voor optimale beeldvorming.
- Het aanpassen van de peel-blot techniek om een dichte distributie van enkelgelaagde specimens te bereiken.
Belangrijkste resultaten
- De techniek scheidt meerlaagse monsters succesvol in enkele lagen.
- Een verhoogde monsterconcentratie leidt tot verbeterde beelduitkomsten.
- Met de nieuwe methode wordt een efficiënte gegevensverzameling bereikt.
- De monsterpreparatie kan worden aangepast aan specifieke beeldbewerkingsbehoeften.
Conclusies
- De peel-blot-techniek is effectief voor de monstervoorbereiding voor cryo-EM.
- Deze methode verbetert de kwaliteit van biologische beeldvorming.
- Toekomstige toepassingen kunnen worden uitgebreid voorbij het huidige gebruik in cryo-EM.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
De peel-blot cryo-EM monsterpreparatietechniek lost een kritieke flessenhals in de structurele biologie op door de scheiding van meerlaagse of sterk geconcentreerde biologische monsters in enkellagen mogelijk te maken die geschikt zijn voor beeldvorming met een hoge resolutie. Deze mogelijkheid vergroot het voorspellende vertrouwen bij vroege ontdekking en targetvalidatie door optimale monsterkwaliteit voor structurele elucidatie te garanderen. De methode ondersteunt de verdere ontwikkeling van de portfolio door technische risico's te verminderen en de doorvoersnelheid in cryo-EM-gebaseerde workflows te verbeteren.
Strategische toepassingen in biofarma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt structurele analyse mogelijk van membraaneiwitten en complexen die voorheen onbereikbaar waren vanwege de dikte van de monsters.
- Vermindert mechanische ambiguïteit door hoogwaardige enkel-laags preparaten te leveren voor structurele analyse.
- Ondersteunt de functionele validatie van targets door nauwkeurige structuurbepaling van biologisch relevante assemblages te faciliteren.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde enkelledige biologische systemen voor op downstream cryo-EM screening en analyse.
- Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie van monstervoorbereiding voor kwantitatieve imaging-workflows.
- Maakt een efficiënte evaluatie van monsterkwaliteit en concentratie mogelijk voorafgaand aan high-throughput datacollectie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Faciliteert continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie door structurele studies naar ziekterelevante targets te ondersteunen.
- Vermindert het risico op mislukte beeldvorming als gevolg van monsterheterogeniteit of overmatige dikte.
- Ondersteunt de afstemming van translationele biomarkers door hochresolutievisualisatie van complexe assemblages mogelijk te maken.
Integratie van pipeline en workflow
De peel-blot-techniek is geïntegreerd in het cryo-EM-ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot leadidentificatie en preklinisch onderzoek, door de geschiktheid van monsters voor hoge-resolutie beeldvorming en downstream-analyse te waarborgen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door structurele studies van uitdagende monsters mogelijk te maken.
- Screening: Levert reproduceerbare, enkelvoudige specimens voor betrouwbare cryo-EM screening en kwantitatieve beoordeling.
- Analytics: Levert hoogwaardige data-outputs door de monsterdikte te minimaliseren en de efficiëntie van beeldvorming te maximaliseren.
- Translationeel onderzoek: Handhaaft continuïteit in structurele workflows voor ziekte-relevante targets, afhankelijk van het monstertype.
- Enterprise hergebruik: Biedt een gestandaardiseerde, aanpasbare capaciteit voor monsterpreparatie voor diverse biologische complexen.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert de mechanistische onzekerheid in structurele studies.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid, schaalbaarheid en standaardisatie van cryo-EM monstervoorbereiding.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming en kapitaalefficiëntie door technische faalsenpercentages te verlagen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en ontwikkeling van structureel gevalideerde targets mogelijk.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de preparatie van cryo-EM-grids en de hantering van delicate koolstoffilms.
- Vereist toegang tot gespecialiseerde instrumentatie, waaronder anti-capillaire pincetten en submicron filterpapier.
- Noodzaak tot standaardisatie tussen teams van de monsterconcentratie en blotting-parameters.
- Kan aanpassing vereisen voor verschillende monstertypes of gridformaten op basis van de biologische context.
- Praktische beperkingen omvatten gevoeligheid voor vochtigheid, buffersamenstelling en het risico op breuk van de koolstoffilm.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:33
Preparation Steps for the Peel‐Blot Technique
1:57
Placing the Carbon Film onto the Grid
3:07
Separation of Multi-Layered 2D Crystals into Single Layer
6:42
Conclusion
4:55
Results: 2D Crystals of Human Leukotriene C4 Synthase and Liposomes Subjected to the Peel‐Blot Method, the Peel-Blot Footprint, and Blotting an EM Grid Prepared by Back-Injection on a Submicron Filter Paper
