Name: De Peel-Blot-techniek: een cryo-EM-monstervoorbereidingsmethode om enkele lagen te scheiden van meerlagige of geconcentreerde biologische monsters (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Leer de peel-blot-techniek voor cryo-EM-monstervoorbereiding om meervoudige biologische lagen te scheiden. Deze methode vermindert dikte, verhoogt concentratie en verbetert beeldverwerking voor efficiënte dataverzameling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Een deel van dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie HL090630 (ISK).

1. Voorbereidingsstappen voor de peel-blot techniek
OPMERKING: Voorbereiding vereist dat de volgende items naast elkaar worden geplaatst.
<ol><li>Stapel twee stukken filterpapier van 20-25 μm porieformaat (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Plaats een paraffinefilm van ~8 cm x 10 cm lang naast het filtreerpapier met het papier naar boven gericht.</li>
	<li>Leg een stuk submicronfilterpapier op twee extra stukken #4-filterpapier (figuur 1-1).</li>
	<li>Plaats de anti-capillaire tang met het gebogen been naar boven en het rechte been naar beneden. Selecteer vervolgens een raster met 600 mazen met de gladde / glanzende kant naar boven. Plaats de tang op een petrischaaltje of een ander verhoogd oppervlak om contact van het schone rooster met andere items te voorkomen.</li>
	<li>Verwijder het papier van de paraffinefilm en trek aan de zijkanten (~5 mm) om een kleine rand te creëren. Pipetteer twee druppels van 150 μL van 4% trehalose-oplossing ~ 1-2 cm van een korte kant van de paraffinefilm en ~ 1 cm uit elkaar op de paraffinefilm.</li>
	<li>Giet op een aparte bank of op de vloer vloeibare stikstof in een kleine polystyreenschuimcontainer (zie materiaaltabel). LET OP: Ontvang training voor de juiste behandeling met handschoenen en een gezichtsscherm om vorstbeet te voorkomen.</li>
	<li>Plaats een kleine cryo-EM roostercontainer in de vloeibare stikstof en bedek de polystyreenschuimcontainer met pluisvrije doekjes.</li>
</ol>2. De koolstoffilm op het rooster plaatsen
<ol><li>Gebruik de Dumont #5-tang (zie Materiaaltabel) om de koolstoffilm van het mica te laten zweven door één kant van het mica in een lichte hoek naar beneden (~20°-40°) op een van de druppels trehalose-oplossing aan te raken en laat de waterspanning langzaam van de koolstoffilm afstijgen door het mica naar beneden te bewegen. Laat de mica los zodra de koolstoffilm op het oppervlak van de druppel drijft.</li>
	<li>Inspecteer de koolstoffilm visueel om te voorkomen dat koolstof wordt gebruikt met schade in de vorm van breuken.</li>
	<li>Plaats het rooster dat door de anti-capillaire tang onder een hoek (~ 20 ° -30 °) wordt vastgehouden in een trehalosedruppel op een positie naast en vervolgens gecentreerd onder de koolstoffilm. Pak de koolstoffilm op (figuur 1-2).</li>
	<li>Houd het rooster in dezelfde richting en laat het langzaam op het oppervlak van de tweede druppel trehalose zakken zonder de oppervlaktespanning van de druppel te breken om onnodige koolstoffilm te verwijderen die zich mogelijk rond de rand van het rooster naar de ruwe kant heeft gewikkeld.</li>
</ol>3. Scheiding van meerlaagse 2D-kristallen in enkele lagen
<ol><li>Draai de anti-capillaire tang (zie Materiaaltabel) en plaats ze op een petrischaaltje met de koolstofzijde van het rooster naar beneden gericht (figuur 1-3).</li>
	<li>Pipetteer 1,3 μL van het monster in de lichte trehalose meniscus bovenop het rooster. Pipetteer de oplossing ~ 8-10 keer om de trehalose en het monster aan beide zijden van het rooster te mengen en te verdelen.</li>
	<li>Pipetteer tijdens het incuberen van de oplossing gedurende 1 min een of meer druppels trehalose-oplossing van 1,7 μL op de paraffinefilm.</li>
	<li>Draai het raster terug in zijn oorspronkelijke positie met de koolstoffilm naar boven gericht.</li>
	<li>Gebruik de anti-capillaire tang om het raster op het submicronfilterpapier te drukken (figuur 1-4). Zodra de oplossing door het filterpapier is geabsorbeerd en de koolstoffilm plat ligt, wacht u 3 seconden voordat u het rooster optilt en verticaal op de druppel trehaloseoplossing van 1,7 μL beweegt (figuur 1-5). OPMERKING: Herhaal deze stap meerdere keren voor sterk gestapelde monsters, of het raster wordt voorbereid voor vitrificatie in de volgende stappen.</li>
	<li>Dep het raster op de twee stukken filterpapier en til het raster vervolgens van het filterpapier (figuur 1-6). Na ongeveer 13 s, afhankelijk van vochtigheid en monsterbuffer, dompelt u het rooster in de vloeibare stikstof in de kleine piepschuimcontainer en plaatst u het rooster in de cryo-EM-rastercontainer of draagt u het rechtstreeks over voor cryo-EM-screening of gegevensverzameling. OPMERKING: Om het protocol snel te optimaliseren, moet u het geschilde rooster bij deze stap negatief kleuren in plaats van het in vloeibare stikstof te storten. Kleur het monster negatief door 3 μL 1% uranylacetaat op het rooster aan te brengen, incubeer het rooster gedurende 30 s en dep het met een gescheurd stuk filterpapier van 20-25 μm porieformaat. Rasters van 2D-kristallen verglaasd in trehalose, tannine of glucose worden routinematig met de hand gedompeld voor verglazing, omdat trehalose, tannine en glucose de vorming van kristallijn ijs voorkomen met snelheden die worden gebruikt voor het met de hand storten2.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).</li>
	<li>Ku&#776;hlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 &#197; resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207&#160;(4), 823-828 (1989).</li>
	<li>Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2&#160;(1), 1-8 (2018).</li>
	<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27&#160;(3), 545-548 (2019).</li>
	<li>Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438&#160;(7068), 633-638(2005).</li>
	<li>Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).</li>
	<li>Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).</li>
	<li>Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157&#160;(1), 64-72 (2007).</li>
	<li>Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198&#160;(2), 124-133 (2017).</li>
	<li>Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.

De peel-blot is een krachtige methode om stapeling en dikte van meerlaagse 2D-kristallen en soortgelijke monsters voor cryo-EM-gegevensverzameling en beeldverwerking te overwinnen. Een beslissing over het gebruik van de peel-blot zal gebaseerd zijn op biologische parameters van het monster en zal ook moeten worden beoordeeld zodra een 3D cryo-EM-model beschikbaar is. Het biologische belang van contacten en de potentiële flexibiliteit van contactregio's zullen bij deze beoordeling bijzonder belangrijk zijn.
<p class="...

De peel-blot-techniek is ontwikkeld om gestapelde tweedimensionale kristallen van membraaneiwitten in enkele lagen te scheiden om voldoende dunne monsters te verkrijgen voor cryo-EM 2D- en 3D-gegevensverzameling en beeldverwerkingte vergemakkelijken 1. Het protocol is ook geschikt voor andere soorten multilamellaire monsters en voor het bereiken van hoge monsterconcentraties van beide monstertypen op het rooster zonder de dikte in Z te vergroten.
Reductie van monsterlagen tot één laag wordt bereikt door een combinatie van capillaire druk en schuifkrachten toe te passen in een protocol dat de teruginjectiemethode aanzienlijk verlengt en wijzigt2. Een eerste blotting-stap resulteert in strakke sandwiching en hechting aan de koolstoffilm en een rasterbalk aan weerszijden van het meerlagige monster tijdens het blotting op submicron in plaats van de 20-25μm filterpapierporiëngrootte in de back-injectiemethode. De scheiding, of peeling, van een individuele laag vindt plaats bij het forceren van de scheiding van de ingeklemde lagen zodra het raster verticaal op een trehalosedruppel wordt gedrukt, waardoor de koolstoffilm weg wordt gedwongen van de rasterbalk (figuur 1). Het verplaatsen van de koolstoffilm weg van het oorspronkelijke contactpunt met de rasterbalk vindt plaats in de volgende stap, wanneer het raster opnieuw wordt uitgeveegd op submicronfilterpapier. Het aantal iteraties van deze stappen kan worden geoptimaliseerd voor specifieke voorbeelden. Bovendien kan het protocol worden gebruikt om de monsterconcentraties te verhogen en tegelijkertijd aggregatie in Z te vermijden. Vanwege de afhankelijkheid van de naleving van de rasterbalk en koolstoffilm en krachtige scheiding, is deze aanpak mogelijk niet geschikt voor zeer fragiele moleculen zoals bepaalde delicate en / of onstabiele eiwitten en eiwitcomplexen.
De peel-blot techniek vereist geen gespecialiseerde apparatuur of dure benodigdheden. Toepasbaarheid op specifieke monsters vereist echter zorgvuldige overwegingen van biologische parameters. De beslissing is gemakkelijker voor 2D-kristallen omdat koolstoffilm nodig is om vlakheid te garanderen, maar manipulatie via de peel-blot-techniek kan de biologische integriteit van het monster of de kristallijne volgorde beïnvloeden. De geschiktheid van de peel-blot-techniek voor afzonderlijke deeltjes is beperkt tot en kan worden getest voor deeltjes die koolstoffilm nodig hebben en stabiel zijn voor manipulatie. Specimens met kritische biologische interacties tussen lagen zijn mogelijk niet geschikt voor karakterisering met behulp van de peel-blot-techniek vanwege de verstoring van dergelijke interacties.
De peel-blot techniek ("peel-blot") wordt het snelst geoptimaliseerd door testen en screenen met negatieve vlekken of niet-gekleurde monsters door TEM bij kamertemperatuur. Zodra het optimale aantal peel-blot iteraties is geïdentificeerd, kan de tijd om de dikte vóór de vitrificatie te regelen worden bepaald.

<table><tbody><tr><td>600-mesh grids</td><td>SPI</td><td>2060-C-XA</td><td></td></tr><tr><td>Anti-capillary forceps</td><td>Ted Pella</td><td>510-5</td><td></td></tr><tr><td>Carbon om mica te coaten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryo-EM</td><td></td><td></td><td>Cryo-EM roosters kunnen worden gescreend bij 120 kV of 200 kV.  Hoge resolutie gegevens worden verzameld bij 300 kV.</td></tr><tr><td>Dumpont #5 forceps</td><td>Ted Pella</td><td>5622</td><td></td></tr><tr><td>Grid box voor cryo-EM opslag</td><td>Ted Pella</td><td>160-40</td><td></td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vloeibare stikstof</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mica</td><td>Ted Pella</td><td>56</td><td>De mica is met koolstof gecoat en gesneden in vierkanten die iets groter zijn dan een TEM rooster.  De dikte van de koolstof kan moeten worden geoptimaliseerd om dunne koolstof die gemakkelijk breekt bij meerdere peel blots te vermijden.</td></tr><tr><td>Negatieve kleuring</td><td></td><td></td><td>1-2% uranylacetaat is geschikt voor veel monsters.  Andere kleurstoffen zoals fosfowolfraamzuur kunnen worden vervangen.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyreen container</td><td></td><td></td><td>Gebruikt voor het glasvormen van het peel-blot rooster. Een polystyreen verzendcontainer kan voor dit doel worden gerecycled en bekleed met aluminiumfolie.</td></tr><tr><td>Submicron filterpapier</td><td>MilliporeSigma</td><td>DAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Transmissie-elektronenmicroscoop</td><td>JEOL</td><td>JEM-1400</td><td>Elke TEM die wordt gebruikt met een versnellingsspanning van 80-120 kV is geschikt voor het screenen van negatief gekleurde roosters.</td></tr><tr><td>Trehalose</td><td></td><td></td><td>Bereid een 4% trehalose-oplossing.</td></tr><tr><td>Whatman #4 filterpapier</td><td>MilliporeSigma</td><td>WHA1004150</td><td>Dit komt overeen met het filterpapier met een poriëngrootte van 20-25 μm in het protocol.</td></tr></tbody></table>

de peel-blot-techniek: een cryo-em-monstervoorbereidingsmethode om enkele lagen te scheiden van meerlagige of geconcentreerde biologische monsters

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

De peel-blot cryo-EM grid preparation techniek is een significant gewijzigde back-injection methode met als doel het bereiken van een vermindering van lagen van meerlagige monsters. Deze verwijdering van lagen voorafgaand aan het bevriezen van de duik kan helpen bij het verminderen van de dikte van het monster tot een niveau dat geschikt is voor cryo-EM-gegevensverzameling, het verbeteren van de vlakheid van het monster en het vergemakkelijken van beeldverwerking. De peel-blot-techniek maakt het mogelijk om multilamellaire membranen in enkele lagen te scheiden, van gelaagde 2D-kristallen in individuele kristallen en van gestapelde, plaatachtige structuren van oplosbare eiwitten die eveneens in enkele lagen moeten worden gescheiden. De hoge monsterdikte van dit soort monsters levert vaak onoverkomelijke problemen op voor cryo-EM-gegevensverzameling en cryo-EM-beeldverwerking, vooral wanneer de microscoopfase moet worden gekanteld voor gegevensverzameling. Bovendien kunnen rasters van hoge concentraties van elk van deze monsters worden voorbereid voor efficiënte gegevensverzameling, omdat de monsterconcentratie voorafgaand aan de rastervoorbereiding kan worden verhoogd en de peel-blot-techniek kan worden aangepast om te resulteren in een dichte verdeling van eenlaags monster.

Een succesvol peel-blot experiment zal resulteren in enkele lagen monsters in vaak hoge concentraties. Het is te verwachten dat sommige regio's in de meeste rastervierkanten nog steeds meerdere lagen zullen bevatten, vooral bij minder iteraties van de peel-blot-stappen. De meerderheid van de rastervierkanten zal echter uitgebreide gebieden van enkele lagen bevatten, zoals waargenomen voor 2D-kristallen van humaan leukotrieen C4-synthase (figuur 2) en liposomen (toegevoegd in stap ...

De peel-blot-techniek is een cryo-EM-rastervoorbereidingsmethode die het mogelijk maakt om meerlagige en geconcentreerde biologische monsters in enkele lagen te scheiden om de dikte te verminderen, de monsterconcentratie te verhogen en de beeldverwerking te vergemakkelijken.

De Peel-Blot-techniek: een cryo-EM-monstervoorbereidingsmethode om enkele lagen te scheiden van meerlagige of geconcentreerde biologische monsters

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

De peel-blot-techniek maakt het mogelijk om meerlagige en geconcentreerde biologische cryo-EM-monsters in enkele lagen te scheiden om de dikte te verminderen, de concentratie te verhogen en de beeldverwerking te vergemakkelijken. Monsterconcentraties kunnen worden verhoogd voorafgaand aan de rastervoorbereiding en de peel-blot kan worden aangepast om te resulteren in een dichte verdeling van enkellaagse monsters voor zeer efficiënte gegevensverzameling. Stapel om te beginnen twee stukken filterpapier van 20-25 micrometer porieformaat en plaats ernaast een lange paraffinefilm met het papier naar boven gericht.Leg een stuk submicron filterpapier op twee extra stukken filterpapier. Plaats de anti-capillaire tang met het gebogen been naar boven en het rechte been naar beneden en selecteer een raster van 600 mesh met de gladde of glanzende kant naar boven. Plaats de tang op een petrischaaltje of een ander verhoogd oppervlak om contact van het schone rooster met andere items te voorkomen.Verwijder het papier van de paraffinefilm en trek aan de zijkanten om een kleine rand te creëren. Pipetteer twee druppels van 150 microliter, dus 4% trehalose-oplossing op ongeveer één tot twee centimeter van een korte kant van de paraffinefilm. De twee druppels moeten ongeveer een centimeter uit elkaar liggen.Giet vervolgens op een aparte bank of op de vloer vloeibare stikstof in een kleine polystyreenschuimcontainer en plaats een kleine cryo-EM-roostercontainer in de vloeibare stikstof. Bedek de polystyreenschuimcontainer met pluisvrije doekjes. Om de koolstoffilm van het mica te laten zweven, gebruikt u dumont 5 tang en raakt u één kant van het mica aan in een lichte hoek naar beneden op een van de druppels trehalose-oplossing.Beweeg de mica naar beneden om de waterspanning langzaam van de koolstoffilm af te laten komen. Laat de mica los zodra de koolstoffilm op het oppervlak van de druppel drijft. Inspecteer de koolstoffilm visueel om te voorkomen dat koolstof wordt gebruikt met schade in de vorm van breuken.Plaats het rooster dat door de anti-capillaire tang wordt vastgehouden in een hoek van 20-30 graden in een trehalosedruppel op een positie ernaast en centreer het raster vervolgens onder de koolstoffilm. Pak de koolstoffilm op, houd het rooster in dezelfde richting en laat het rooster langzaam zakken op het oppervlak van de tweede druppel trehalose zonder de oppervlaktespanning van de druppel te breken. Dit verwijdert onnodige koolstoffilm die mogelijk rond de rand van het rooster naar de ruwe kant is gewikkeld.Draai de anti-capillaire tang en plaats ze op een petrischaaltje met de koolstofzijde van het rooster naar beneden gericht. Pipetteer 1,3 microliter van het monster in de lichte trehalose meniscus bovenop het rooster. Pipetteer vervolgens de oplossing ongeveer 8-10 keer om de trehalose en het monster aan beide zijden van het rooster te mengen en te verdelen.Pipetteer een of meer druppels trehalose-oplossing van 1,7 microliter op de paraffinefilm terwijl u de monstertrehalose-oplossing gedurende één minuut op het rooster incubeert. Draai het raster terug in zijn oorspronkelijke positie met de koolstoffilm naar boven gericht en druk het raster op het submicronfilterpapier met behulp van de anti-capillaire tang. Zodra de oplossing door het filterpapier is geabsorbeerd en de koolstoffilm plat ligt, wacht u drie seconden voordat u het rooster optilt en verticaal op de 1,7 microliter druppel trehalose-oplossing beweegt.Deze stappen kunnen worden herhaald tussen één tot drie herhalingen of meer, afhankelijk van het monster. Dep het raster op de twee stukken filterpapier en til vervolgens het raster van het filterpapier op. Na ongeveer 13 seconden, afhankelijk van de luchtvochtigheid en monsterbuffer, dompelt u het rooster in de vloeibare stikstof in de kleine piepschuimcontainer en plaatst u het in de cryo-EM-rastercontainer of draagt u het rechtstreeks over voor cryo-EM-screening of gegevensverzameling.Een 2D-kristalmonster van humaan leukotrieen C4-synthase onderworpen aan de peel-blot-methode wordt hier getoond. Het gebied links van de pijl werd grotendeels gereduceerd tot enkellaagse 2D-kristallen in een contactgebied tussen de koolstoffilm en de rasterbalk die werd afgepeld en vervolgens verschoven. Het gebied rechts van de pijl werd niet beïnvloed door de peel-blot.De onderste helft van de afbeelding vertegenwoordigt de regio's met grote, meestal enkellaagse fosfolipidenbilagen als gevolg van het aanbrengen van de peel-blot. De bovenste helft bevond zich niet in een contactzone tussen de rasterbalk en de koolstoffilm en bevatte dus complete liposomen met twee fosfolipide bilayers. Het rastervierkant van een raster met 400 mazen toont de voetafdruk van de rasterbalk en de resulterende peel-blotted-gebieden, evenals de regio's die niet in contact waren met een rasterbalk of werden onderworpen aan minder peel-blot-iteraties.Deze beelden toonden de blotting van een EM-raster bereid door de teruginjectie op een submicron filterpapier met behulp van zeer dunne koolstoffilm. De beelden zijn afzonderlijke frames bij het eerste contact met het membraan, 1.000 milliseconden na contact en 2.000 milliseconden na contact. De pijl geeft rastervierkanten aan waar de capillaire druk de koolstoffilm scheurde.Het vermijden van breuken in de koolstoffilm en het combineren van submicron filterpapier met een trehalosedruppel van 1,7 microliter om te zuigen en vervolgens de lagen te scheiden, zijn belangrijke stappen. De peel-blotted monsters worden gebruikt voor cryo-EM-gegevensverzameling met hoge resolutie, gevolgd door beeldverwerking voor de structuurbepaling. De peel-blot maakt gestructureerde bepaling mogelijk van enkellaagse eiwit 2D-kristallen die voorheen te dik waren voor cryo-EM.Bovendien kan het verschillende monsters concentreren in enkele lagen op koolstoffilm.

the-peel-blot-technique-cryo-em-sample-preparation-method-to-separate

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Illustreren we hier hoe u elektron cryotomography (ECT) te gebruiken om de ultrastructuur van bacteriële cellen in near-native staten studie, om "macromoleculaire" (~ 4 nm) resolutie.

Electron Cryotomography van bacteriële cellen

Cryo elektronenmicroscopen, ofwel Scanning (SEM) of Transmission (TEM), worden op grote schaal gebruikt voor de karakterisering van biologische monsters of andere materialen met een hoog watergehalte 1. Een SEM / focused ion beam (FIB) wordt gebruikt om kenmerken van belang in monsters identificeren en extract een dun, elektron-transparante lamellen overbrenging op een cryo-TEM.

Cryo-elektron microscopie Specimen Voorbereiding door middel van een Focused Ion Beam

Hier beschrijven we een procedure voor het bestuderen van bevroren-gebarsten plantweefsels. Bladmonsters die op hoge druk zijn bevroren, worden bevroren-gebarsten en dubbel gecoat, waardoor goed bewaarde bevroren-gehydrateerde monsters ontstaan die worden afgebeeld met behulp van de cryo-scannen electronenmicroscoop op hoge vergroting met minimale stralingsschade.

Het bestuderen van de Supramoleculaire organisatie van Photosynthetic Membranen binnen Freeze-gebroken Leaf Tissues door Cryo-Scanning Electron Microscopy

Een instrument en methoden voor de bereiding van de monster nanoliter middelgrote volumes voor transmissie-elektronenmicroscopie wordt gepresenteerd. Er zijn geen papier-bevlekken stappen vereist, dus het vermijden van de schadelijke gevolgen dat voor eiwitten hebben kan, aanzienlijk verminderen monster verlies en de analyse van eencellige lysate voor visuele proteomics inschakelen.

Verkleinde monstervoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie

Dit protocol beschrijft de cryoAPEX-methode, waarbij een APEX2-gelabeld membraaneiwit kan worden gelokaliseerd door transmissieelektronenmicroscopie binnen een optimaal bewaarde celultrastructuur.

De CryoAPEX-methode voor elektronenmicroscopieanalyse van membraaneiwitlokalisatie binnen ultrastructureel bewaarde cellen

Met behulp van gefocusseerde ionenbundelfrezen om glasvochtlamellen op het rooster te produceren uit bevroren biologische monsters voor cryo-elektronentomografie.

Lamellen bereiden van glasvochtbiologische monsters met behulp van een dual-beam scanning elektronenmicroscoop voor cryo-elektronentomografie

Structuurbepaling van macromoleculaire complexen met behulp van cryoEM is routine geworden voor bepaalde klassen van eiwitten en complexen. Hier wordt deze pijplijn samengevat (monstervoorbereiding, screening, gegevensverzameling en -verwerking) en worden lezers gericht op verdere gedetailleerde bronnen en variabelen die kunnen worden gewijzigd in het geval van meer uitdagende exemplaren.

Cryo-elektronenmicroscopie met enkele deeltjes: van monster tot structuur

Dit manuscript schetst de blot-and-plunge-methode om biologische monsters handmatig te bevriezen voor cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje.

Handmatige Blot-and-Plunge Freezing van biologische monsters voor cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje

Dit protocol presenteert twee technieken om de subcellulaire compartimenten van muizenstaaffotoreceptoren te isoleren voor eiwitanalyse. De eerste methode maakt gebruik van levend retinae en cellulosefilterpapier om de buitenste segmenten van de staaf te scheiden, terwijl de tweede gebruik maakt van gelyofiliseerd netvlies en plakband om de binnenste en buitenste segmentlagen van de staaf weg te pellen.

Twee peelingmethoden voor de isolatie van fotoreceptorcelcompartimenten in het netvlies van de muis voor eiwitanalyse

Deze methode biedt een toegankelijk en flexibel protocol voor de voorbereiding van elektronenmicroscopieroosters (EM) voor in situ cellulaire cryotomografie en correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM).

Monstervoorbereiding voor in situ cryotomografie van zoogdiercellen

Hier beschrijven we een protocol voor het aanbrengen van een enkele monolaag grafeen op elektronenmicroscopieroosters en hoe deze voor te bereiden op gebruik bij cryoEM-structuurbepaling.

Fabricage van monolayer grafeen-gecoate roosters voor cryo-elektronenmicroscopie

Leer de peel-blot-techniek voor cryo-EM-monstervoorbereiding om meervoudige biologische lagen te scheiden. Deze methode vermindert dikte, verhoogt concentratie en verbetert beeldverwerking voor efficiënte dataverzameling.

De Peel-Blot-techniek: een cryo-EM-monstervoorbereidingsmethode om enkele lagen te scheiden van meerlagige of geconcentreerde biologische monsters (Video) | JoVE Journal

De Peel-Blot-techniek: een cryo-EM-monstervoorbereidingsmethode om enkele lagen te scheiden van meerlagige of geconcentreerde biologische monsters

Meer video's verkennen