Een bipolaire elektrode gebruiken om een temporale kwab epilepsiemuismodel te maken door elektrische aanmaakhoutjes van de amygdala

Dit protocol stelde een model van epilepsie voor met amygdala als oorsprong. Het effent de weg naar het onderzoek van mesiale temporale kwabstructuren. Dit model kan worden geïnterpreteerd als de basis van het experiment.

Omdat dit protocol een goedkope en efficiënte methode is, kan het in de meeste laboratoria snel worden uitgevoerd. De procedure wordt gedemonstreerd door Yongchang Lu, een postgraduaat in ons laboratorium. Begin met het verzamelen van de vooraf voorbereide componenten, te beginnen met twee centimeter lange stukken teflon-gecoate wolfraamdraad met een beerdiameter van 76,2 micrometer.

Eén stuk zilverdraad met een berendiameter van 127 micrometer van dezelfde lengte en één set van twee bij twee touwpennen. Gebruik een aansteker om het ene uiteinde van elke wolfraamdraad te branden om vijf millimeter van de isolatiecoating te verwijderen. Schil een stuk ultrafijn meerstrengs draad.

Pak uit van de onderkant naar de bovenkant waar het donker begint te worden en doorloopt naar de bovenkant. Combineer deze superfijne draad en de wolfraamdraad door het ene uiteinde te knijpen en het andere voorzichtig te draaien, waardoor de twee materialen gemakkelijk met elkaar kunnen worden verstrengeld. Trek er voorzichtig aan om ervoor te zorgen dat de draden strak zijn omwikkeld en knip de overtollige superfijne draad af.

Probeer de wolfraamdraad gedurende het hele proces recht te houden. Bevestig de touwpen aan de klem op de lastafel met de langere kant van de pennen naar buiten gericht. Gebruik de naald van de spuit om wat soldeerpasta op te pakken en op de pinnen aan te brengen.

Verwarm de lastoorts tot 320 graden Celsius. Smelt en smeer wat loodvrij tindraad in met de toortspunt. Overlap het bovenste uiteinde van de wolfraamdraad met één naald van de touwpennen en gebruik het soldeer op de toorts om de wolfraamdraad aan de pen te binden.

Las een andere wolfraamdraad en nog een zilverdraad op dezelfde manier aan de touwpen, zodat elke draad overeenkomt met een naald. Knip twee krimpkousen iets langer dan het bovenste uiteinde van de wolfraamdraad. Plaats ze op de soldeerverbinding van twee wolfraamdraden en zorg ervoor dat het geleidende deel volledig in de buis is bedekt, zodat het circuit van de twee wolfraamdraden niet in serie wordt geplaatst.

Verwijder de elektrode uit de lastafelklem en houd de elektrode voorzichtig vast met een grote tang, omdat het gemakkelijk is voor elektroden om hun vorm te verliezen bij het verwarmen van de krimpbare buis. Gebruik een goede thermische geleidbaarheidsklem met iets meer kracht. Zet het luchtkanaal aan en verwarm tot een temperatuur van 320 graden Celsius is bereikt.

Blaas de krimpkous enkele seconden door totdat deze is vastgedraaid. Versterk de elektrode met smeltlijm. Houd de twee wolfraamdraden vast en draai ze samen, waarbij ze hun uiteinden uit elkaar houden.

Knip de gedraaide wolfraamdraden bij tot ongeveer 10 millimeter lang, zodat de scheiding aan de uiteinden niet groter is dan 0,5 millimeter. Controleer de elektroden met een multimeter door één staaf van de multimeter aan de ongelaste kant van de touwpennen te plaatsen en het uiteinde van wolfraamdraad of zilverdraad voorzichtig aan te raken aan de andere staaf. Controleren of het circuit soepel is.

Zorg ervoor dat de lijnen niet in serie worden geplaatst. Verwijder vijf millimeter van de isolatiehuid aan elk uiteinde om de metalen draad binnenin bloot te leggen. Voeg een gedeelte van krimpbare buizen toe aan elke startdraad.

Las elke draad met de stekker van de EEG-apparaatconnector. Verklein de krimpbare buis met hete lucht. Voeg een deel van de krimpkous toe aan elke rotordraad.

Schroef de geleidende delen van de rode en oranje draden aan elkaar en last ze aan een verbinding en de kop om op de touwpen te passen. Las de andere twee draden op de kop aan elke verbinding. Weeg de muis.

Wanneer de muis volledig verdoofd is, scheer je haar van het oog naar het oorgebied met een scheermes. Bevestig de muis op het stereotaxische frame. Plaats de voorste boventanden in de snijtand en steek beide oorbalken tot gelijke diepte in de oren.

Breng erytromycine oogzalf aan op de ogen om droogheid en blindheid veroorzaakt door fel licht tijdens de operatie te voorkomen. Desinfecteer het operatiegebied ten minste drie keer met afwisselende wattenstaafjes jodofor en 75% alcohol. Maak een longitudinale incisie om het chirurgische gebied volledig bloot te leggen of maak een driehoekige incisie zolang deze de voorste en achterste fontanellen en elektrode-implantatieplaatsen blootlegt.

Rol een klein stukje katoen in een bal en maak het nat met 3% waterstofperoxide. Verwijder het zachte weefsel dat aan de schedel is bevestigd door zachtjes over het blootgestelde gebied te wrijven met een klein watje totdat de voorste en achterste fontanel worden gezien. Stel de voorste en achterste hoogte zo in dat de voorste en achterste fontanel horizontaal zijn.

Beschouw de positie van de voorste fontanel als de oorsprong van de assen. Bevestig een roestvrijstalen schroef aan de linker cerebellaire schedel. Stel de coördinaten in voor de amygdala aanmaakhout van de bregma en pas het stereotaxische apparaat aan om deze plek te lokaliseren en te markeren.

Boor een gat op de marsplek met een schedelboor met een diameter van 0,5 millimeter. Bevestig de elektroden aan de lokalisatiestaaf van het stereotaxische apparaat. Plaats de elektrode verticaal boven het gat en laat de positie langzaam zakken tot min 4,9 millimeter.

Wikkel het zilverdraad driemaal om de schroef. Zorg ervoor dat het elektrodelichaam tijdens het gebruik niet schudt. Meng tandcement en breng het voorzichtig aan op de elektrode en het schedeloppervlak.

Wanneer het tandcement uithardt, wijzigt u de buitenkant totdat het cement dat de vaste elektrode omsluit in een kegel verandert. Laat vervolgens de elektrode los van het stereotaxische apparaat. Verwijder de muis en plaats deze terug in de kooi.

Houd het gescheiden van de andere muizen. Plaats de muis in een aangepaste doos met pantoffelkabels die de elektrode op de kop van de muis en het EEG-apparaat verbinden. Laat de kabel door een gat in het deksel van de doos lopen en pas de lengte van de linker in de doos aan zodat de muis vrij kan bewegen.

Schakel het EEG-apparaat in en zorg ervoor dat het correct werkt. Stel de stimulatorparameters in om monofasische blokgolfpulsen van één milliseconde af te geven bij 60 hertz voor een treinduur van één seconde gedurende 10 stimulatiecycli. Begin met een huidige intensiteit van 50 microampère voor de eerste stimulatie.

Controleer het EEG voor na ontlading gekenmerkt door hoogfrequente pieken. Als er geen na ontlading wordt waargenomen, voeg dan 25 microampère toe aan de volgende stimulus en ga door met dit proces om de 10 minuten totdat een na ontlading wordt waargenomen en vijf seconden duurt. Stimuleer de muis met de vastgestelde stroomintensiteit elke 15 minuten, niet meer dan 20 keer per dag.

Monitor de gedragsreacties op de stimulus. De elektrode-implantatieoperatie werd uitgevoerd op zes gezonde volwassen mannetjes, C57 zwarte 6-muizen en elektrische stimulatie werd twee weken na de operatie uitgevoerd. Het niveau van de gedragsaanvallen nam geleidelijk toe met het aantal stimuli dat toenam en het aantal stimuli dat nodig was voor volledige aanmaakhoutjes werd geregistreerd.

Het EEG na ontlading duurde vijf tot 15 seconden. Toen werden de intracraniële spontane ontladingen geïntensiveerd en begonnen de gedragssymptomen. De duur van de aanval was meestal minder dan een minuut, wat het risico op overlijden door ernstige convulsies die resulteren in apneu vermindert.

De expressie van c-Fos in het hersenweefsel werd twee uur na volledige aanmaakhoutering gedetecteerd door immunohistochemie. De resultaten tonen aan dat de expressie van c-Fos in de ipsilaterale amygdala de haalbaarheid van dit model aanzienlijk verhoogde. De scheiding van wolfraamdraaduiteinden mag niet groter zijn dan een halve millimeter, anders komt het niet door het hersengat.

De lengte van de elektrode mag niet te lang zijn, anders heeft dit invloed op de activiteit van muizen.