Testen van epitheliale permeabiliteit bij foetale weefsel-afgeleide enteroïden

Het belang van dit protocol is om de bruto waarschijnlijkheid van enteroïden te testen op het in vitro model van voortijdig epitheel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het meten van de permeabiliteit van een ingesloten lumen dat de darmluminale omgeving nabootst. Dit protocol kan worden gebruikt om de factoren te bestuderen die lekkende darmziekte induceren of verzwakken.

Het kan ook worden toegepast op endotheel- of vasculaire systemen om aandoeningen te bestuderen die vasculaire lekkage kunnen veroorzaken. Dit protocol vereist enige oefening. We raden aan om elke sectie afzonderlijk te oefenen voordat u de hele procedure samenstelt.

Breng om te beginnen de darmsegmenten over naar een petrischaaltje van 60 bij 15 vierkante millimeter met ijskoude Dulbecco's PBS met amfoteracine en week gedurende 20 minuten op ijs. Snijd met behulp van een scalpel met een schaar de darmsegmenten in stukken van drie tot vijf millimeter en plaats één tot twee stukken in een petrischaaltje van 35 bij 15 vierkante millimeter met 0,5 tot één milliliter organoïde groeimedium op ijs. Knip de darmbuis in de lengterichting met behulp van een ontleedmicroschaar en tang.

Gebruik vervolgens de tang om de epitheelcellen van de fascia te schrapen. Verwijder de fascia en draai de schaal om de celklonters te breken. Breng vervolgens met behulp van een 20-microliter pipet gesneden tip de cellen en de media over in een toename van vijf tot 10 microliter naar een keldermembraanmatrixmix om een oplossing van 285 microliter te maken.

Meng de cellen door te pipetteren in een keldermembraanmatrix op ijs met behulp van een gesneden punt van 200 microliter. Plaats na het mengen vijf stroken van 50 microliter van het celkeldermembraanmatrixmengsel in één put van een voorverwarmde zesputtenplaat die op een warme schuimsteen wordt bewaard. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 10 minuten om polymerisatie en een verharding van de keldermembraanmatrix mogelijk te maken.

Zodra de matrixstrips zijn gestold, voegt u twee milliliter van de enteroïde groeimedia toe aan de put voordat u de plaat terug in de incubator plaatst. Nadat de enteroïden zijn overgebracht naar een put van een zes-well of 12-well plaat, elke alternatieve dag, vervang de oude media door verse media. En als de enteroïden zijn begonnen te gedijen, passeer de cellen elke vijf tot zeven dagen.

Voeg voor immunofluorescentiekleuring 500 microliter van het primaire antilichaam in blokkerende buffer toe aan elke put van enteroïden en incubeer 's nachts bij vier graden Celsius. Verwijder de volgende dag de antilichaamoplossing en was de enteroïden driemaal met PBS. Na incubatie in één tot 400 verdunde secundaire antilichaamoplossing, gevolgd door incubatie in DAPI, wast u de enteroïden driemaal met PBS.

Om de driedimensionale structuren van de enteroïden te behouden, gebruikt u uitsparingen van dunne siliconenrubberen platen of glazen afdekslips om een ruimte van 0,5 tot één millimeter te creëren tussen de onderste glasplaat en de afdekslip. Was voor montage de gekleurde enteroïden met 70%glycerol. Til vervolgens met behulp van een entlus van één microliter of een gesneden tip van 200 microliter de enteroïden uit de plaat en monteer ze met glycerol op een glazen microscoopglaasje.

Bereid een petrischaaltje bedekt met een transparante filmhoes en voeg twee tot vier druppels van één microliter van de Dextran-FITC toe aan de film. Met behulp van de micromanipulator drijft u de micropipetpunt in de vloeistof en boven de film onder een stereomicroscoop en trekt u vervolgens voorzichtig aan de spuit om de Dextran-FITC in de micropipet op te zuigen. Nadat u de micropipet hebt gevuld met twee tot vier microliter Dextran-FITC, drukt u op de spuit om eventuele lucht uit de pipetpunt te verwijderen.

Inspecteer ook de geïnjecteerde materiaalkolom in de micropipet om er zeker van te zijn dat er geen luchtzak is en registreer het volume van Dextran-FITC in de micropipet. Schakel vervolgens de luchtbron in die is aangesloten op de pneumatische pomp voordat u de pomp inschakelt en de pompduur instelt op 10 tot 15 milliseconden. Draai vervolgens de stopkraan op de spuit om de lijn van de pomp naar de micropipet te openen.

Verwijder de enteroïden uit de incubator en plaats de schaal op een warmschuimsteen in een afgedekte container om de blootstelling aan licht na micro-injectie te minimaliseren. Plaats de petrischaal met enteroïden onder de stereomicroscoop en beweeg de micromanipulatorknoppen om de micropipetpunt in een hoek van 35 tot 45 graden ten opzichte van het horizontale oppervlak te plaatsen. Visualiseer en identificeer de bolvormige enteroïden met als doel drie tot vijf enteroïden per gerecht te injecteren.

Breng vervolgens de punt naar een doel enteroïde door door de microscoop oogstukken te kijken. Vervolgens, door de Z-asknop met een precieze langzame beweging te bewegen, doorprikt u de enteroïde met de micropipetpunt. De vooruitgang zou moeten stoppen zodra de punt door het enteroïde oppervlak gaat, dat drukt en terugspringt.

Tik met één voet op het pomppedaal en vul de enteroid met de groenachtige Dextran-FITC-oplossing totdat deze is uitgevouwen. Noteer het aantal pompen om het verpompte volume en de Dextran-concentratie te berekenen. Dit protocol toonde de karakterisering van foetale weefsel-afgeleide enteroïden door het kleuren van verschillende biomarkers specifiek voor intestinaal epitheel met immunofluorescente antilichamen, wat hun dunne darm epitheliale oorsprong bevestigt.

Enteroïden in verschillende stadia worden hier getoond. Een zeven tot 10 dagen oude enteroïde is klein en dik. Terwijl een enteroïde klaar voor micro-injectie groot was met een lumen en dunne wand.

De enteroïde bevat twee dagen na de micro-injectie nog steeds aanzienlijke hoeveelheden Dextran-FITC. De permeabiliteit van de enteroïden na micro-injectie werd beoordeeld door de Dextran-concentratie in de media te meten. EGTA, waarvan bekend is dat het de membraandoorlaatbaarheid op tight junctions verhoogt, werd gebruikt als een positieve controle.

De Dextran-meettest toont verder aan dat LPS een verhoogde permeabiliteit veroorzaakte en een hogere LPS-concentratie een hogere permeabiliteit veroorzaakte. Het belangrijkste van fixeren en kleuren is om de vorm van de enteroïden niet te verstoren of ze tijdens het proces te verliezen. Na micro-injectie kunnen media worden verzameld voor cytokine-assay en enteroïden kunnen worden geoogst voor RNA-sequencing.