In Vivo Chronische twee-foton beeldvorming van microglia in de hippocampus van de muis

De rol van microglia in de hippocampus is nog niet volledig begrepen. Dit protocol kan direct in beeld brengen hoe microglia in contact komen en neuronen reguleren. In vivo beeldvorming van rustende microglia en neuronen in de hippocampus is erg moeilijk geweest.

Deze methode kan dit probleem oplossen. Om het observatievenster te implanteren, maakt u een cirkelvormige groef van drie millimeter op de schedel met behulp van een dermale pons, waardoor de uitlijning van de groef met het eerder gemarkeerde gebied wordt gewaarborgd. Wanneer de dermale stoot de binnenste laag van de schedel bereikt voordat hij de onderliggende dura raakt, tilt u het centrale boteiland voorzichtig op met behulp van een naald van 30 gauge.

Verwijder vervolgens voorzichtig de dura met behulp van een dura-picker. Zuig de pia, piale vaten en corticale weefsel van het oppervlak af. Houd de diepte van het blootgestelde weefseloppervlak homogeen over het hele schedelvenster en verdiep geleidelijk de aspiratie totdat vezels van de externe capsule worden blootgesteld.

Nadat u de zuigpunt naar de externe capsule in de buurt van de laterale ventrikel aan het rostrolaterale uiteinde van het schedelvenster hebt geplaatst, verwijdert u de oppervlaktelaag van de externe capsule die in de caudomediale naar de rostrolaterale richting loopt. Verwijder vervolgens de binnenste laag die in de middelmatige richting loopt. Bevestig de verwijdering van de gehele uitwendige capsule door de volledige blootstelling van het oppervlak van de alveus en de dorsale hippocampuscommissure te controleren.

Nadat u ervoor hebt gezorgd dat het bloeden volledig is gestopt, vult u het gat met steriele zoutoplossing tot ter hoogte van het schedeloppervlak. Steek vervolgens de metalen buis met glazen bodem verticaal in het gat terwijl u het overtollige water dat overloopt van de zijkanten van de buis aanzuigt totdat de glazen bodem licht tegen de alveus drukt en de onderliggende CA1 gedeeltelijk afvlakt. Bevestig met behulp van het tandharscement de wand van de ingebrachte buis aan de omliggende schedel.

Plaats de muis in het hoofdhoudapparaat onder de objectieflens van de tweefotonenmicroscoop en op de gemotoriseerde XY-scanfase. Vul vervolgens de ruimte tussen de glazen bodem en de objectieflens met water zonder luchtbellen te creëren. Pas de focus aan op CA1 met de begeleiding van fluorescentie die wordt uitgezonden door het hersenparenchym en het gereflecteerde licht van de rand van de metalen buis onder continue verlichting door de gepulseerde laser.

Pas de hoek van de muiskop aan door het hoofdvasthoudapparaat zo te kantelen dat de glazen bodem evenwijdig is aan het beeldvlak. Pas vervolgens de correctiekraag van het objectief aan om de hoogste resolutie te bereiken op een diepte van de doelstructuur in de CA1. Bevestig vervolgens dat de fluorescerende cellen in de moleculaire laag van de gyrus dentate of DG op een diepte van 500 micrometer van de glazen bodem in het hele gezichtsveld worden afgebeeld.

Alleen bij een succesvolle operatie kunnen de DG-signalen direct worden gedetecteerd. Verhoog de postoperatieve muis gedurende enkele weken in individuele behuizing. Plaats de verdoofde muis onder de microscoop met twee fotonen.

Voer de beeldvorming van de hippocampus uit. Bevestig of de kwaliteit en intensiteit van de beelden die zijn vastgelegd na de vermindering van postoperatief oedeem beter of vergelijkbaar zijn met die op de dag van de operatie. Zorg ervoor dat microglia hun vertakte morfologie hebben hersteld.

Voer vervolgens in vivo beeldvorming uit op de interessante laag in de CA1. De microglia in CX3CR1-GFP-muizen die onmiddellijk na de operatie werden gevangen, vertoonden geen prominente activering. Na een succesvolle operatie zonder inductie van oedeem overschreden de beeldvormingsdiepten van twee fotonen de volledige CA1-lagen en bereikten ze 500 micrometer van het chirurgische oppervlak.

De microglia in de chronische fase van meer dan drie weken na de operatie vertoonden een hogere fluorescerende intensiteit en resolutie en een meer homogene verdeling als gevolg van verminderd oedeem en ontsteking. Microglia in alle lagen herstelden al hun vertakte morfologie en vertoonden immobiele cellichamen en zeer modale processen. De hoge resolutie beelden over de gehele CA1 werden gedurende enkele maanden geleverd.

De signalen van fluorescerende microglia helpen bij het identificeren van hippocampuslagen. Microglia in de alveus hadden langwerpige cellichamen en processen die zich uitstrekten langs de axonale kanalen. Microglia in de stratum pyramidale konden worden onderscheiden door de lagere dichtheid van hun processen.

De grens tussen de CA1 en de DG kon worden herkend aan dikke bloedvaten die langs de grens liepen, wat beter werd herkend door vaten te labelen met sulforhodamine 101. Als toepassingsvoorbeeld werden GFP-positieve microglia en tdTomato gelabelde piramidale neuronen tegelijkertijd in beeld gebracht. Neuronale labeling hielp om de exacte laagstructuren van de CA1 te begrijpen.

Het belangrijkste punt is om operatieschade te verminderen. Vermijd weefselschade door aspiratie. Oefen zachte druk uit bij het inbrengen van de glazen bodem en vermijd dat tandcement het hersenoppervlak raakt.

Deze aanpak zal helpen bij het identificeren van de rol van microglia in de hippocampus. Bijvoorbeeld hoe microglia interageren met neuronen, hoe ze betrokken zijn bij het leren en hoe ze hersenziekten beheersen.