Een eenvoudige benchtop-filtratiemethode om kleine extracellulaire blaasjes te isoleren van menselijke mesenchymale stamcellen
23 juni 2022
Dit protocol laat zien hoe de kleine extracellulaire blaasjes (hUC-MSC-sEV's) van menselijke navelstreng-afgeleide mesenchymale stamcellen kunnen worden geïsoleerd met een eenvoudige benchtop-instelling op laboratoriumschaal. De grootteverdeling, eiwitconcentratie, sEV-markers en morfologie van geïsoleerde hUC-MSC-sEV's worden gekenmerkt door respectievelijk nanodeeltjestrackinganalyse, BCA-eiwittest, western blot en transmissie-elektronenmicroscoop.
Dit is een eenvoudig en tijdeffectief protocol om kleine extracellulaire blaasjes uit mesenchymale stamcellen te isoleren en te concentreren. Deze techniek is gemakkelijk toe te passen in de meeste laboratoria, omdat het een tafelschaal is en alleen eenvoudige instrumenten voor operaties vereist. Om een van de kleine extracellulaire blaasjes te isoleren, raden we aan om cellen op grote schaal te kweken om minimaal honderd miljoen cellen te verkrijgen.
Hoewel het eenvoudig klinkt, zijn bepaalde kritische stappen van deze techniek beter geïnformeerd door visuele demonstratie. We hopen dat onderzoekers van onze ervaring kunnen leren en de vaardigheden vol vertrouwen onder de knie kunnen krijgen. Onze promovendus, Mr.Chan, Hong Hao, zal u begeleiden door onze ervaring in isolatie en karakteriseringen van kleine extracellulaire blaasjes uit mesenchymale stamcellen.
Om te beginnen, centrifugeer het geconditioneerde medium op 200g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius om celresten te verwijderen. Verzamel en filter het supernatant door een filter van 0,22 micrometer om deeltjes groter dan 220 nanometer te verwijderen. Vulde een centrifugaalfiltereenheid met 30 milliliter 0,2 micrometer gefilterde fosfaat-gebufferde zoutoplossing.
Centrifugeer vervolgens de centrifugaalfiltereenheid op 3.500 g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Gooi de oplossing weg in de beker met filtraatoplossing. Voeg 70 milliliter gefilterd geconditioneerd medium toe aan de centrifugaalfiltereenheid en centrifugeer de eenheid op 3.500 g bij vier graden Celsius.
Gooi de oplossing weg in de beker met filtraatoplossing. Voeg 30 milliliter gefilterde fosfaat-gebufferde zoutoplossing toe en centrifugeer het apparaat op 3.500 g bij vier graden Celsius. Installeer een concentraatopvangbeker op de filtereenheid en draai de centrifuge gedurende twee minuten bij 1.000 g bij vier graden Celsius om de gezuiverde kleine extracellulaire blaasjes te verkrijgen.
Filter de kleine extracellulaire blaasjes door een spuitfilter van 0,22 micrometer. Breng de monsters over naar nieuwe buizen en bewaar ze bij 80 graden Celsius voor verdere analyse. Om te beginnen met de analyse van het volgen van nanodeeltjes, verdunt u de geïsoleerde menselijke navelstreng-afgeleide mesenchymale stamcellen kleine extracellulaire blaasjes in gefilterde fosfaat-gebufferde zoutoplossing tot 20 tot 100 deeltjes per frame.
Breng één milliliter van het verdunde monster in de anti-A-kamer met behulp van één milliliter wegwerpspuiten. Stel de meetinstellingen dienovereenkomstig in. Stel het cameraniveau in op niveau 14.
Klik voor elke meting op de standaardmeting en stel de verdunning dienovereenkomstig in. Klik vervolgens op Vastleggen, Camera starten en stel het cameraniveau in op 14 om de kleine EV's te visualiseren. Als u de meting wilt starten, klikt u op Maken, vervolgens op Script uitvoeren en selecteert u de locatie waar de bestanden moeten worden opgeslagen.
Toets de benodigde gegevens van het voorbeeld in en klik op OK. Klik op de instelling OK om door te gaan met het script en klik op OK om de meting te starten. Zodra de meting is geregistreerd, analyseert u de resultaten met een detectiedrempel van vijf om 10 tot 100 rode kruizen per frame op te nemen. En het aantal blauwe kruisen is beperkt tot vijf.
Klik op OK instellen om door te gaan met het script en de analyse te starten. Klik op OK in de melding script voltooien en exporteren om de gegevens naar de ingestelde locatie te exporteren. Lyseer de menselijke navelstreng-afgeleide mesenchymale stamcellen, kleine extracellulaire blaasjes met ijskoude radioimmunoprecipitatie assay lysisbuffer en incubeer gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius.
Verzamel het supernatant na centrifugeren op 200g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Kwantificeer het eiwit met behulp van een BCA-test. Stel de gelelektroforese dienovereenkomstig samen en voer gelelektroforese uit op 90 volt totdat het eiwit het uiteinde van de stapelgel bereikt.
Verander de spanning naar 200 volt om de eiwitten te scheiden tot het einde van de oplossende gel. Voer semi-droge overdracht uit om de eiwitten van de gel over te brengen naar een polyvinylideendifluoridemembraan bij 15 volt gedurende één uur. Blokkeer het PVDF-membraan met 3% runderserumalbumine in tris-gebufferde zoutoplossing 0,1% Tween 20 gedurende één uur op een shaker bij kamertemperatuur.
Incubeer het PVDF-membraan met primaire antilichamen bij vier graden Celsius gedurende de nacht met constant schudden. Was de volgende dag het PVDF-membraan vijf keer en vijf minuten elk met TBST en incubeer verder met een secundair antilichaam gedurende een uur met roeren bij kamertemperatuur. Nogmaals, was het PVDF-membraan vijf keer met TBST en visualiseer het membraan in een charge-coupled imager met behulp van een chemiluminescent detectiereagens.
Analyseer het expressieniveau van de eiwitten met behulp van ImageJ-software. Open eerst het afbeeldingsbestand in ImageJ. Verbeter de kwaliteit van de afbeelding door de helderheid en het contrast aan te passen.
Pas de afbeelding aan totdat de vlekken duidelijk zichtbaar zijn. Klik op de knop Toepassen en sla de afbeeldingen op in TIFF-indeling. Voor analyse op basis van transmissie-elektronenmicroscopen, verdunt u een deel van het van de menselijke navelstreng afgeleide mesenchymale stamcellenmonster met vier delen gefilterde fosfaatgebufferde zoutoplossing tot een totaal volume van 10 microliter en incubeer u gedurende 15 minuten op een met koolstof gecoat koperrooster.
Verwijder het overtollige monster met een laboratoriumdoekje en laat het drie minuten aan de lucht drogen. Incubeer 10 microliter 1% fosfotungstische zuuroplossing om het monster gedurende drie minuten te kleuren. Verwijder de overtollige 1% fosfotungstic acid-oplossing met behulp van een laboratoriumdoekje en laat het drie minuten aan de lucht drogen om onder een transmissie-elektronenmicroscoop in beeld te brengen.
Menselijke navelstreng-afgeleide mesenchymale stamcellen kleine extracellulaire blaasjes hebben een deeltjesgroottemodus van 53 nanometer, terwijl andere significante pieken van deeltjesgrootte 96 en 115 nanometer waren. De concentratie van van menselijke navelstreng afgeleide MSC kleine extracellulaire blaasjes gemeten door NTA was 7,75 maal 10 tot de 10e deeltjes per milliliter. De eiwitconcentratie van van de menselijke navelstreng afgeleide MSC kleine extracellulaire blaasjes gemeten met de BCA-test was ongeveer 80 microgram per milliliter.
In western blotting-analyse vertoonden van de menselijke navelstreng afgeleide MSC kleine extracellulaire blaasjes positieve banden voor exosomale markers CD9, CD81 en TSG101, maar waren negatief voor GRP94. De geïsoleerde menselijke navelstreng-afgeleide MSC kleine extracellulaire blaasjes werden gevisualiseerd onder TEM om hun grootte en morfologie te bepalen. Menselijke navelstreng-afgeleide mesenchymale stamcellen, kleine extracellulaire blaasjes ter grootte van ongeveer 100 nanometer en vertoonden een cup-achtige dubbellaagse membraanstructuur.
Met de succesvolle ontwikkeling van het protocol kunnen we nu de therapeutische mogelijkheden van mesenchymale stamcellen afgeleide kleine extracellulaire blaasjes in regeneratieve geneesmiddelen ontdekken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een eenvoudige en tijdbesparende methode voor het isoleren van kleine extracellulaire vesicles (sEVs) van uit menselijke navelstreng afgeleide mesenchymale stamcellen (hUC-MSCs). De studie gebruikt eenvoudige benchtoptechnieken die gemakkelijk kunnen worden aangepast in verschillende laboratoriumomgevingen, waardoor een effectieve karakterisering van de grootte, eiwitconcentratie en morfologie van de sEVs mogelijk is.
Belangrijkste studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Isolatie van extracellulaire vesicles
- Stamcellenbiologie
- Mesenchymale stamcellen
Achtergrond
- Het begrijpen van kleine extracellulaire vesicles is cruciaal voor het beoordelen van hun biologische rollen.
- hUC-MSCs zijn een veelbelovende bron voor dergelijke vesicles vanwege hun regeneratieve eigenschappen.
- Conventionele methoden voor het isoleren van sEVs vereisen vaak complexe infrastructuur en zijn mogelijk niet voor alle labs toegankelijk.
Gebruikte methoden
- Benchtop centrifugatie voor initiële scheiding
- NanoParticle Tracking Analysis (NTA) voor het karakteriseren van de vesicle grootte
- Western blot en transmissie-elektronenmicroscopie voor het beoordelen van eiwitgehalte en morfologie
Belangrijkste resultaten
- De gemiddelde deeltjesgrootte van de geïsoleerde sEVs was 53 nm, met opmerkelijke pieken bij 96 en 115 nm.
- De eiwitconcentratie van de geïsoleerde sEVs was ongeveer 80 µg/mL zoals bepaald door BCA eiwit assay.
- Bevestigt de effectiviteit van het protocol in het genereren van hoogwaardige sEVs voor downstream toepassingen.
Conclusies
- De studie presenteert een haalbaar en aanpasbaar protocol voor het isoleren van sEVs van hUC-MSCs.
- Deze aanpak maakt verder onderzoek mogelijk naar de functionele rollen van sEVs in verschillende biologische contexten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Efficient isolation and characterization of small extracellular vesicles (sEVs) from human mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) is critical for advancing discovery-stage regenerative medicine and cell therapy research. This benchtop filtration protocol enables scalable, reproducible sEV preparation, supporting robust target validation and downstream translational studies. The method's accessibility and quantitative outputs facilitate portfolio-wide adoption and cross-program comparability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of sEV-mediated signaling pathways in disease-relevant systems.
- Supports functional target validation by providing standardized sEV preparations for mechanistic studies.
- Facilitates predictive confidence in sEV-associated biomarker discovery and pathway de-risking.
Screening & Assay Development
- Delivers reproducible, well-characterized sEV samples for assay development and compound screening.
- Standardizes input material for quantitative readouts in downstream bioassays.
- Improves scalability and throughput compared to ultracentrifugation-based isolation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with MISEV 2018 criteria, supporting translational continuity and regulatory expectations.
- Enables consistent sEV characterization for preclinical model studies and biomarker alignment.
- Reduces biological variability, enhancing risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
This benchtop filtration method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, providing a standardized workflow for sEV isolation, quantification, and characterization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating functionally relevant sEVs.
- Screening: Provides assay-ready, quantitatively defined sEV samples for reproducible screening campaigns.
- Analytics: Enables nanoparticle tracking analysis, BCA protein quantification, and marker validation by western blot and TEM.
- Translational Research: Ensures continuity of sEV quality and characterization from early discovery through preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable protocol suitable for diverse R&D programs and cross-team standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in sEV research.
- Operational Value: Streamlines sEV isolation with accessible instrumentation and robust reproducibility.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by standardizing sEV workflows.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of sEV-based therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, filtration, and vesicle characterization techniques.
- Needs access to benchtop centrifuges, nanoparticle tracking analyzers, and western blot/TEM infrastructure.
- Demands cross-team agreement on sEV characterization standards and quantitative thresholds.
- Adaptable to various stem cell sources and conditioned media with protocol optimization.
- Yield and purity may vary with input cell number and filtration parameters, requiring empirical adjustment.
