Ontwikkeling van knock-out spiercellijnen met behulp van Lentivirus-gemedieerde CRISPR / Cas9-genbewerking

Dit protocol maakt de ontwikkeling van spiercel knock-out in elk gen mogelijk, om de functie van dit gen in de spier verder te bestuderen. Het voordeel is dat het goedkoop en sneller is dan de ontwikkeling van knock-out dieren om een gen te bestuderen. Deze techniek kan bijvoorbeeld worden gebruikt om de betrokkenheid van een nieuw geïdentificeerd gen bij een myopathie te bestuderen.

Als de hier beschreven techniek wordt toegepast op iPS-cellen, kan dit leiden tot de ontwikkeling van knock-outcellen voor elk gen in elk type cellen. Om te beginnen met geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen of CRISPR-gemedieerde gendeletie, gebruik je eerst genoombrowsertools zoals ensembl. org om het doelgen te identificeren samen met de DNA-sequenties aan beide zijden ervan.

Om de lijst met de gen-exonen te krijgen, klikt u eerst op het transcript van de eiwitcoderende sequentie en vervolgens op Exons. Klik vervolgens op Downloadsequentie en selecteer alleen genomische sequentie om de volledige consensussequentie van het hele gen te downloaden. Blader door de lijst met exonen en introns van het gen om de beoogde te selecteren.

Selecteer voor het ontwerpen van gids-RNA eerst nucleotidesequenties van de introns onmiddellijk stroomopwaarts en stroomafwaarts van de doelsequentie. Ga dan naar een website zoals crispr.tefor. net en gebruik de geselecteerde sequenties om twee geleide-RNA's te ontwerpen, elk 20 nucleotiden lang zonder het Protospacer Adjacent Motif gescheiden door een paar honderd basenparen.

Bepaal vervolgens de omgekeerde complementsequentie voor elk gids-RNA en rangschik de primers. Om gids-RNA-cassettes voor plasmideklonen te construeren, voert u eerst een PCR uit met één set primers met behulp van het recept en het programma dat in de tekst wordt beschreven, en scheidt u vervolgens de PCR-producten in 1% agarose-gel met behulp van Tris-borate-EDTA-buffer. Snijd vervolgens het fragment van het paar met 300 basissen weg en zuiver met behulp van een kit.

Op dezelfde manier, na het uitvoeren van een andere PCR met de andere primerset, zuivert u een 400-basenpaar lang DNA-fragment in 20 microliter elutiebuffer. Om de geleide-RNA-cassettes in een lentivirale plasmide-ruggengraat in te brengen, moet eerst een dubbele verteringsreactie van het plasmide worden ingesteld met de restrictie-enzymen Xma 1 en Blp 1 zoals beschreven in de tekst. Na het incuberen van de reactiebuis bij 37 graden Celsius gedurende een uur, incubeer het bij 65 graden Celsius gedurende 20 minuten, laat het verteringsproduct vervolgens in een 1% agarose-gel lopen en zuiver het plasmide van ongeveer 10 kilobaseparen met behulp van een geschikte kit.

Kwantificeer ook het gezuiverde product door de optische dichtheid te meten. Om de gids-RNA-cassette met het plasmide te ligateeren, bereidt u een reactiemix voor met het gezuiverde gids-RNA, het gelineariseerde plasmide-DNA, enzym en water tot een laatste volume van 10 microliter en incubeert u vervolgens de reactiebuis bij 50 graden Celsius gedurende 15 minuten om het uiteindelijke plasmide te genereren, pGuide genaamd. Voor de productie van lentivirussen, eerst een plaat van 145 centimeter met 1 miljoen HEK 293-cellen in DMEM met hoge glucose en pyruvaat aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline of streptomycine.

Vervolgens groeien de cellen drie dagen bij 37 graden Celsius in een 5% koolstofdioxide-incubator. Controleer op de vierde dag de cellen om 60 tot 65% samenvloeiing te garanderen. Bereid vervolgens de transfectieoplossing voor, bestaande uit het plasmide van belang, het plasmide dat codeert voor de virusenvelop, het lentivirale verpakkingsplasmide psPAX2 en calciumfosfaat.

Stel het uiteindelijke volume in op 1000 microliter met water. Voeg vervolgens de transfectieoplossing druppelsgewijs toe aan één milliliter 2X HBS onder roeren en incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 10 minuten. Voeg daarna de oplossing druppelsgewijs toe aan de cellen.

Voor een homogene verdeling van de transfectieoplossing kantelt u de plaat voorzichtig in alle richtingen en incubeert u de cellen vervolgens bij 37 graden Celsius in een 5% kooldioxide-incubator gedurende ten minste vijf uur. Verwijder vervolgens de media van de platen en was de cellen met PBS om de transfectiereagentia te verwijderen en voeg vervolgens 12 milliliter vers medium toe. Na 48 uur incubatie bij 37 graden Celsius, pool de media van alle platen in een buis.

Doe de buis in een afgesloten emmer en centrifugeer op 800 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius, filter vervolgens het supernatant met behulp van een filter van 0,45 micrometer en centrifugeer het filtraat op 68, 300 keer G gedurende twee uur bij vier graden Celsius, met behulp van een zwenkende emmerrotor. Nadat u het supernatant hebt verwijderd, houdt u de buizen ondersteboven op een papieren handdoek in een veiligheidskast gedurende vijf tot 10 minuten voor maximale verwijdering van vloeistof uit de pellets. Voeg 100 microliter HEC-proliferatiemedium toe en houd de buizen minstens twee uur op vier graden Celsius.

Resuspendeer vervolgens de pellet door pipetteer. Nadat u alle geresuspendeerde pellets hebt verzameld, maakt u aliquots van 10 of 25 microliter en slaat u de aliquots op bij min 80 graden Celsius na het invriezen van vloeibare waterstof. Voor myoblasttransductie, eerst zaad elk putje van een 96-well plaat met 100 microliter proliferatiemedium met 10.000 myoblastcellen.

Voeg de volgende dag vooraf berekende volumes LV-geleiders en LV Cas9 toe aan de cellen in een veiligheidskast. Laat na vijf dagen incubatie de cellen uit de put vrij door trypsine toe te voegen. Breng na het tellen van de celaantallen de cellen over van putten met 40 tot 50% samenvloeiing naar een nieuwe plaat.

Voeg na vijf uur incubatie berekende volumes LV-killer toe bij een veelvoud aan infectie van 20 en incubeer gedurende vijf tot 10 dagen of ten minste twee passages ertussenin. Voor functionele karakterisering van de gen-bewerkte klonen door calcium beeldvorming, plaat 50.000 cellen in het midden van een laminine-gecoate 35-millimeter schotel. Om differentiatie te induceren, voegt u het differentiatiemedium toe zoals beschreven in de tekst.

Na zes dagen incubatie verwijdert u het kweekmedium en bakent u de cellen af met een hydrofobe pen. Voeg vervolgens 50 microliter Fluo-4 Direct, één-op-één verdund in differentiatiemedium, toe aan de gedifferentieerde myotubes. Na het incuberen van de gerechten op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten, wast u de cellen twee keer met Krebs-buffer aangevuld met één milligram per milliliter glucose.

Gebruik vervolgens een omgekeerde fluorescentiemicroscoop of een confocale microscoop met een 10X-objectief om de fluorescentievariaties gedurende 90 seconden met een snelheid van één frame per seconde te meten en kies een veld met ten minste 10 myotubes. Na het verwijderen van de extra Krebs-buffer, stimuleer de cellen met twee milliliter kaliumchloride voor membraandepolarisatie of twee milliliter florochloordiafummetafsol of 4CmC of RyR1 directe stimulatie. Visualiseer de fluorescentievariatie na stimulatie en kwantificeer vervolgens de fluorescentievariatie in elke myotube.

Dit protocol kan met succes worden gebruikt om het gen RyR1 uit menselijke myoblasten te slaan, wat resulteerde in korter genomisch DNA in de cellen. RyR1 knock-out werd ook bevestigd op eiwitniveau, omdat het RyR1-eiwit niet kon worden gedetecteerd in de beoogde cellen door Western blotting. De afwezigheid van RyR1-activiteit in myotubes gedifferentieerd van de RyR1 knock-out cellen werd verder geverifieerd door Fluo-4 calcium beeldvorming na directe RyR1 stimulatie door 4CmC of indirecte stimulatie door kaliumchloride-geïnduceerde membraan depolarisatie.

De volgorde die zal worden verwijderd, moet nodig zijn voor de voorspelling van een functioneel eiwit. Deze techniek is ideaal voor de ontwikkeling van post-genomische hulpmiddelen om de betrokkenheid van een nieuw gen bij spierziekte te bestuderen.