Snelle optische clearing voor semi-high-throughput analyse van tumorsferoïden

Mijn lab is gespecialiseerd in drie- en vierdimensionale tumormodellering. Tumor sferoïde modellen worden veel gebruikt in de biologie en de ontdekking van geneesmiddelen. Bestaande protocollen voor het verzamelen van gegevens uit deze experimenten zijn echter duur, moeilijk en beperkt.

Dit protocol vereist gemakkelijk toegankelijke chemicaliën en apparatuur en is niet erg arbeidsintensief in vergelijking met de huidige methoden die vergelijkbare resultaten opleveren. Dit protocol is ontwikkeld om relatief eenvoudig te implementeren te zijn voor beginners en robuust voor kleine fouten, omdat veel van de stappen omkeerbaar zijn. Begin met het wegen van 0,5 gram laagsmeltende agarose in een glazen fles.

En voeg 25 milliliter PBS toe. Smelt de agarose door de oplossing gedurende 30 tot 60 seconden in een magnetron te koken met het deksel gesloten en constant te draaien. Weeg negen gram N, N, N'N'Tetrakis (2-hydroxypropyl) ethyleendiamine, 22 gram ureum, 44 gram sucrose, 0,1 gram Triton X-100 en 24,9 gram gedeïoniseerd water.

Verwarm de oplossing in een waterbad van 56 graden Celsius met constante menging. Nadat de kristallen zijn opgelost, laat u de oplossing op kamertemperatuur rusten om de bubbels die tijdens het mengen zijn gevormd, naar het oppervlak te laten stijgen. Genereer sferoïden met behulp van de agarose-overlaymethode die in het tekstmanuscript wordt beschreven.

Snijd de punt van een pipetpunt van een milliliter met behulp van een scalpel om de opening te vergroten. Gebruik de sferoïden met behulp van de pipet uit de putten en breng ze over naar een heldere conische buis van 1,5 milliliter. Meerdere sferoïden van dezelfde omstandigheden kunnen in dezelfde buis worden gecombineerd.

Was de sferoïden twee keer in één milliliter PBS, voeg vervolgens neutrale 4% voorverwarmde paraformaldehyde-oplossing toe en incubeer de sferoïden bij 37 graden Celsius. Verwijder na 20 minuten de paraformaldehyde-oplossing en was de sferoïden tweemaal met één milliliter PBS. Breng vervolgens voor kleuring maximaal 15 sferoïden over in een PCR-buis van 200 microliter met behulp van een pipet.

Permeabiliseer de cellen met behulp van 200 microliter van 0,5% Triton X-100 in PBS. Plaats de PCR-buizen in 50 milliliter, schroef dopbuizen en bedek de buis met aluminiumfolie en incubeer de sferoïden bij kamertemperatuur met milde agitatie. Vervang na twee uur de oplossing door 200 microliter antilichaamverdunningsbuffer en incubeer 's nachts bij kamertemperatuur.

Verwijder de volgende dag de antilichaamverdunningsbuffer voordat u 75 microliter primair antilichaam toevoegt en incubeert bij vier graden Celsius gedurende twee en een halve dag. Verwijder na incubatie het supernatant en was de sferoïden tweemaal met 200 microliter PBS, met 0,1% Tween en 0,1% Triton X-100 of PBS-TT. Incubeer vervolgens met 200 microliter PBS-TT gedurende vier uur bij kamertemperatuur.

Verwijder vervolgens PBS-TT voordat u 100 microliter van het secundaire antilichaam toevoegt en incubeer bij vier graden Celsius gedurende twee en een halve dag. Verwijder na incubatie het supernatant en was tweemaal met PBS-TT, voordat u gedurende vier uur met 200 microliter PBS-TT broedt. Gebruik voor de montage een pipet van 200 microliter, breng vaste en gekleurde sferoïden over op 500 microliter PCR-buizen, bij één buis per toestand.

Vervang de oplossing door 200 microliter 2% vloeibare agarosegel en centrifugeer op de snelle spin, bij de vaste maximale snelheid, bij kamertemperatuur, gedurende 30 seconden. Aspirateer de sferoïden in 50 microliter vloeibare agarose-gel en doseer in de put van een 24-well glazen bodemplaat. Voordat de gel hard wordt, scheidt u de sferoïden met behulp van een pipetpunt in de omringende gel en zorgt u ervoor dat de sferoïden bedekt zijn met gel.

Dompel vervolgens de gel onder door 500 microliter clearingoplossing per put toe te voegen en incubeer bij kamertemperatuur, in het donker, gedurende 24 uur voordat u het in beeld brengt. Kies voor beeldvorming een objectief met een werkafstand die lang genoeg is om de hele sferoïde te omvatten, inclusief de montagehoogte van de sferoïde in het vat. Om het equatoriale vlak te identificeren, past u de focus aan totdat het grootste oppervlak in het XY-vlak is bereikt en maakt u een afbeelding met het vereiste laservermogenspercentage, detectorspanning, versterking en offset-instellingen.

Voor driedimensionale afbeeldingen stelt u het begin en einde van de sferoïden in en kiest u de juiste signaalintensiteit op verschillende Z-diepten, met behulp van Z-intensiteitscorrectie-instellingen. Deze studie toont een vergelijking van gewiste en onduidelijke FUCCI menselijke melanoom sferoïden, vergeleken met PBS gemonteerde sferoïden. De clearingoplossing biedt beelden met een hoge helderheid en minimale vervorming van de grootte.

Clearing-oplossing maakt verder hoge resolutie beeldvorming mogelijk van cellulaire niveaudetails dieper in de sferoïden zonder histologische secties. Met driedimensionale confocale beelden kunnen details op cellulair niveau op een diepte van 200 micron worden verkregen. Verder wordt een vergelijking getoond tussen cryosectioned en cleared hole spheroid, gekleurd voor pimonidazol en p27kip1.

Pimonidazolkleuring toont het hypoxische gebied van de sferoïde, en p27kip1-kleuring, markeert celcyclusstilstand en DAPI-kernvlek. Diepere penetratie en minder verstrooiing, zorgen voor een verbeterde driedimensionale sferoïde structuurrepresentatie met minimaal lichtverlies. De driedimensionale weergave van de FUCCI-sferoïden, gekleurd met DRAQ7, wordt getoond.

Clearingoplossing heeft minimale impact op de grootte van de sferoïde. De diameter van de sferoïde werd gedefinieerd op basis van een bol met dezelfde dwarsdoorsnede als de sferoïde. De sferoïden werden waargenomen om licht in omvang toe te nemen in de eerste zes uur, zoals aangegeven door een diameter vouwverandering van tussen 2% en 6%Daarentegen keerden de sferoïden na 24 tot 72 uur terug naar een grootte die ongeveer gelijk was aan de overeenkomstige grootte in PBS post-paraformaldehyde fixatie.

Het is belangrijk om ten minste 24 uur te wachten voordat u de beeldvorming uitvoert, om de clearingoplossing in evenwicht te laten komen met de sferoïden en de gel. Dit protocol stelt beoefenaars in staat om snel gegevens te verzamelen van grote aantallen sferoïden, waardoor gedetailleerde kwantitatieve wiskundige en statistische analyse mogelijk is die gedetailleerde inzichten in de biologie biedt.