Name: In Vivo Chronische twee-foton beeldvorming van microglia in de hippocampus van de muis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-06T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Leer chronische in vivo twee-foton beeldvorming van microglia in de hippocampus van de muis. Deze methode maakt langdurige observatie van microglia-neuroninteracties mogelijk voor neurowetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen M. Kondo en M. Matsuzaki bedanken voor het uitlenen van de XLPLN25XSVMP objectieflens. Dit werk werd financieel ondersteund door de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) door Grant-in-Aid for JSPS Research Fellow (18J21331 tot R.K.) en Grants-in-Aid for Scientific Research (20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895 tot S.O.), van het Japan Agency for Medical Research and Development (JP19gm1310003 en JP17gm5010003 tot S.O.), en van het Japan Science and Technology Agency door Moonshot R&D (JPMJMS2024 tot H.M.).

Alle dierproeven werden goedgekeurd en uitgevoerd volgens het beleid van de Animal Ethics Committee en de Genetic Recombinant Experiment Safety Committee aan de Universiteit van Tokio. Zowel mannelijke als vrouwelijke CX3CR1-GFP-muizen, in de leeftijd van 2-4 maanden, werden gebruikt in de experimenten. Voor de veiligheid van de experimentatoren en het behoud van steriele omstandigheden werden alle procedures uitgevoerd met witte jassen, maskers en steriele handschoenen. Alle instrumenten werden voor gebruik gesteriliseerd.
1. Bereiding van instrumenten en dieren
<ol><li>Monteer een metalen buis met glazen bodem (figuur 1A).<ol><li>Breng een kleine druppel UV-uithardende optische lijm aan op het ene uiteinde van een op maat gemaakte roestvrijstalen buis (buitendiameter 3,0 mm, binnendiameter 2,8 mm, hoogte 1,7 mm). Verdeel de lijm gelijkmatig over de ronde rand van de buis. OPMERKING: Er moet voldoende lijm worden gebruikt om de hele rand van de buis te bedekken.</li>
		<li>Plaats een ronde glazen dekplaat (3,0 mm diameter, 0,15 ± 0,02 mm dikte) op het met lijm bedekte uiteinde van de metalen buis en druk de afdekplaat lichtjes tegen de buis zodat de opening tussen de buis en het glas wordt gevuld met de lijm. Pas vervolgens de positie van het glas aan zodat het binnen de buitenrand van de metalen buis past.</li>
		<li>Bestraal het glas voldoende lang met UV-licht om de lijm uit te harden. OPMERKING: Zorg ervoor dat het glas en de buis volledig zijn bevestigd. Als de hechting onvoldoende is, kan het glas na de operatie loskomen, wat resulteert in mislukte beeldvorming of lekkage van hersenvocht (CSF).</li>
		<li>Desinfecteer de geassembleerde metalen buis met glazen bodem met 70% ethanol en was met steriele zoutoplossing om vuil te verwijderen.</li>
	</ol></li>
	<li>Steriliseer alle chirurgische instrumenten met een droge hittesterilisator.</li>
	<li>Bereid muizen voor op de operatie van raamimplantatie. OPMERKING: Muizen moeten de juiste leeftijd hebben. Het verdient de voorkeur dat ze genetisch gemanipuleerd zijn om fluorescerende eiwitten tot expressie te brengen in de CA1 en de gyrus dentate (DG). Deze punten worden verder toegelicht in het gedeelte Discussie.</li>
</ol>2. Anesthesie en hoofdfixatie
<ol><li>Verdoof een muis door intraperitoneale injectie van ketamine-xylazine (100 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine). Dien meloxicam (2 mg/kg) toe via subcutane injectie voor preoperatieve analgesie. Bevestig het verdwijnen van de reactie op pijnlijke stimuli, zoals staartknijpen om voldoende diepte van de anesthesie te garanderen. Voeg een halve dosis ketamine-xylazine toe telkens wanneer de anesthesie tijdens de operatie verdwijnt, meestal 1 uur na de eerste toediening en elke 30 minuten daarna. Gebruik een verwarmingskussen onder het lichaam om thermische ondersteuning te bieden en breng oogheelkundige zalf aan op de ogen om uitdroging onder anesthesie te voorkomen. OPMERKING: De keuze van anesthesie voor chirurgie is essentieel. Dit punt wordt in detail besproken in de sectie Discussie.</li>
	<li>Breng ontharingscrème aan om het haar van de hoofdhuid te verwijderen. Desinfecteer de hoofdhuid meerdere keren in een cirkelvormige beweging met povidon-jodiumscrub gevolgd door alcohol. Plaats de muis op het chirurgische platform dat is voorbereid met een steriele waterdichte pad en breng steriele gordijnen aan om de chirurgische plaats te beveiligen. Snijd en verwijder vervolgens de hoofdhuid cirkelvormig met een scalpel, zodat de pariëtale en de achterhoofdsbeenderen volledig worden blootgesteld aan de operatieve kant.</li>
	<li>Verwijder het onderhuidse bindweefsel door het in te wrijven met een wattenstaafje terwijl u een steriele zoutoplossing aanbrengt om het bloeden te verhelpen. Schraap voorzichtig het schedeloppervlak met een miniatuurmes met ronde punt om het botvlies te verwijderen, wat helpt om de hechting tussen het cement en het bot te versterken (zie stap 2.6).</li>
	<li>Breng tandetsmateriaal aan op het hele oppervlak, wacht tientallen seconden en spoel af met voldoende steriele zoutoplossing.</li>
	<li>Markeer met waterdichte inkt het gebied van het bot dat moet worden verwijderd (een cirkelvormig gebied met een diameter van 3,0 mm, ongeveer 2,5 mm achter en 2,5 mm lateraal ten opzichte van de bregma). Droog na het markeren het schedeloppervlak grondig af. OPMERKING: De positie van craniotomie hangt af van de grootte van de hippocampus en moet worden geoptimaliseerd voor verschillende leeftijden. Nuttige indicatoren voor de positie van craniotomie worden hieronder weergegeven (zie stap 3.4.5, OPMERKING).</li>
	<li>Bevestig de rechthoekige aluminiumplaat met een dikte van 1,0 mm en met een gat met een diameter van 5,0 mm in het midden aan de schedel met behulp van tandharscement volgens de instructies van de fabrikant.<ol><li>Lijn het gat in het midden van de plaat voorzichtig uit met het cirkelvormige gebied gemarkeerd met een pen (zie stap 2.5), zodat de aluminiumplaat evenwijdig is aan het gemarkeerde oppervlak van de schedel (figuur 1B). Zorg ervoor dat het cement alle openingen tussen de plaat en het bot goed afdicht. Wacht ongeveer 5 minuten tot het cement voldoende is uitgehard.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaats de muis op het hoofdbevestigingsapparaat met hoekregelaars via de bevestigde plaat.</li>
</ol>3. Implantatie van het observatievenster
OPMERKING: De volgende chirurgische ingrepen moeten worden uitgevoerd onder een stereomicroscoop.
<ol><li>Maak een cirkelvormige groef op de schedel met behulp van een dermale pons met een diameter van 3,0 mm. Lijn de cirkelvormige groef en het gebied gemarkeerd met een pen uit in stap 2.5. Draai de dermale pons met zachte druk zodat de groefdiepte geleidelijk toeneemt. Controleer regelmatig of de groefdiepte constant is over de gehele omtrek.</li>
	<li>Wanneer de dermale stoot de binnenste laag van de schedel bereikt, voordat u de onderliggende dura raakt, tilt u het centrale boteiland voorzichtig op met een naald van 30 G. OPMERKING: Lichte vloeistoflekkage van de onderkant van de groef geeft aan dat de groef dicht bij de dura ligt.</li>
	<li>Verwijder de dura met een dura picker. OPMERKING: Volledige verwijdering van de dura in het schedelvenster is noodzakelijk en vereist een zorgvuldige resectie van de resterende dura aan de periferie met behulp van een fijne tang.</li>
	<li>Zuig het weefsel voorzichtig op om de alveus van de hippocampus bloot te leggen door 23 G of 25 G stompe naalden verbonden met de aspirator. OPMERKING: Deze stap is het meest cruciaal voor succesvolle beeldvorming. De belangrijkste technische punten voor de weefselaspiratie worden in detail beschreven in de sectie Discussie.<ol><li>Zuig de pia en de pial vaten op.</li>
		<li>Zuig het corticale weefsel van het oppervlak af. Houd de diepte van het blootgestelde weefseloppervlak homogeen over het hele schedelvenster. Verdiep geleidelijk de aspiratie totdat vezels van de externe capsule worden blootgesteld.</li>
		<li>Plaats de zuigpunt voorzichtig naar de externe capsule in de buurt van de laterale ventrikel (LV) aan het rostrolaterale uiteinde van het schedelvenster. Verwijder de oppervlaktelaag van de externe capsule die in de caudomediale naar rostrolaterale richting loopt en vervolgens de binnenste laag die in de mediolaterale richting loopt. OPMERKING: De externe capsule in de buurt van de LV kan gemakkelijk uit de onderliggende structuur worden verwijderd.</li>
		<li>Bevestig de verwijdering van de gehele uitwendige capsule door de volledige blootstelling van het oppervlak van de alveus en de dorsale hippocampale commissure (DHC) te controleren. OPMERKING: De DHC dekt het caudomediale deel van de CA1. De alveus en de DHC kunnen worden onderscheiden van de externe capsule door hun vezeloriëntaties. De vezels in de alveus en de DHC lopen namelijk in de rostromediale tot caudolaterale richting en kunnen worden onderscheiden van de vezels in de externe capsule. De alveus en de DHC zitten stevig vast aan de CA1 en mogen niet beschadigd raken. Alle fragmenten van de externe capsule moeten worden verwijderd, omdat alle resterende fragmenten het directe contact van de glazen afdekplaat met de alveus zullen voorkomen.</li>
		<li>Bevestig dat het bloeden grondig is gestopt en vul het gat met steriele zoutoplossing tot het niveau van het schedeloppervlak. OPMERKING: Het gezichtsveld hier helpt om te beoordelen of het gat zich in de juiste positie bevindt voor de specifieke leeftijd van de muis. Idealiter zouden de longblaas en de onderliggende CA1 het grootste deel van het centrale gebied moeten bezetten. Een deel van het DHC is zichtbaar in het caudomediale gebied. De opening van LV is waarneembaar aan de rostrolaterale rand (figuur 3A).</li>
	</ol></li>
	<li>Steek de metalen buis met glazen bodem (zie stap 1.1) verticaal in het gat terwijl u het overtollige water dat van de zijkanten van de buis overstroomt, aanzuigt totdat de glazen bodem lichtjes tegen de alveus drukt en de onderliggende CA1 gedeeltelijk afvlakt. OPMERKING: Deze druk moet op de juiste manier worden aangepast. Als het te sterk is, wordt de CA1 beschadigd. Als het te zwak is, zal de bolvormige aberratie als gevolg van de kromming van de CA1 de beeldresolutie in diepe structuren verminderen.</li>
	<li>Bevestig met behulp van tandharscement de wand van de ingebrachte buis aan de omliggende schedel (figuur 1C). Zorg ervoor dat de gehele omtrek goed is afgesloten en dat er geen lekkage van lucht of liquor is. Wacht ongeveer 5 minuten tot het cement is uitgehard. OPMERKING: Als het cement wordt geplaatst wanneer de viscositeit laag is, kan het in het hersenparenchym lekken door de opening tussen de buis en de schedel en de hersenen beschadigen. Daarom moet het cement worden aangebracht na polymerisatie-initiatie, wat de viscositeit verhoogt en lekkage door de opening vermindert.</li>
	<li>Was de hele plaat, de schedel en de binnenkant van de buis met steriele zoutoplossing om vuil te verwijderen.</li>
</ol>4. Twee-foton microscopie onmiddellijk na de operatie voor kwaliteitscontrole van de operatie
<ol><li>Plaats de muis in het apparaat dat het hoofd vasthoudt onder de objectieflens van de tweefotonenmicroscoop en op de gemotoriseerde XY-scanfase. Gebruik een verwarmingskussen voor thermische ondersteuning. Controleer en pas de diepte van de anesthesie aan zoals beschreven in stap 2.1, omdat deze kwaliteitscontrole tot 30 minuten kan duren. OPMERKING: De objectief met waterdompeling met een werkafstand (WD) langer dan 3 mm en een hoog numeriek diafragma (NA) wordt aanbevolen. Een correctiekraag van de objectieflens kan de resolutie verbeteren door de refractieindexmismatch tussen het glas en de biomaterialen te compenseren.</li>
	<li>Vul de ruimte tussen het glas en de objectieflens met water en let er vooral op dat luchtbellen worden vermeden. Breid indien nodig het gebied van de metalen plaat uit met behulp van een plastic folie, die meer water vasthoudt, om de hele frontlens van het objectief te bedekken.</li>
	<li>Schakel een femtoseconde gepulste laser van 920 nm golflengte in voor de excitatie van de fluorescerende sondes die in de hersenen worden uitgedrukt en start beeldacquisitiesoftware.</li>
	<li>Pas de scherpstelling aan de CA1 aan met behulp van de gemotoriseerde trap en het gemotoriseerde scherpstelsysteem. Plaats de doelstructuur met de geleiding van de fluorescentie die wordt uitgezonden door het hersenparenchym en het gereflecteerde licht van de rand van de metalen buis onder continue verlichting door de gepulseerde laser.</li>
	<li>Meet de diepten van het hersenparenchym dat de glazen bodem raakt door de focus aan te passen met het gemotoriseerde focussysteem. Vergelijk de diepten op verschillende horizontale locaties om de uitlijning van de glazen bodem en het beeldvlak te beoordelen.<ol><li>Pas de hoek van de muiskop aan door het hoofdbevestigingsapparaat te kantelen totdat de glazen bodem evenwijdig aan het beeldvlak is ingesteld.</li>
	</ol></li>
	<li>Pas de correctiekraag van het objectief aan om de hoogste resolutie te bereiken op de diepte van de doelstructuur in de CA1.</li>
	<li>Bevestig dat de fluorescerende cellen in de moleculaire laag (ML) van het DG-bovenblad op een diepte van 500 μm van de glazen bodem in het hele gezichtsveld kunnen worden afgebeeld. OPMERKING: Deze stap is belangrijk bij het beoordelen van de kwaliteit van de operatie. Als de CA1 beschadigd is, voorkomt focale hersenoedeem fluorescentiedetectie op een diepte van meer dan 200 μm van het oppervlak. Alleen wanneer er geen schade is aan de CA1 en de kromming van de CA1-lagen goed wordt afgevlakt door de bovenliggende deklaag, kunnen de DG-signalen direct na de operatie worden gedetecteerd (figuur 2A-D). De sectie Representatieve resultaten biedt een eenvoudige manier om de grens tussen de CA1 en de DG te bepalen.</li>
</ol>5. Postoperatieve zorg
<ol><li>Zuig het water in de buis op en bedek het met een plastic afdichting om te voorkomen dat vuil binnendringt.</li>
	<li>Houd de muis warm en wacht op herstel van de anesthesie.</li>
	<li>Dien meloxicam (2 mg/kg) subcutaan toe om de 24 uur zolang de muis pijngerelateerd gedrag vertoont.</li>
	<li>Verhoog de postoperatieve muis gedurende enkele weken in individuele behuizing.</li>
</ol>6. In vivo chronische twee-foton beeldvorming van microglia met behulp van CX3CR1-GFP muizen
<ol><li>Na inductie van anesthesie, was de binnenkant van de metalen buis met steriele zoutoplossing om vuil te verwijderen. Zorg ervoor dat de witte alveus van de hippocampus zichtbaar is door het glas (figuur 3A) en dat er geen complicaties zijn zoals postoperatieve bloedingen.</li>
	<li>Plaats de muis onder de microscoop met twee fotonen volgens de stappen 4.1 tot en met 4.6.</li>
	<li>Controleer de kwaliteit en intensiteit van beelden verkregen door twee-foton excitatie van de hippocampus (figuur 3B). Zorg ervoor dat de beelden die zijn gemaakt na de vermindering van postoperatief oedeem vergelijkbaar zijn met of beter zijn dan die genomen op de dag van de operatie (figuur 2A, zie stap 4.5). OPMERKING: Beeldverslechtering duidt op de aanwezigheid van weefselbeschadiging in de hersenen.</li>
	<li>Zorg ervoor dat microglia hun vertakte morfologie al hebben hersteld (figuur 3C). OPMERKING: De beeldvormingsgegevens van microglia geven aan dat microglia ten minste 3-4 weken nodig hebben om microglia terug te brengen naar hun basale toestand.</li>
	<li>Voer in vivo beeldvorming uit in alle lagen van de CA1 voor het specifieke doel van het experiment.</li>
</ol>

<ol><li>Wolf, S. A., Boddeke, H. W. G. M., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Microglia in physiology and disease.</a> Annual Review of Physiology. 79, 619-643 (2017).</li>
<li>Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+actively+surveying+and+shaping+neuronal+circuit+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Microglia: actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function.</a> Trends in Neurosciences. 36 (4), 209-217 (2012).</li>
<li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+dynamic+mediators+of+synapse+development+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia: dynamic mediators of synapse development and plasticity.</a> Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).</li>
<li>Nakayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+permit+climbing+fiber+elimination+by+promoting+GABAergic+inhibition+in+the+developing+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Microglia permit climbing fiber elimination by promoting GABAergic inhibition in the developing cerebellum.</a> Nature Communications. 9 (1), 2830(2018).</li>
<li>Iida, T., Tanaka, S., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+impact+of+microglial+distribution+on+dynamics+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial impact of microglial distribution on dynamics of dendritic spines.</a> The European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1400-1417 (2019).</li>
<li>Kettenmann, H., Hanisch, U., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Physiology of microglia.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 461-553 (2011).</li>
<li>Kondo, S., Kohsaka, S., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+changes+of+spine+dynamics+and+microglia+after+transient+peripheral+immune+response+triggered+by+LPS+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Long-term changes of spine dynamics and microglia after transient peripheral immune response triggered by LPS in vivo.</a> Molecular Brain. 4 (1), 27(2011).</li>
<li>Benninger, R. K. P., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+excitation+microscopy+for+the+study+of+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 59 (1), 4-11 (2013).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).</li>
<li>Tremblay, M., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+interactions+with+synapses+are+modulated+by+visual+experience%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience.</a> PLoS Biology. 8 (11), 1000527(2010).</li>
<li>Miyamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+contact+induces+synapse+formation+in+developing+somatosensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Microglia contact induces synapse formation in developing somatosensory cortex.</a> Nature Communications. 7, 12540(2016).</li>
<li>Akiyoshi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+enhance+synapse+activity+to+promote+local+network+synchronization%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Microglia enhance synapse activity to promote local network synchronization.</a> eNeuro. 5 (5), 0088(2018).</li>
<li>Favuzzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA-receptive+microglia+selectively+sculpt+developing+inhibitory+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">GABA-receptive microglia selectively sculpt developing inhibitory circuits.</a> Cell. 184 (15), 4048-4063 (2021).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).</li>
<li>Isshiki, M., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cranial+window+types+for+in+vivo+two-photon+imaging+of+brain+microstructures%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cranial window types for in vivo two-photon imaging of brain microstructures.</a> Microscopy. 63 (1), 53-63 (2014).</li>
<li>Grabert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+brain+region-dependent+diversity+and+selective+regional+sensitivities+to+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging.</a> Nature Neuroscience. 19 (3), 504-516 (2016).</li>
<li>De Biase, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+cues+establish+and+maintain+region-specific+phenotypes+of+basal+ganglia+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Local cues establish and maintain region-specific phenotypes of basal ganglia microglia.</a> Neuron. 95 (2), 341-356 (2017).</li>
<li>Ayata, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+brain+region-specific+microglia+clearance+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of brain region-specific microglia clearance activity.</a> Nature Neuroscience. 21 (8), 1049-1060 (2018).</li>
<li>Böttcher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microglia+regional+heterogeneity+and+phenotypes+determined+by+multiplexed+single-cell+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Human microglia regional heterogeneity and phenotypes determined by multiplexed single-cell mass cytometry.</a> Nature Neuroscience. 22 (1), 78-90 (2019).</li>
<li>Masuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+heterogeneity+of+mouse+and+human+microglia+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal heterogeneity of mouse and human microglia at single-cell resolution.</a> Nature. 566 (7744), 388-392 (2019).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+mediate+forgetting+via+complement-dependent+synaptic+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microglia mediate forgetting via complement-dependent synaptic elimination.</a> Science. 367 (6478), 688-694 (2020).</li>
<li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fractalkine+receptor+CX3CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of fractalkine receptor CX3CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).</li>
<li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+dendritic+spines+in+the+hippocampus+reveals+structural+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of dendritic spines in the hippocampus reveals structural plasticity.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (42), 13948-13953 (2014).</li>
<li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li>
<li>Schmid, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+of+somatostatin-positive+interneurons+associated+with+memory+deficits+in+an+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dysfunction of somatostatin-positive interneurons associated with memory deficits in an Alzheimer's disease model.</a> Neuron. 92 (1), 114-125 (2016).</li>
<li>Barretto, R. P., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescence+imaging+with+high-resolution+microlenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses.</a> Nature Methods. 6 (7), 511-512 (2009).</li>
<li>Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impermanence+of+dendritic+spines+in+live+adult+CA1+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus.</a> Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).</li>
<li>Sheffield, M. E. J., Dombeck, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+transient+prevalence+across+the+dendritic+arbour+predicts+place+field+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium transient prevalence across the dendritic arbour predicts place field properties.</a> Nature. 517 (7533), 200-204 (2015).</li>
<li>Attardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+consolidation+of+ensemble+neural+plasticity+patterns+in+hippocampal+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term consolidation of ensemble neural plasticity patterns in hippocampal area CA1.</a> Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).</li>
<li>Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septo-hippocampal+GABAergic+signaling+across+multiple+modalities+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice.</a> Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).</li>
<li>Lovett-Barron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+inhibition+in+the+hippocampus+supports+fear+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning.</a> Science. 343 (6173), 857-863 (2014).</li>
<li>Hainmueller, T., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+emergence+of+stable+and+dynamic+memory+engrams+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus.</a> Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).</li>
<li>Parkhurst, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+learning-dependent+synapse+formation+through+brain-derived+neurotrophic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor.</a> Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).</li>
<li>Merlini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+Gi-dependent+dynamics+regulate+brain+network+hyperexcitability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability.</a> Nature Neuroscience. 24 (1), 19-23 (2021).</li>
<li>Sarlus, H., Heneka, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Microglia in Alzheimer's disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3240-3249 (2017).</li>
<li>Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglia in Alzheimer's disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2018).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
</ol>

Geen van de auteurs heeft belangenconflicten.

Deze methode bevat uitgebreide chirurgische procedures, maar kan beelden met een hoge resolutie over de gehele CA1 voor een langere periode opleveren als deze goed wordt voorbereid. Experimenten met verschillende muizen bevestigden dat de beeldkwaliteit in de chronische postoperatieve fase beter is dan die van acute postoperatieve beeldvorming. De betere beeldkwaliteit bleef langer dan 2 maanden behouden. De meest voorkomende oorzaak van falen is onbedoelde schade aan de CA1 tijdens de operatie, die wordt geïdentificeerd in de postoperatieve kwaliteitscontrole (zie stap 4). Dit kan te wijten zijn aan direct letsel door aspiratie, uitdroging van de hersenen, overmatige druk door het glas of toxiciteit van het tandcement in de laatste stap. Een andere oorzaak van falen is postoperatieve bloeding, die binnen 1 week na de operatie kan worden bevestigd door het venster met glazen bodem (zie stap 6.1). Lees het protocol zorgvuldig door en neem alle voorzorgsmaatregelen om dergelijke problemen te voorkomen.
Zelfs met de huidige opstelling van twee-fotonenmicroscoop met GaAsP-detectoren in het laboratorium, resulteert de poging om de dorsale CA1 door de cortex in beeld te brengen in een aanzienlijk verlies van resolutie als gevolg van de niet-verwaarloosbare verstrooiing van licht. Daarom, om voldoende resolutie te verkrijgen om de beweging van microgliale processen of de vorming van dendritische stekels van neuronen in de CA1 te observeren, is het verwijderen van een deel van de bovenliggende cortex onvermijdelijk, zoals bij de huidige methode. De enige alternatieve manier om de mate van corticale verwijdering te verminderen met behoud van een hoge beeldresolutie is het insluiten van een relaislens, zoals een gradient refractive index (GRIN) lens. In deze benadering is een GRIN-lens geplaatst in een geleidebuis die direct boven de CA1 is geïmplanteerd voor chronische CA1-beeldvorming28,29. De buitendiameter van de geleidingsbuis was 1,8 mm, wat kleiner is dan de 3,0 mm van het apparaat in dit papier, terwijl een hoge resolutie (NA; 0,82) werd geproduceerd die vergelijkbaar is met het systeem hier (effectief NA; 0,88). De benadering met behulp van een GRIN-lens heeft echter een smal gezichtsveld voor observatie met hoge resolutie en een korte beelddiepte die wordt beperkt door de WD van de GRIN-lens. Daarom is het in beeld brengen van alle hippocampuslagen in een breed gezichtsveld met hoge resolutie een specifiek voordeel van de methode in dit artikel.
Een beperking van deze procedure is dat de gedeeltelijke verwijdering van de cortex en ontsteking enkele nadelige effecten op de hippocampus kan hebben. Omdat de verwijderde cortex echter geen directe input heeft voor de hippocampus, de entorhinale cortex niet is beschadigd en de hippocampus zelf niet direct gewond is, is de algemene evaluatie dat de functionele beperking van de hippocampus niet significant is. Verschillende eerdere studies hebben bevestigd dat hippocampusfuncties, waaronder leren en geheugen, behouden blijven na hippocampale raamimplantatie 25,26,27,30,31,32,33,34. Daarom wordt van de hier beschreven beeldvormende benadering verwacht dat deze na een voldoende postoperatieve periode de hippocampusfuncties getrouw rapporteert.
Toekomstige richtingen van proefpersonen op basis van deze beeldvormingstechniek kunnen synaptisch snoeien omvatten dat wordt gedetecteerd door gelijktijdige beeldvorming van microglia en neuronen5, leergerelateerde microgliale interactie met synapsen35, microgliale motiliteit gereguleerd door de neurale activiteit van de hippocampus36 en microgliale reacties op perifere ontsteking of weefselbeschadiging7. Deze methode zal ook helpen bij het ophelderen van de progressie van neurodegeneratieve ziekten. Bij de ziekte van Alzheimer (AD) hopen amyloïde β en tau-eiwitten zich bijvoorbeeld parallel op met neuronale celdood en hippocampusatrofie, wat leidt tot cognitieve disfunctie; Microglia zijn naar verluidt betrokken bij dit proces37,38. In vivo chronische beeldvorming van microglia en neuronen met behulp van de AD-muismodellen zal ons in staat stellen om de correlatie tussen microgliale functies en neuronale pathologie in de hippocampus van de AD-muismodellen te volgen.
Dit artikel richt zich op microgliale beeldvorming, maar dezelfde beeldvormingsprocedure is van toepassing op de andere neuronale en gliale celtypen in de CA1. Daarnaast is het protocol beperkt tot het beeldvorming van verdoofde muizen, maar de techniek kan ook worden uitgebreid naar het monitoren van hippocampusmicroglia bij wakkere muizen. De bewegingsartefacten geïnduceerd door ademhaling, hartslagen en lichaamsbewegingen, vooral in de diepe hippocampuslagen weg van het glazen venster, kunnen bestaan in experimenten met wakkere muizen. Daarom kan een geschikt bewegingscorrectiesysteem nodig zijn om microgliale morfologie en dynamiek vast te leggen.
Discussie in verband met het protocol Het is raadzaam om muizen van de juiste leeftijd en genetische modificaties te selecteren voor de expressie van fluorescerende sondes met temporele en ruimtelijke specificiteit (zie stap 1.3). Muizen op de leeftijd van 1 maand kunnen worden gebruikt voor experimenten, maar muizen ouder dan 2 maanden zijn gemakkelijker te hanteren, met hun grotere lichaamsgrootte en weerstand tegen chirurgische stress. Bovendien zijn de externe capsule en de alveus van de hippocampus moeilijker te scheiden bij jongere muizen. Daarom vereist het verwijderen van de externe capsule bij jonge muizen chirurgische vaardigheden (zie stappen 3.4.3-4). De beoordeling van de operatie en de daaropvolgende beeldvorming zal eenvoudiger zijn met muizen die fluorescerende eiwitten reproduceerbaar en uniform tot expressie brengen in de CA1 en de DG (zie stap 4.7). Daarom is het in de eerste proeven van de operatie raadzaam om transgene muizen te gebruiken met schaars gelabelde neuronen, zoals Thy1-YFP- of Thy1-GFP-muizen39, of muizen met gelabelde microglia, zoals CX3CR1-GFP-muizen24.
Voor een succesvolle operatie is de keuze van de anesthesie belangrijk (zie stap 2.1). Verschillende soorten anesthesie kunnen verschillende graden van intraoperatief hersenoedeem veroorzaken, die van invloed zijn op de moeilijkheid van de operatie, de relatieve positie van de geïmplanteerde metalen buis en de mate van hersencompressie door het glazen venster. Deze factoren kunnen ook de overleving van hippocampusneuronen na een operatie beïnvloeden.
In het aspiratieproces om de hippocampus bloot te leggen (zie stap 3.4), moeten de volgende punten worden opgemerkt om de schade aan de hersenen te minimaliseren en een succesvolle beeldvorming te garanderen. Breng constant steriele zoutoplossing op het weefseloppervlak door een uitlaat aan de zijkant van het schedelvenster te plaatsen. Voorkom dat het weefseloppervlak tijdens aspiratie aan lucht wordt blootgesteld. Het basisprincipe van weefselaspiratie is het verwijderen van het weefseloppervlak door een vloeistofstroom in de zuigpunt. Direct contact van de zuigpunt met het weefsel moet worden vermeden. Stel de negatieve druk op de zuigbuis zo in dat deze minimaal is. Zuig het weefsel stap voor stap op en bevestig dat het bloeden in elke stap onder controle is. Wanneer het bloeden langdurig is, wacht dan tot het bloeden spontaan stopt. Houd aspiratie op korte afstand van de bloedende plek met een constante stroom van steriele zoutoplossing. Zuig het weefsel op om een cilindrische ruimte te creëren waarvan de grootte past bij de metalen buis met glazen bodem (zie stap 1.1). Kies 23 G-naalden om dikke piale vaten of grote weefselfragmenten op te zuigen en 25 G-naalden om klein weefselafval te zuigen.

Microglia zijn de enige immuuncellen en weefselmacrofagen die zich in de hersenen bevinden. Naast hun functies als immuuncellen, zoals snelle reactie op ontstekingen, is aangetoond dat ze een verscheidenheid aan fysiologische rollen spelen bij het onderhoud en de remodellering van neurale circuits, zoals synaptisch snoeien, regulatie van synaptische plasticiteit en controle van neuronale activiteit 1,2,3,4,5 . Fysiologische interacties tussen microglia en neuronen zijn van toenemend belang in zowel de ontwikkeling van neurale circuits als de neurobiologie van de ziekte. Het analyseren van de fysiologie van microglia in vivo vereist methoden om microglia te observeren zonder weefselbeschadiging en ontstekingsreacties. Microglia zijn echter gevoelig voor ontstekingen en veranderen hun vormen en functies drastisch als reactie op weefselbeschadiging 6,7.
In vivo beeldvorming met twee fotonen is een ideaal hulpmiddel voor het vastleggen van de fysiologische dynamiek van microglia8. De eerste toepassingen van in vivo beeldvorming met twee fotonen onthulden de dynamische beweging van microgliale processen voor omgevingssurveillance in de cortex van volwassen muizen 9,10. De volgende twee-foton beeldvormingsstudies breidden de in vivo monitoring van microglia verder uit voor de analyse van functionele en structurele interacties met neuronen 5,11,12,13,14. De beelddiepte van conventionele twee-fotonenmicroscopie is echter beperkt tot minder dan 1 mm van het hersenoppervlak15,16. Deze beperking verklaart de schaarste van eerdere studies die het gedrag van microglia in diepe hersengebieden, zoals de hippocampus, rapporteerden.
Recente RNA-sequencingstudies hebben een aanzienlijke regionale heterogeniteit van microglia aangetoond, waardoor de mogelijkheid van verschillende functionele rollen 17,18,19,20,21 is toegenomen. Daarom is het noodzakelijk om microgliale interacties met neuronen in verschillende hersengebieden vast te leggen, maar technische problemen hebben dergelijke studies belemmerd. In het bijzonder is gemeld dat microgliale actieve betrokkenheid bij synapsremodellering van cruciaal belang is bij de ontwikkeling van het hippocampusneurale netwerk en zijn geheugengerelateerde functies22,23. Er zijn echter geen effectieve methoden beschikbaar voor het observeren van onbetwiste hippocampusmicroglia in vivo.
Dit protocol verklaart de procedures voor de chronische in vivo observatie van rustende microglia in de CA1 van de dorsale hippocampus met behulp van nauwkeurig gecontroleerde chirurgische technieken. Beeldvorming met twee fotonen van het CA1-gebied in CX3CR1-GFP-muizen (CX3CR1+/GFP), die GFP tot expressie brengen in microglia24, maakte observatie van de vertakte microglia in alle lagen van de CA1 met voldoende resolutie mogelijk. Het protocol bevat verschillende tips voor een succesvolle implantatie van het observatievenster en geschikte beeldvormingsomstandigheden. Daarnaast wordt gelijktijdige visualisatie van piramidale neuronen en microglia in de CA1 gepresenteerd als een toepassingsvoorbeeld. De voordelen, beperkingen en mogelijkheden van deze techniek worden ook besproken.

<table><tbody><tr><td>23 G blunt needles</td><td>NIPRO</td><td>02-166</td><td>Suctieptips voor aspiratie.</td></tr><tr><td>25 G blunt needles</td><td>NIPRO</td><td>02-167</td><td>Suctieptips voor aspiratie.</td></tr><tr><td>3 mm dermal punches (DermaPunch)</td><td>Maruho</td><td>213001610</td><td>Gereedschappen voor craniotomie.</td></tr><tr><td>30 G needles</td><td>Dentronics</td><td>Disposable needle No. 30</td><td>Gereedschappen voor craniotomie.</td></tr><tr><td>A femtosecond pulsed laser</td><td>Spectra-Physics</td><td>MaiTai Deep See</td><td>Een Ti:Saffierlaser gebruikt bij 920 nm golflengte.</td></tr><tr><td>A two-photon microscope</td><td>Nikon</td><td>A1R MP+</td><td>Microscoop voor CA1 beeldvorming.</td></tr><tr><td>AAV1-CAG-FLEX-tdTomato</td><td>Penn Vector Core</td><td></td><td>AAV voor neuronale labeling.</td></tr><tr><td>AAV1-hSyn-Cre</td><td>Penn Vector Core</td><td></td><td>AAV voor neuronale labeling.</td></tr><tr><td>An objective lens for two-photon imaging</td><td>Olympus</td><td>XLPLN25XSVMP</td><td>25&times; objectief met een lange werkafstand, een hoge numerieke opening en een correctiekraag</td></tr><tr><td>Aspirators</td><td>Shin-ei Industries</td><td>KS-500</td><td>Gereedschappen voor aspiratie.</td></tr><tr><td>Aluminum plates</td><td>Narishige</td><td>CP-1</td><td>Platen gemaakt van aluminium voor hoofdfixatie.</td></tr><tr><td>Chemical depilatory cream</td><td>YANAGIYA</td><td></td><td>Crème voor haarverwijdering rond de chirurgische plaats.</td></tr><tr><td>Circular glass coverslips</td><td>Matsunami Glass</td><td>3&phi; No.1</td><td>Dekglasjes gebonden aan roestvrijstalen buizen.</td></tr><tr><td>CX3CR1-GFP mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>008451</td><td>Transgene muizen voor microglia-beeldvorming.</td></tr><tr><td>Cylindrical stainless steel tubes</td><td>MORISHITA</td><td>Custom-made</td><td>Metalen buizen om te worden geïmplanteerd. Buitendiameter 3,0 mm, binnendiameter 2,8 mm, hoogte 1,7 mm.</td></tr><tr><td>Dental etching material</td><td>Sun Medical</td><td>204610461</td><td>Wordt gebruikt om de schedelbeenderen te etten.</td></tr><tr><td>Dental resin cement (Super-Bond C&amp;B)</td><td>Sun Medical</td><td>204610555</td><td>Tandcement.</td></tr><tr><td>Dura pickers (Micro Points)</td><td>Fine Science Tools</td><td>10063-15</td><td>Gereedschappen voor dura-verwijdering.</td></tr><tr><td>Fine forceps (Dumont #5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Chirurgische instrumenten.</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Bio Research Center</td><td>PRI13-3374</td><td>Wordt gebruikt om de chirurgische plaats te desinfecteren.</td></tr><tr><td>Head holding device</td><td>Narishige</td><td>MAG-2</td><td>Het hoofdhoudingsapparaat van muizen met hoekverstellers</td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>Bio Research Center</td><td>BWT-100A en HB-10</td><td>Gereedschappen om thermische ondersteuning te bieden voor de muis tijdens de operatie.</td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>ALA Scientific</td><td>HEATINGPAD-1 en Hot-1</td><td>Gereedschappen om thermische ondersteuning te bieden voor de muis op het hoofdhoudingsapparaat.</td></tr><tr><td>Ketamine (Ketalar)</td><td>Daiichi Sankyo Company</td><td>S9-001665</td><td>Anesthesie tijdens de operatie.</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>M1959</td><td>Analgesie tijdens de operatie.</td></tr><tr><td>Ophthalmic ointment</td><td>Sato Pharmaceutical</td><td></td><td>Wordt gebruikt om oogdroogheid tijdens de operatie te voorkomen.</td></tr><tr><td>Povidone-iodine scrub solution</td><td>Meiji Seika Pharma</td><td>2612701Q1137</td><td>Wordt gebruikt om de chirurgische plaats te desinfecteren.</td></tr><tr><td>Round-tipped miniature knives</td><td>Surgistar</td><td>4769</td><td>Chirurgische instrumenten.</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>MURANAKA MEDICAL INSTRUMENTS</td><td>450-098-67</td><td>Weggeefbaar chirurgisch gereedschap.</td></tr><tr><td>Stereo microscopes</td><td>Leica Microsystems</td><td>S8 APO</td><td>Microscopen voor chirurgie.</td></tr><tr><td>Sterile saline</td><td>Otsuka Pharmaceutical Factory</td><td>3311401A2026</td><td>Wasoplossing tijdens de operatie.</td></tr><tr><td>Sterile waterproof pad</td><td>AS ONE</td><td>8-5945-01</td><td>Chirurgische platform.</td></tr><tr><td>Sulforhodamine 101</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7635</td><td>Een kleurstof voor in vivo beeldvorming van bloedvaten.</td></tr><tr><td>Surgical drape</td><td>Medline Industries</td><td>MP-0606F6T</td><td>Geperforeerde drape voor chirurgie.</td></tr><tr><td>UV light</td><td>Toshiba</td><td>GL15</td><td>Wordt gebruikt om de lijmen uit te harden.</td></tr><tr><td>UV-curing optical adhesives</td><td>Thorlabs</td><td>NOA81</td><td>Lijm voor het verlijmen van dekglasjes aan roestvrijstalen buizen.</td></tr><tr><td>Xylazine (Celactal 2%)</td><td>Bayer</td><td></td><td>Anesthesie tijdens de operatie.</td></tr></tbody></table>

in vivo chronische twee-foton beeldvorming van microglia in de hippocampus van de muis

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Microglia, de enige immuuncellen die in de hersenen wonen, nemen actief deel aan het onderhoud van neurale circuits door synapsen en neuronale prikkelbaarheid te wijzigen. Recente studies hebben de differentiële genexpressie en functionele heterogeniteit van microglia in verschillende hersengebieden aangetoond. De unieke functies van het hippocampale neurale netwerk in leren en geheugen kunnen worden geassocieerd met de actieve rollen van microglia in synapsremodellering. Ontstekingsreacties geïnduceerd door chirurgische procedures zijn echter problematisch geweest in de twee-foton microscopische analyse van hippocampusmicroglia. Hier wordt een methode gepresenteerd die de chronische observatie van microglia in alle lagen van de hippocampus CA1 mogelijk maakt via een beeldvormingsvenster. Deze methode maakt de analyse van morfologische veranderingen in microgliale processen gedurende meer dan 1 maand mogelijk. Langdurige en hoge resolutie beeldvorming van de rustende microglia vereist minimaal invasieve chirurgische procedures, geschikte objectieve lensselectie en geoptimaliseerde beeldvormingstechnieken. De voorbijgaande ontstekingsreactie van hippocampale microglia kan beeldvorming onmiddellijk na de operatie voorkomen, maar de microglia herstellen hun rustige morfologie binnen een paar weken. Bovendien stelt het gelijktijdig in beeld brengen van neuronen met microglia ons in staat om de interacties van meerdere celtypen in de hippocampus te analyseren. Deze techniek kan essentiële informatie verschaffen over de microgliale functie in de hippocampus.

Met behulp van deze techniek kunnen de vertakte en rustige microglia chronisch worden waargenomen in alle lagen van de dorsale CA1, waaronder stratum oriens (SO), stratum pyramidale (SP), stratum radiatum (SR) en stratum lacunosum-moleculare (SLM), vooral 3-4 weken na de operatie wanneer de ontsteking afneemt. Als de operatie op de juiste manier wordt uitgevoerd, kan beeldvorming tot enkele maanden na de operatie worden uitgevoerd. Deze sectie bevat drie onderwerpen die nuttig zijn voor de evaluatie van intravitale beeldvorming. Ten eerste worden voorbeeldbeelden onmiddellijk na de operatie en in de chronische fase verstrekt als referenties voor geschikte chirurgische en beeldvormende procedures. Ten tweede worden de verschillende morfologie van microglia, hun fluorescentie-intensiteit en bloedvatverdeling in specifieke hippocampuslagen beschreven om lezers te helpen de beelddiepte te schatten, variërend van de alveus tot de DG. Ten derde wordt een toepassingsvoorbeeld gegeven dat gelijktijdige beeldvorming van neuronen en microglia illustreert.
De representatieve beelden van microglia in CX3CR1-GFP-muizen onmiddellijk na de operatie zijn weergegeven in figuur 2. Als er geen duidelijke schade aan de CA1 is en de kromming van de CA1-lagen goed wordt afgevlakt door de bovenliggende dekplaat, overschrijden de beeldvormingsdiepten van microglia met twee fotonen de volledige CA1-lagen en bereiken ze 500 μm van het chirurgische oppervlak, waar de ML of de korrelcellaag (GCL) van het DG bestaat (figuur 2A; zie stap 4.7 en figuur 4E). Microglia zijn iets minder vertakt, vooral in de laag dicht bij het chirurgische oppervlak in vergelijking met die in de intacte hippocampus. Niettemin vertonen ze geen prominente activering, wat wijst op de juiste chirurgische procedures (figuur 2B). Aan de andere kant zal oedeem in de CA1 veroorzaakt door weefselbeschadiging de beelddiepte beperken tot 200 μm (figuur 2C). Weefselschade induceert ook abnormale microgliale activering, zoals accumulatie van uitpuilende processen naar het vrije weefseloppervlak (figuur 2D; vergelijk met de bovenste afbeelding van figuur 2B). Dit zijn tekenen van ongepaste chirurgie.
De representatieve beelden van microglia in de chronische fase meer dan 3 weken na de operatie zijn weergegeven in figuur 3. Microglia kunnen opnieuw worden afgebeeld voorbij de CA1 naar de diepere lagen van de DG met een hogere fluorescerende intensiteit en resolutie en met een meer homogene verdeling (zie stap 6.3, figuur 3B). De beeldkwaliteit is beter dan direct na de operatie (figuur 2A). Dit verschil kan worden verklaard door verminderd oedeem en ontsteking. Microglia in alle lagen hebben hun vertakte morfologie al hersteld (figuur 3C), anders dan hun postoperatieve uiterlijk (figuur 2B). Time-lapse beeldvorming van microglia in de CA1 onthult de immobiele cellichamen en zeer beweeglijke processen voor surveillance (Video 1-2). Hun beweeglijke gedrag is vergelijkbaar met het vorige rapport van microgliale procesdynamica in de cortex9.
Het is eenvoudig om de afgebeelde hippocampuslagen te specificeren op basis van de verdeling en de diepte van neuronale cellichamen, met behulp van muizen die fluorescerende sondes tot expressie brengen in de hippocampale neuronen25,26,27. Zonder de hulp van de positionele informatie over de neuroncellichamen, bieden de signalen van fluorescerende microglia alleen enkele aanwijzingen voor de identificatie van hippocampuslagen (figuur 3B). Microglia in de alveus hebben langwerpige cellichamen en processen die de neiging hebben zich langs de axonale kanalen uit te strekken (figuur 4A). Microglia in andere lagen kunnen worden onderscheiden door hun ronde cellichamen en processen die uitstralen zonder voorkeursrichtingen. Microglia in SP behoren tot de dicht opeengepakte piramidale neuronen en kunnen worden onderscheiden door de lagere dichtheid van microgliale processen. De lagen boven en onder SP worden geïdentificeerd als respectievelijk SO en SR (figuur 4B). Het is onmogelijk om onderscheid te maken tussen SR en SLM op basis van microgliale eigenschappen alleen. De grens tussen de CA1 en de DG wordt herkend door dikke bloedvaten die langs de grens lopen (figuur 4C). Deze vaten kunnen beter worden herkend door vaten te labelen met kleurstoffen zoals sulforhodamine 101 (SR101; 5 mM, 4 μL/g lichaamsgewicht) intraperitoneaal geïnjecteerd (figuur 4D). Het fluorescentiesignaal van microglia daalt sterk in de DG ten opzichte van de bovenliggende CA1, waarschijnlijk als gevolg van het verschil in de brekingsindex van deze structuren. Deze kloof in fluorescentie-intensiteit kan ook helpen om de grens tussen DG en CA1 te specificeren. Als toepassingsvoorbeeld wordt gelijktijdige beeldvorming van GFP-positieve microglia en tdTomato-gelabelde piramidale neuronen getoond (figuur 4E). In dit experiment kregen CX3CR1-GFP-muizen een injectie met adeno-geassocieerd virus (AAV) voor de expressie van tdTomato in de hippocampale piramidale neuronen. Neuronale labeling zal helpen om de exacte laagstructuren van de CA1 te begrijpen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig01.jpg"> Figuur 1: Schematische tekeningen voor de implantatie van het observatievenster . (A) Doorsnede van de geassembleerde metalen buis met glazen bodem. Een ronde glazen afdekplaat hecht aan het ene uiteinde van de cilindrische roestvrijstalen buis. (B) Doorsnede van de aluminium plaat bevestigd aan de schedel. De plaat moet evenwijdig zijn aan het gemarkeerde oppervlak van de schedel om de objectieflens niet te verstoren, dicht bij de plaat geplaatst om scherp te stellen. (C) Doorsnede van de geïmplanteerde buis. De glazen bodem moet nauw worden bevestigd aan de alveus van de hippocampus om het oppervlak van de CA1 zachtjes in te drukken en af te vlakken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig02.jpg"> Figuur 2: In vivo beeldvorming van microglia bij CX3CR1-GFP muizen direct na de operatie. (A) Representatieve 3D-reconstructie van de in vivo CA1-beeldvorming van een CX3CR1-GFP-muis op postoperatieve dag (POD) 0 (breedte: 511 μm, hoogte: 511 μm, diepte: 550 μm). De fluorescerende microglia in de ML van de DG op een diepte van 500 μm van de glazen bodem kunnen door de gehele CA1 in beeld worden gebracht. (B) Typische met GFP gevulde microglia verkregen in (A) worden weergegeven als de maximale intensiteitsprojecties (MIPs) van beeldstapels met een dikte van 20 μm op diepten van 100, 300 en 520 μm van de glazen bodem. Microgliale morfologie is detecteerbaar van de oppervlakkige CA1 tot de ML van de DG, hoewel met schijnbare beeldverslechtering in de DG. Microglia, vooral in de laag dicht bij het operatieoppervlak, zijn minder vertakt, maar vertonen geen duidelijke activering. Schaalstaven, 50 μm. (C) Representatieve 3D-beeldreconstructie van de chirurgisch beschadigde CA1. De gegevens werden verkregen van een CX3CR1-GFP-muis op POD 0 (breedte: 399 μm, hoogte: 399 μm, diepte: 450 μm). Microgliale fluorescentie is alleen detecteerbaar tot de diepte van 200 μm, in tegenstelling tot de onbeschadigde CA1 (A) met fluorescerende microglia gedetecteerd op een diepte van 500 μm. (D) Het typische beeld van abnormaal geactiveerde microglia in (C). De MIP van GFP-beeldstapels met een dikte van 20 μm op een diepte van 60 μm toont microgliale uitstulpingsprocessen die zich uitstrekken naar het chirurgisch blootgestelde weefseloppervlak. De algemene microgliale morfologie verschilt van de afbeelding in (B). Schaalbalk, 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig03.jpg"> Figuur 3: In vivo beeldvorming van microglia in CX3CR1-GFP muizen in de chronische fase. (A) Het representatieve uiterlijk van het geïmplanteerde venster op de rechter dorsale CA1 in de chronische fase. Door de glazen bodem worden de witte vezels van de alveus duidelijk waargenomen zonder postoperatieve bloedingen. De DHC en de LV zijn gedeeltelijk zichtbaar in respectievelijk het caudomediale gebied en in de rostrolaterale rand. Schaalbalk, 1 mm. (B) Representatieve 3D-reconstructie van de in vivo chronische CA1-beeldvorming van een CX3CR1-GFP-muis op POD 24 (breedte: 511 μm, hoogte: 511 μm, diepte: 670 μm). Vergeleken met de beelden direct na de operatie (figuur 2A) vertonen microglia een homogenere verdeling en kunnen ze duidelijker worden waargenomen in de diepere lagen van het DG vanwege de vermindering van oedeem en ontsteking. (C) Typische beelden van microglia van (B) met volledig herstelde vertakte morfologie worden weergegeven als de MIPs van GFP-beeldstapels met een dikte van 20 μm op diepten van 100, 280 en 500 μm van het chirurgische oppervlak. Schaalstaven, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig04.jpg"> Figuur 4: Aanwijzingen voor het identificeren van elke laag van de hippocampus tijdens in vivo beeldvorming en een toepassingsvoorbeeld van deze methode. (A) Het typische beeld van microglia in de alveus van CX3CR1-GFP-muizen in de chronische fase. Microgliale cellichamen en processen die zich uitstrekken langs de axonale kanalen worden weergegeven in de MIP van GFP-beeldstapels met een dikte van 10 μm op een diepte van 15 μm. Schaalbalk, 50 μm. (B) Representatieve beelden van microglia in SO, SP en SR in de chronische fase weergegeven als de MIP van GFP-beeldstapels met een dikte van 5 μm. De lokale dichtheid van microgliale processen is lager in SP dan in omringende SO of SR vanwege de dicht opeengepakte piramidale neuronen in SP. Schaalstaven, 100 μm. (C) De dikke bloedvaten die langs de grens tussen de CA1 en de DG lopen, zijn alleen te herkennen aan de microgliale fluorescentie. De gemiddelde intensiteitsprojectie van betegelde GFP-beeldstapels met een dikte van 90 μm in de chronische fase op een diepte van ongeveer 500 μm wordt weergegeven. De leegte van het GFP-signaal komt overeen met de dikke vaten. Schaalbalk, 500 μm. (D) (boven) Het beeld van hetzelfde gezichtsveld als C na intraperitoneale injectie van SR101. Schaalbalk, 500 μm. (Onderste) 3D-reconstructie van de tegelbeelden na SR101-injectie (breedte: 2,60 mm, hoogte: 1,73 mm, diepte: 0,69 mm). De dikke vaten die langs de grens tussen de CA1 en de DG lopen, zijn gemakkelijk te herkennen aan de intravasculaire SR101-fluorescentie. (E) (Links) 3D reconstructie van de CA1 en de DG (breedte: 255 μm, hoogte: 255 μm, diepte: 730 μm) en (rechts) de MIP van GFP en tdTomato fluorescentie in SP gemaakt van beeldstapels met een dikte van 20 μm. 1 week voor de operatie werd 1,5 μl van een mengsel van AAV1-CAG-FLEX-tdTomato (5,0 x 10 12 vg/ml) en AAV1-hSyn-Cre (1,0 x10 9 vg/ml) geïnjecteerd in de hippocampus van een CX3CR1-GFP-muis om de neuronen spaarzaam te labelen. Beeldvorming werd uitgevoerd op POD 0. SP en GCL zijn gemakkelijk te herkennen aan de positie van neuronale cellichamen. Schaalbalk, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Video 1: Time-lapse beeldvorming van SO microglia in de chronische fase. De MIP van GFP-beeldstapels met een dikte van 20 μm in de time-lapse-beeldvorming van SO-microglia, geanimeerd zodat 28 minuten spelen in 1 seconde. Schaalbalk, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/Video1.zip" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>
Video 2: Time-lapse beeldvorming van SR microglia in de chronische fase. De MIP van GFP-beeldstapels met een dikte van 20 μm in de time-lapse-beeldvorming van SR-microglia, geanimeerd zodat 28 minuten spelen in 1 seconde. Schaalbalk, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/Video2.zip" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>

Dit artikel beschrijft een methode voor chronische in vivo observatie van de rustende microglia in de hippocampus CA1 van de muis met behulp van nauwkeurig gecontroleerde chirurgie en twee-fotonenmicroscopie.

In Vivo Chronische twee-foton beeldvorming van microglia in de hippocampus van de muis

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal ...

De rol van microglia in de hippocampus is nog niet volledig begrepen. Dit protocol kan direct in beeld brengen hoe microglia in contact komen en neuronen reguleren. In vivo beeldvorming van rustende microglia en neuronen in de hippocampus is erg moeilijk geweest.Deze methode kan dit probleem oplossen. Om het observatievenster te implanteren, maakt u een cirkelvormige groef van drie millimeter op de schedel met behulp van een dermale pons, waardoor de uitlijning van de groef met het eerder gemarkeerde gebied wordt gewaarborgd. Wanneer de dermale stoot de binnenste laag van de schedel bereikt voordat hij de onderliggende dura raakt, tilt u het centrale boteiland voorzichtig op met behulp van een naald van 30 gauge.Verwijder vervolgens voorzichtig de dura met behulp van een dura-picker. Zuig de pia, piale vaten en corticale weefsel van het oppervlak af. Houd de diepte van het blootgestelde weefseloppervlak homogeen over het hele schedelvenster en verdiep geleidelijk de aspiratie totdat vezels van de externe capsule worden blootgesteld.Nadat u de zuigpunt naar de externe capsule in de buurt van de laterale ventrikel aan het rostrolaterale uiteinde van het schedelvenster hebt geplaatst, verwijdert u de oppervlaktelaag van de externe capsule die in de caudomediale naar de rostrolaterale richting loopt. Verwijder vervolgens de binnenste laag die in de middelmatige richting loopt. Bevestig de verwijdering van de gehele uitwendige capsule door de volledige blootstelling van het oppervlak van de alveus en de dorsale hippocampuscommissure te controleren.Nadat u ervoor hebt gezorgd dat het bloeden volledig is gestopt, vult u het gat met steriele zoutoplossing tot ter hoogte van het schedeloppervlak. Steek vervolgens de metalen buis met glazen bodem verticaal in het gat terwijl u het overtollige water dat overloopt van de zijkanten van de buis aanzuigt totdat de glazen bodem licht tegen de alveus drukt en de onderliggende CA1 gedeeltelijk afvlakt. Bevestig met behulp van het tandharscement de wand van de ingebrachte buis aan de omliggende schedel.Plaats de muis in het hoofdhoudapparaat onder de objectieflens van de tweefotonenmicroscoop en op de gemotoriseerde XY-scanfase. Vul vervolgens de ruimte tussen de glazen bodem en de objectieflens met water zonder luchtbellen te creëren. Pas de focus aan op CA1 met de begeleiding van fluorescentie die wordt uitgezonden door het hersenparenchym en het gereflecteerde licht van de rand van de metalen buis onder continue verlichting door de gepulseerde laser.Pas de hoek van de muiskop aan door het hoofdvasthoudapparaat zo te kantelen dat de glazen bodem evenwijdig is aan het beeldvlak. Pas vervolgens de correctiekraag van het objectief aan om de hoogste resolutie te bereiken op een diepte van de doelstructuur in de CA1. Bevestig vervolgens dat de fluorescerende cellen in de moleculaire laag van de gyrus dentate of DG op een diepte van 500 micrometer van de glazen bodem in het hele gezichtsveld worden afgebeeld.Alleen bij een succesvolle operatie kunnen de DG-signalen direct worden gedetecteerd. Verhoog de postoperatieve muis gedurende enkele weken in individuele behuizing. Plaats de verdoofde muis onder de microscoop met twee fotonen.Voer de beeldvorming van de hippocampus uit. Bevestig of de kwaliteit en intensiteit van de beelden die zijn vastgelegd na de vermindering van postoperatief oedeem beter of vergelijkbaar zijn met die op de dag van de operatie. Zorg ervoor dat microglia hun vertakte morfologie hebben hersteld.Voer vervolgens in vivo beeldvorming uit op de interessante laag in de CA1. De microglia in CX3CR1-GFP-muizen die onmiddellijk na de operatie werden gevangen, vertoonden geen prominente activering. Na een succesvolle operatie zonder inductie van oedeem overschreden de beeldvormingsdiepten van twee fotonen de volledige CA1-lagen en bereikten ze 500 micrometer van het chirurgische oppervlak.De microglia in de chronische fase van meer dan drie weken na de operatie vertoonden een hogere fluorescerende intensiteit en resolutie en een meer homogene verdeling als gevolg van verminderd oedeem en ontsteking. Microglia in alle lagen herstelden al hun vertakte morfologie en vertoonden immobiele cellichamen en zeer modale processen. De hoge resolutie beelden over de gehele CA1 werden gedurende enkele maanden geleverd.De signalen van fluorescerende microglia helpen bij het identificeren van hippocampuslagen. Microglia in de alveus hadden langwerpige cellichamen en processen die zich uitstrekten langs de axonale kanalen. Microglia in de stratum pyramidale konden worden onderscheiden door de lagere dichtheid van hun processen.De grens tussen de CA1 en de DG kon worden herkend aan dikke bloedvaten die langs de grens liepen, wat beter werd herkend door vaten te labelen met sulforhodamine 101. Als toepassingsvoorbeeld werden GFP-positieve microglia en tdTomato gelabelde piramidale neuronen tegelijkertijd in beeld gebracht. Neuronale labeling hielp om de exacte laagstructuren van de CA1 te begrijpen.Het belangrijkste punt is om operatieschade te verminderen. Vermijd weefselschade door aspiratie. Oefen zachte druk uit bij het inbrengen van de glazen bodem en vermijd dat tandcement het hersenoppervlak raakt.Deze aanpak zal helpen bij het identificeren van de rol van microglia in de hippocampus. Bijvoorbeeld hoe microglia interageren met neuronen, hoe ze betrokken zijn bij het leren en hoe ze hersenziekten beheersen.

in-vivo-chronic-two-photon-imaging-microglia-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We beschrijven een methode voor het herhaaldelijk het visualiseren van muriene microglia en circulerende...

Een dunne-schedel Window Techniek voor chronische Twee-foton In vivo Imaging Murine Microglia in modellen van ontstekingsprocessen

Source: Bosco, A., et al. In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma. J. Vis. Exp. (2015) This video demonstrates in vivo imaging of retinal microglia in a mouse model of glaucoma. A transgenic mouse with fluorescent protein-expressing retinal microglia is positioned under an ophthalmoscope. Infrared illumination is used to locate the optic nerve head (ONH), and the focal plane is...

In Vivo Imaging of Retinal Microglia in a Mouse Model of Glaucoma

Source: Ulivi, A. F., et. al. Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice. J. Vis. Exp. (2019) This video demonstrates longitudinal two-photon imaging of fluorescently-labeled pyramidal neurons in a live mouse, showcasing the preparation, cannula alignment, and imaging of dendrites and dendritic spines to study neuronal structure in the hippocampal CA1 region.

Longitudinal Two-Photon Imaging of Fluorescently Labeled Neurons in a Live Mouse Hippocampus 

Source: Nishimura, C. et al. Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (2016). This video demonstrates the in vivo visualization of cortical capillaries in the mouse brain using two-photon microscopy. It outlines the steps for injecting a fluorescent dye into an anesthetized mouse with a thin-skull cortical window, preparing the setup for imaging, and acquiring detailed images of brain...

 Two-Photon Microscopy for In Vivo Imaging of Mouse Brain Microvasculature 

Source: Kamei, R., et. al., In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (2022)The video demonstrates the setup and imaging process for in vivo two-photon microscopy of microglial dynamics in the hippocampal CA1 (Cornu ammonis 1) and dentate gyrus, ensuring optimal optical alignment and structural integrity assessment.

In Vivo Two-Photon Imaging of Microglial Dynamics in the Mouse Hippocampus

Ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in neuronen zijn essentieel voor het vermogen van de hersenen aan te passen als reactie op gedrags-uitdagingen.

In vivo twee-foton beeldvorming van ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in corticale neuronen

Microglia-activatie en microgliose zijn de belangrijkste reacties op chronische neurodegeneratie. Hier presenteren we werkwijzen voor in vivo visualisatietechnieken retinale CX3CR1-GFP + cellen door microgliale confocale Ophthalmoscopie, en drempel en morfometrische analyses worden geïdentificeerd en gekwantificeerd hun activering. We monitoren microglia veranderingen tijdens de vroege stadia van leeftijdsgebonden glaucoom.

In Vivo Dynamiek van retinale Microgliale Activering Tijdens Neurodegeneratie: Confocal oftalmoscopisch Imaging en Cell Morphometry in Mouse Glaucoom

Deze video toont de craniotomieprocedure die chronische beeldvorming van neuronen in de retrospleniale cortex van muizen mogelijk maakt met in vivo twee-foton microscopie in de Thy1-GFP transgene lijn. Deze benadering wordt gecombineerd met injectie van mCherry-expresserend adeno-geassocieerd virus in de dorsale hippocampus. Deze technieken maken langdurige monitoring van ervaringsafhankelijke structurele plasticiteit in RSC mogelijk.

Simultane twee-foton<em&gt; In Vivo</em&gt; Beeldvorming van Synaptic In- en Postsynaptische Doelen op Mouse retrospleniale Cortex

Deze methode beschrijft een chronische voorbereiding die optische toegang tot de hippocampus van levende muizen mogelijk maakt. Deze voorbereiding kan worden gebruikt voor het uitvoeren van longitudinale optische beeldvorming van neuronale structurele plasticiteit en activiteit-opgeroepen cellulaire plasticiteit over een periode van enkele weken.

Longitudinale Two-photon beeldvorming van dorsale Hippocampal CA1 in levende muizen

Hier beschrijven we een protocol dat adeno-geassocieerde virusinjectie combineert met craniale raamimplantatie voor gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamiek en neuronale activiteit bij wakkere muizen.

Gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamica en neuronale activiteit bij wakkere muizen

Dit artikel demonstreert een methode om microglia-motiliteit en contact met postsynaptische puncta in het netvlies te visualiseren en te kwantificeren met behulp van spinning disk confocale microscopie.

Live beeldvorming en karakterisering van microglia-dynamica en interacties met synapsen in een zieke muisnetvlies

Leer chronische in vivo twee-foton beeldvorming van microglia in de hippocampus van de muis. Deze methode maakt langdurige observatie van microglia-neuroninteracties mogelijk voor neurowetenschappelijk onderzoek.

In Vivo Chronische twee-foton beeldvorming van microglia in de hippocampus van de muis

Meer video's verkennen