Name: Ontwikkeling van knock-out spiercellijnen met behulp van Lentivirus-gemedieerde CRISPR / Cas9-genbewerking (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Leer hoe je knock-out spiercellijnen maakt met CRISPR/Cas9-genbewerking via lentivirus. Deze methode versnelt genfunctieonderzoek in spierbiologie en is sneller dan traditionele dierlijke modellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de Association Française contre les myopathies (AFM-Téléthon) en van Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).

<ol><li>Claussnitzer, M., Susztak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaining+insight+into+metabolic+diseases+from+human+genetic+discoveries%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gaining insight into metabolic diseases from human genetic discoveries.</a> Trends in Genetics. 37 (12), 1081-1094 (2021).</li>
<li>Fuster-García, C., García-Bohórquez, B., Rodríguez-Muñoz, A., Millán, J. M., García-García, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+CRISPR+tools+for+variant+interpretation+and+disease+modeling+in+inherited+retinal+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Application of CRISPR tools for variant interpretation and disease modeling in inherited retinal dystrophies.</a> Genes. 11 (5), 473(2020).</li>
<li>Modell, A. E., Lim, D., Nguyen, T. M., Sreekanth, V., Choudhary, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+therapeutics%3A+current+challenges+and+future+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based therapeutics: current challenges and future applications.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 43 (2), 151-161 (2022).</li>
<li>Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+correction+of+muscular+dystrophy+by+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Toward the correction of muscular dystrophy by gene editing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), (2021).</li>
<li>Wu, X., Kriz, A. J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+specificity+of+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Target specificity of the CRISPR-Cas9 system.</a> Quantitative Biology. 2 (2), 59-70 (2014).</li>
<li>Merienne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+self-inactivating+KamiCas9+system+for+the+editing+of+CNS+disease+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes.</a> Cell Reports. 20 (12), 2980-2991 (2017).</li>
<li>Marty, I., Fauré, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation-contraction+coupling+alterations+in+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuromuscular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Excitation-contraction coupling alterations in myopathies.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 3 (4), 443-453 (2016).</li>
<li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPOR%3A+intuitive+guide+selection+for+CRISPR%2FCas9+genome+editing+experiments+and+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).</li>
<li>Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quick%2C+cost-free+method+of+purification+of+DNA+fragments+from+agarose+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A quick, cost-free method of purification of DNA fragments from agarose gel.</a> Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).</li>
<li>Flucher, B. E., Conti, A., Takeshima, H., Sorrentino, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+3+and+type+1+ryanodine+receptors+are+localized+in+triads+of+the+same+mammalian+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Type 3 and type 1 ryanodine receptors are localized in triads of the same mammalian skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Cell Biology. 146 (3), 621-630 (1999).</li>
<li>Hess, H. H., Lees, M. B., Derr, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+linear+Lowry--Folin+assay+for+both+water-soluble+and+sodium+dodecyl+sulfate-solubilized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A linear Lowry--Folin assay for both water-soluble and sodium dodecyl sulfate-solubilized proteins.</a> Analytical Biochemistry. 85 (1), 295-300 (1978).</li>
<li>Garibaldi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dusty+core+disease%27+%28DuCD%29%3A+expanding+morphological+spectrum+of+RYR1+recessive+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Dusty core disease' (DuCD): expanding morphological spectrum of RYR1 recessive myopathies.</a> Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 3(2019).</li>
<li>Marty, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+evidence+for+a+complex+involving+Dihydropyridine+receptor+and+Ryanodine+receptor+in+triad+junctions+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biochemical evidence for a complex involving Dihydropyridine receptor and Ryanodine receptor in triad junctions of skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2270-2274 (1994).</li>
<li>Oddoux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triadin+deletion+induces+impaired+skeletal+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Triadin deletion induces impaired skeletal muscle function.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 34918-34929 (2009).</li>
<li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+pathological+human+myoblasts%3A+towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1, 34(2011).</li>
<li>Cacheux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+a+central+core+disease+RyR1+mutation+%28p.Y4864H%29+associated+with+quantitative+defect+in+RyR1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuromuscular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of a central core disease RyR1 mutation (p.Y4864H) associated with quantitative defect in RyR1 protein.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 2 (4), 421-432 (2015).</li>
<li>Luis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+old+and+the+new%3A+Prospects+for+non-integrating+lentiviral+vector+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The old and the new: Prospects for non-integrating lentiviral vector technology.</a> Viruses. 12 (10), 1103(2020).</li>
<li>Leenay, R. T., Beisel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering%2C+communicating%2C+and+engineering+the+CRISPR+PAM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Deciphering, communicating, and engineering the CRISPR PAM.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (2), 177-191 (2017).</li>
<li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titration+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protocols in Neurosciences. , Chapter 4, Unit 4.21 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Een belangrijke stap op weg naar de karakterisering van genen met een onbekende functie die betrokken zijn bij pathologieën is de ontwikkeling van relevante cellulaire modellen om de functie van deze genen te bestuderen. Het gebruik van genbewerking met CRISPR/Cas9 is een exponentieel groeiend onderzoeksgebied en de ontwikkeling van knock-outmodellen zoals hier gepresenteerd is een van de meest gebruikte toepassingen. In deze context stellen we hier een veelzijdig protocol voor om een menselijke cellijn knock-out te ontw...

Met de voortgang van gensequencing en de identificatie van mutaties in genen met onbekende functies in een specifiek weefsel, vormt de ontwikkeling van relevante cellulaire modellen om de functie van een nieuw doelgen te begrijpen en de betrokkenheid ervan bij de gerelateerde pathofysiologische mechanismen te bevestigen een essentieel hulpmiddel. Daarnaast zijn deze modellen van groot belang voor toekomstige therapeutische ontwikkelingen 1,2, en vormen ze een interessant alternatief voor de ontwikkeling van knock-out diermodellen in rechte lijn met de internationale aanbevelingen voor vermindering van het gebruik van dieren bij experimenten. Genbewerking met CRISPR/Cas9 is een van de krachtigste tools die momenteel beschikbaar zijn, waardoor veel knock-out/knock-in modellen zijn ontwikkeld, en gerichte genvalidatie met CRISPR/Cas9 behoort tot de meest gebruikte toepassingen van CRISPR/Cas93. Het succes van genbewerking is afhankelijk van het vermogen om de CRISPR-tools (de gids RNA's en de nuclease Cas9) in het doelcelmodel te introduceren, wat een uitdaging kan zijn in veel moeilijk te transfecteren cellen, zoals spiercellen4. Deze uitdaging kan worden overwonnen met het gebruik van virus, meestal lentivirus, dat het grote voordeel heeft om veel celtypen efficiënt te transduceren en zijn transgen te leveren. Maar het belangrijkste nadeel is de integratie van het transgen in het genoom van de gastheercel, wat leidt tot mogelijke verandering van genen gelokaliseerd op de integratieplaats en tot de permanente expressie van het transgen, wat in het geval van het nuclease Cas9 zou leiden tot schadelijke gevolgen5. Merienne en collega's6 hebben een slimme oplossing voorgesteld, die bestaat uit de introductie in de cellen van een gids-RNA gericht op het Cas9-gen zelf, wat leidt tot Cas9-inactivatie. Een aanpassing van deze strategie wordt hier gepresenteerd als een gebruiksvriendelijk en veelzijdig protocol dat het mogelijk maakt om vrijwel elk gen in moeilijk te transfecteren cellen uit te schakelen.
Het doel van het hier gepresenteerde protocol is om de inactivatie van een gen van belang in vereeuwigde spiercellen te induceren. Het kan worden gebruikt om elk gen van belang uit te schakelen, in verschillende soorten onsterfelijke cellen. Het hier beschreven protocol bevat stappen om de gids RNA's en hun klonen in lentivirale plasmiden te ontwerpen, om de CRISPR-tools in lentivirale vectoren te produceren, om de cellen met de verschillende lentivirussen te transduceren en om de cellen te klonen om een homogene bewerkte cellijn te produceren.
Met behulp van dit protocol zijn onsterfelijk gemaakte menselijke skeletspiercellen ontwikkeld met deletie van de type 1 ryanodinereceptor (RyR1), een essentieel calciumkanaal dat betrokken is bij intracellulaire calciumafgifte en spiercontractie7. De knock-out (KO) van het gen is bevestigd op eiwitniveau met behulp van Western blot en op functioneel niveau met behulp van calciumbeeldvorming.

<table><tbody><tr><td>Anti-CACNA1S antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA048892</td><td>Primair antilichaam</td></tr><tr><td>Blp I</td><td>NE BioLabs</td><td>R0585S</td><td>Beperkingsenzym</td></tr><tr><td>CalPhos Mammalian Transfection Kit</td><td>Takara</td><td>631312&nbsp;</td><td>Transfectiekit</td></tr><tr><td>Easy blot anti Mouse IgG</td><td>GeneTex</td><td>GTX221667-01</td><td>HRP secundair antilichaam</td></tr><tr><td>Easy blot anti Rabbit IgG</td><td>GeneTex</td><td>GTX221666</td><td>HRP secundair antilichaam</td></tr><tr><td>Fluo-4 direct</td><td>Molecular Probes</td><td>F10472</td><td>Calcium beeldvorming</td></tr><tr><td>GAPDH(14C10) Rabbit mAb&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#2118</td><td>Primair antilichaam</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>Fermentas</td><td>ER0501</td><td>Beperkingsenzym</td></tr><tr><td>InFusion HD Precision Plus</td><td>Takara</td><td>638920</td><td>Ligatiekit</td></tr><tr><td>MasterMix Phusion High Fidelity with GC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F532L</td><td>Mix voor PCR-reactie met High fidelity Taq polymerase en dNTP's</td></tr><tr><td>Myosin Heavy Chain antibody</td><td>DHSB</td><td>MF20</td><td>Primair antilichaam</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td><td>Macherey-Nagel</td><td>REF&nbsp;740424</td><td>Maxipreparatiekit voor zuivering van plasmiden</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td>DNA-zuivering</td></tr><tr><td>NucleoSpin Tissue</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952</td><td>Kit voor DNA-extractie uit cellen</td></tr><tr><td>One Shot Stbl3 Chemically Competent&nbsp;E. coli</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C737303</td><td>Chemisch competente cellen</td></tr><tr><td>Plasmid #87904</td><td>Addgene</td><td>87904</td><td>Lentiviraal plasmid dat SpCas9 codeert (voor LV-Cas9)</td></tr><tr><td>Plasmid #87919</td><td>Addgene</td><td>87919</td><td>Lentiviraal ruggengraat voor insertie van cassette met geleiders (voor LV-guide-target)</td></tr><tr><td>Plasmid #12260</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>Lentiviraal plasmid dat lentiviraal verpakking GAG POL codeert</td></tr><tr><td>Plasmid #8454</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td>Lentiviraal plasmid dat envelop-eiwit codeert voor het produceren van lentivirale en MuLV retrovirale deeltjes</td></tr><tr><td>V5 Tag Monoclonal Antibody</td><td>Invitrogene</td><td>R96025&nbsp;</td><td>Primair antilichaam</td></tr><tr><td>XL10-Gold Ultracompetent Cells</td><td>Agilent</td><td>200317</td><td>Chemisch competente cellen</td></tr><tr><td>Xma I</td><td>NE BioLabs</td><td>R0180S</td><td>Beperkingsenzym</td></tr></tbody></table>

ontwikkeling van knock-out spiercellijnen met behulp van lentivirus-gemedieerde crispr / cas9-genbewerking

Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing

Een belangrijke toepassing van clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 is de ontwikkeling van knock-out cellijnen, specifiek om de functie van nieuwe genen/eiwitten geassocieerd met een ziekte te bestuderen, geïdentificeerd tijdens de genetische diagnose. Voor de ontwikkeling van dergelijke cellijnen moeten twee belangrijke kwesties worden ontward: het inbrengen van de CRISPR-tools (het Cas9 en het gids-RNA) met een hoge efficiëntie in de gekozen cellen en beperking van de Cas9-activiteit tot de specifieke deletie van het gekozen gen. Het hier beschreven protocol is gewijd aan het inbrengen van de CRISPR-tools in moeilijk te transfecteren cellen, zoals spiercellen. Dit protocol is gebaseerd op het gebruik van lentivirussen, geproduceerd met plasmiden die openbaar beschikbaar zijn, waarvoor alle kloonstappen worden beschreven om zich te richten op een gen van belang. De controle van Cas9-activiteit is uitgevoerd met behulp van een aanpassing van een eerder beschreven systeem genaamd KamiCas9, waarbij de transductie van de cellen met een lentivirus dat codeert voor een gids-RNA gericht op de Cas9 de geleidelijke afschaffing van Cas9-expressie mogelijk maakt. Dit protocol is toegepast op de ontwikkeling van een RYR1-knock-out menselijke spiercellijn, die verder is gekarakteriseerd op eiwit- en functioneel niveau, om de knock-out van dit belangrijke calciumkanaal te bevestigen dat betrokken is bij de intracellulaire calciumafgifte van de spieren en bij excitatie-contractiekoppeling. De hier beschreven procedure kan gemakkelijk worden toegepast op andere genen in spiercellen of in andere moeilijk te transfecteren cellen en waardevolle hulpmiddelen produceren om deze genen in menselijke cellen te bestuderen.

Dit protocol werd toegepast op vereeuwigde myoblasten van een gezonde proefpersoon15 (zogenaamde HM-cellen, voor menselijke myoblasten), waarin de RyR1 eerder is gekarakteriseerd16, om het RYR1-gen dat codeert voor het RyR1-eiwit uit te schakelen. Het ontwerp van het geleidings-RNA werd gemaakt om de sequentie te verwijderen die een deel van exon 101 en intron 101 van het gen omvat. Het schrappen van een deel van exon 101 zal naar verwachting leiden tot verstoring ...

Het protocol beschrijft hoe knock-out myoblasten kunnen worden gegenereerd met CRISPR / Cas9, van het ontwerp van guide-RNA's tot het cellulair klonen en karakteriseren van de knock-out klonen.

Ontwikkeling van knock-out spiercellijnen met behulp van Lentivirus-gemedieerde CRISPR / Cas9-genbewerking

One important application of clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 is the development of knock-out cell lines, ...

Dit protocol maakt de ontwikkeling van spiercel knock-out in elk gen mogelijk, om de functie van dit gen in de spier verder te bestuderen. Het voordeel is dat het goedkoop en sneller is dan de ontwikkeling van knock-out dieren om een gen te bestuderen. Deze techniek kan bijvoorbeeld worden gebruikt om de betrokkenheid van een nieuw geïdentificeerd gen bij een myopathie te bestuderen.Als de hier beschreven techniek wordt toegepast op iPS-cellen, kan dit leiden tot de ontwikkeling van knock-outcellen voor elk gen in elk type cellen. Om te beginnen met geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen of CRISPR-gemedieerde gendeletie, gebruik je eerst genoombrowsertools zoals ensembl. org om het doelgen te identificeren samen met de DNA-sequenties aan beide zijden ervan.Om de lijst met de gen-exonen te krijgen, klikt u eerst op het transcript van de eiwitcoderende sequentie en vervolgens op Exons. Klik vervolgens op Downloadsequentie en selecteer alleen genomische sequentie om de volledige consensussequentie van het hele gen te downloaden. Blader door de lijst met exonen en introns van het gen om de beoogde te selecteren.Selecteer voor het ontwerpen van gids-RNA eerst nucleotidesequenties van de introns onmiddellijk stroomopwaarts en stroomafwaarts van de doelsequentie. Ga dan naar een website zoals crispr.tefor. net en gebruik de geselecteerde sequenties om twee geleide-RNA's te ontwerpen, elk 20 nucleotiden lang zonder het Protospacer Adjacent Motif gescheiden door een paar honderd basenparen.Bepaal vervolgens de omgekeerde complementsequentie voor elk gids-RNA en rangschik de primers. Om gids-RNA-cassettes voor plasmideklonen te construeren, voert u eerst een PCR uit met één set primers met behulp van het recept en het programma dat in de tekst wordt beschreven, en scheidt u vervolgens de PCR-producten in 1% agarose-gel met behulp van Tris-borate-EDTA-buffer. Snijd vervolgens het fragment van het paar met 300 basissen weg en zuiver met behulp van een kit.Op dezelfde manier, na het uitvoeren van een andere PCR met de andere primerset, zuivert u een 400-basenpaar lang DNA-fragment in 20 microliter elutiebuffer. Om de geleide-RNA-cassettes in een lentivirale plasmide-ruggengraat in te brengen, moet eerst een dubbele verteringsreactie van het plasmide worden ingesteld met de restrictie-enzymen Xma 1 en Blp 1 zoals beschreven in de tekst. Na het incuberen van de reactiebuis bij 37 graden Celsius gedurende een uur, incubeer het bij 65 graden Celsius gedurende 20 minuten, laat het verteringsproduct vervolgens in een 1% agarose-gel lopen en zuiver het plasmide van ongeveer 10 kilobaseparen met behulp van een geschikte kit.Kwantificeer ook het gezuiverde product door de optische dichtheid te meten. Om de gids-RNA-cassette met het plasmide te ligateeren, bereidt u een reactiemix voor met het gezuiverde gids-RNA, het gelineariseerde plasmide-DNA, enzym en water tot een laatste volume van 10 microliter en incubeert u vervolgens de reactiebuis bij 50 graden Celsius gedurende 15 minuten om het uiteindelijke plasmide te genereren, pGuide genaamd. Voor de productie van lentivirussen, eerst een plaat van 145 centimeter met 1 miljoen HEK 293-cellen in DMEM met hoge glucose en pyruvaat aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline of streptomycine.Vervolgens groeien de cellen drie dagen bij 37 graden Celsius in een 5% koolstofdioxide-incubator. Controleer op de vierde dag de cellen om 60 tot 65% samenvloeiing te garanderen. Bereid vervolgens de transfectieoplossing voor, bestaande uit het plasmide van belang, het plasmide dat codeert voor de virusenvelop, het lentivirale verpakkingsplasmide psPAX2 en calciumfosfaat.Stel het uiteindelijke volume in op 1000 microliter met water. Voeg vervolgens de transfectieoplossing druppelsgewijs toe aan één milliliter 2X HBS onder roeren en incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 10 minuten. Voeg daarna de oplossing druppelsgewijs toe aan de cellen.Voor een homogene verdeling van de transfectieoplossing kantelt u de plaat voorzichtig in alle richtingen en incubeert u de cellen vervolgens bij 37 graden Celsius in een 5% kooldioxide-incubator gedurende ten minste vijf uur. Verwijder vervolgens de media van de platen en was de cellen met PBS om de transfectiereagentia te verwijderen en voeg vervolgens 12 milliliter vers medium toe. Na 48 uur incubatie bij 37 graden Celsius, pool de media van alle platen in een buis.Doe de buis in een afgesloten emmer en centrifugeer op 800 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius, filter vervolgens het supernatant met behulp van een filter van 0,45 micrometer en centrifugeer het filtraat op 68, 300 keer G gedurende twee uur bij vier graden Celsius, met behulp van een zwenkende emmerrotor. Nadat u het supernatant hebt verwijderd, houdt u de buizen ondersteboven op een papieren handdoek in een veiligheidskast gedurende vijf tot 10 minuten voor maximale verwijdering van vloeistof uit de pellets. Voeg 100 microliter HEC-proliferatiemedium toe en houd de buizen minstens twee uur op vier graden Celsius.Resuspendeer vervolgens de pellet door pipetteer. Nadat u alle geresuspendeerde pellets hebt verzameld, maakt u aliquots van 10 of 25 microliter en slaat u de aliquots op bij min 80 graden Celsius na het invriezen van vloeibare waterstof. Voor myoblasttransductie, eerst zaad elk putje van een 96-well plaat met 100 microliter proliferatiemedium met 10.000 myoblastcellen.Voeg de volgende dag vooraf berekende volumes LV-geleiders en LV Cas9 toe aan de cellen in een veiligheidskast. Laat na vijf dagen incubatie de cellen uit de put vrij door trypsine toe te voegen. Breng na het tellen van de celaantallen de cellen over van putten met 40 tot 50% samenvloeiing naar een nieuwe plaat.Voeg na vijf uur incubatie berekende volumes LV-killer toe bij een veelvoud aan infectie van 20 en incubeer gedurende vijf tot 10 dagen of ten minste twee passages ertussenin. Voor functionele karakterisering van de gen-bewerkte klonen door calcium beeldvorming, plaat 50.000 cellen in het midden van een laminine-gecoate 35-millimeter schotel. Om differentiatie te induceren, voegt u het differentiatiemedium toe zoals beschreven in de tekst.Na zes dagen incubatie verwijdert u het kweekmedium en bakent u de cellen af met een hydrofobe pen. Voeg vervolgens 50 microliter Fluo-4 Direct, één-op-één verdund in differentiatiemedium, toe aan de gedifferentieerde myotubes. Na het incuberen van de gerechten op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten, wast u de cellen twee keer met Krebs-buffer aangevuld met één milligram per milliliter glucose.Gebruik vervolgens een omgekeerde fluorescentiemicroscoop of een confocale microscoop met een 10X-objectief om de fluorescentievariaties gedurende 90 seconden met een snelheid van één frame per seconde te meten en kies een veld met ten minste 10 myotubes. Na het verwijderen van de extra Krebs-buffer, stimuleer de cellen met twee milliliter kaliumchloride voor membraandepolarisatie of twee milliliter florochloordiafummetafsol of 4CmC of RyR1 directe stimulatie. Visualiseer de fluorescentievariatie na stimulatie en kwantificeer vervolgens de fluorescentievariatie in elke myotube.Dit protocol kan met succes worden gebruikt om het gen RyR1 uit menselijke myoblasten te slaan, wat resulteerde in korter genomisch DNA in de cellen. RyR1 knock-out werd ook bevestigd op eiwitniveau, omdat het RyR1-eiwit niet kon worden gedetecteerd in de beoogde cellen door Western blotting. De afwezigheid van RyR1-activiteit in myotubes gedifferentieerd van de RyR1 knock-out cellen werd verder geverifieerd door Fluo-4 calcium beeldvorming na directe RyR1 stimulatie door 4CmC of indirecte stimulatie door kaliumchloride-geïnduceerde membraan depolarisatie.De volgorde die zal worden verwijderd, moet nodig zijn voor de voorspelling van een functioneel eiwit. Deze techniek is ideaal voor de ontwikkeling van post-genomische hulpmiddelen om de betrokkenheid van een nieuw gen bij spierziekte te bestuderen.

development-knock-out-muscle-cell-lines-using-lentivirus-mediated

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

De CRISPR / Cas9 systeem biedt de mogelijkheid om gerichte genoom bewerken toegankelijk en betaalbaar voor de wetenschappelijke gemeenschap. Dit protocol is bedoeld om te demonstreren hoe virussen die een gen van belang met behulp van de CRISPR / Cas9 systeem zal knock-out, en dan injecteren ze stereotaxically in de volwassen hersenen van muizen te creëren.

Ontwerpen, Verpakkingen en Levering van hoge titer CRISPR Retro en Lentivirussen via Stereotaxische Injection

Recente vooruitgang in het vermogen om somatische cellijnen genetisch te manipuleren, biedt een groot potentieel voor basis en toegepast onderzoek. Hier presenteren wij twee benaderingen voor CRISPR / Cas9 gegenereerde knockout productie en screening in zoogdiercellijnen, met en zonder het gebruik van selecteerbare markers.

Selectieafhankelijke en onafhankelijke generatie van CRISPR / Cas9-gemedieerde Gene Knockouts in zoogdiercellen

Een protocol voor snelle CRISPR/Cas9-gemedieerde gene verstoring van muis en mens primaire hematopoietische cellen wordt beschreven in dit artikel. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins worden ingevoerd via electroporation met sgRNAs gegenereerd via in vitro transcriptie en commerciële Cas9. Hoge bewerken rendementen worden bereikt met beperkte tijd en de financiële kosten.

Hoogefficiënte Gene verstoring van lymfkliertest en menselijke hematopoïetische voorlopercellen door CRISPR/Cas9

Hier presenteren we een protocol om genetisch wijzigen van primaire of uitgebreide menselijke natural killer (NK) cellen met behulp van Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). Met behulp van dit protocol, we genereerden menselijke NK cellen tekort voor Transformeren groeifactor-b receptor 2 (TGFBR2) en hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Generatie van Knock-out primaire en uitgebreide menselijke NK-cellen met behulp van Cas9 Ribonucleoproteins

Beschreven zijn protocollen voor de zeer efficiënte genoom bewerking van muriene hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPC) door het CRISPR/Cas9-systeem om snel muismodel systemen te ontwikkelen met hematopoietische systeemspecifieke genmodificaties.

Lentivirale CRISPR/Cas9-gemedieerde genoom bewerking voor de studie van hematopoietische cellen in ziekte modellen

Hier presenteren we een protocol voor het ontwikkelen van genetisch gemodificeerde muismodellen met behulp van embryonale stamcellen, vooral voor grote DNA knock-in (KI). Dit protocol is afgestemd met behulp van CRISPR / Cas9-genoombewerking, wat resulteert in een aanzienlijk verbeterde KI-efficiëntie in vergelijking met de conventionele homologe recombinatie-gemedieerde lineaire DNA-targetingmethode.

CRISPR/Cas9-gemedieerde zeer efficiënte gentargeting in embryonale stamcellen voor het ontwikkelen van gen-gemanipuleerde muismodellen

Naarmate CRISPR-gerelateerde protocollen steeds nuttiger en toegankelijker worden, kunnen er onder specifieke experimentele omstandigheden nog steeds complicaties en obstakels optreden. Dit protocol schetst de creatie van een receptor-interagerende serine/threonine-proteïne kinase 1 (RIPK1/RIP1) knock-out menselijke cellijn met behulp van CRISPR/Cas9 en benadrukt mogelijke uitdagingen die zich tijdens dit proces voordoen.

Genereren van een RIP1 knockout U937 cellijn met behulp van het CRISPR-Cas9 systeem

De gepresenteerde methode beschrijft het genereren van een CRISPR-gemedieerde gen-knock-out in de menselijke embryonale stamcel (hESC) lijn H9, die sgRNA's gericht op het L2HGDH-gen stabiel tot expressie brengt met behulp van een zeer efficiënt lentiviraal-gemedieerd genafgiftesysteem.

CRISPR-Cas9 gemedieerde gendeletie in menselijke pluripotente stamcellen gekweekt onder feedervrije omstandigheden

De THP-1-cellijn wordt veel gebruikt als model om de functies van menselijke monocyten/macrofagen in verschillende biologiegerelateerde onderzoeksgebieden te onderzoeken. Dit artikel beschrijft een protocol voor efficiënte CRISPR-Cas9-gebaseerde engineering en isolatie van single-cell kloons, waardoor de productie van robuuste en reproduceerbare fenotypische gegevens mogelijk wordt.

Op elektroporatie gebaseerde CRISPR-Cas9-gemedieerde genknock-out in THP-1-cellen en isolatie van eencellige klonen

Details worden gepresenteerd over hoe QTL mapping met een genoomkaart op basis van een genoom sequentie kan worden gebruikt om een ​​drug resistentie gen in Toxoplasma gondii te identificeren en hoe dit kan worden gecontroleerd met het CRISPR / Cas9 systeem dat efficiënt een genomisch doel bewerkt, in dit geval de Drug resistentie gen.

QTL Mapping en CRISPR / Cas9 Editing om een ​​Drug Resistance Gene te identificeren<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Leer hoe je knock-out spiercellijnen maakt met CRISPR/Cas9-genbewerking via lentivirus. Deze methode versnelt genfunctieonderzoek in spierbiologie en is sneller dan traditionele dierlijke modellen.

Ontwikkeling van knock-out spiercellijnen met behulp van Lentivirus-gemedieerde CRISPR / Cas9-genbewerking

Meer video's verkennen