Positronemissietomografie Beeldvorming van celhandel: een methode voor celradiolabeling

Dit protocol beschrijft een stapsgewijze methode voor het radioactief labelen van cellen en zirkonium-89-DBN en de niet-invasieve tracking ervan door PET. Deze techniek biedt ook een betrouwbare en stabiele methode voor het radioactief labelen van cellen door een covalente conjugatie van zirkonium-89-DBN naar de primaire middelen van de celoppervlakte-eiwitten. Artsen en wetenschappers die werken met celtherapieën voor neurologische aandoeningen en verschillende vormen van kanker zullen dit protocol instrumenteel vinden bij het begrijpen van de farmacokinetiek van celgebaseerde therapieën via niet-invasieve PET-beeldvorming.

Het gedetailleerde protocol biedt richtlijnen voor nieuwe gebruikers om deze radiolabelingtechniek te leren en toe te passen. Extra knooppunten die bij de kritieke stappen zijn opgenomen, helpen bij het oplossen van problemen voor een nieuwe gebruiker. Maak om te beginnen een kolom met ongeveer 100 milligram hydroxamaathars en activeer deze door de kolom te wassen met acht milliliter puur watervrij acetonitril, gevolgd door een spoeling met vijf tot zes milliliter lucht.

Breng twee milliliter 0,5 normaal zoutzuur door naar de kolom. Na het passeren van een extra spoeling van vijf tot zes milliliter lucht, laadt u de oplossing met zowel zirkonium-89 als natuurlijk yttrium langzaam in de hydroxamaathars. Was het ongebonden natuurlijke yttrium van de hydroxamaathars met 20 milliliter van twee normale zoutzuur, gevolgd door 10 milliliter gedeïoniseerd water.

Om zirkonium in de vorm van zirkonium-89 waterstoffosfaat te ontwijken, voegt u 0,5 milliliter 1,2 molair dikaliumfosfaat kaliumdiwaterstoffosfaatbuffer toe aan de kolom en laat u deze 30 minuten op de kolom zitten. Voeg nog eens 1,5 milliliter 1,2 molaire buffer toe om het zirkonium uit de kolom te elueren. Neem vervolgens ongeveer 120 microliter zirkonium-89 waterstoffosfaat geformuleerd in de buffer en neutraliseer de oplossing met HEPES-KOH en kaliumcarbonaat om een pH van 7.528 te bereiken.

Voeg vier microliter vers bereide vijf millimolaire DFO-Bn-NCS toe aan ongeveer 285 microliter geneutraliseerd zirkonium-89-waterstoffosfaat. En meng de oplossing door te pipetteren. Voeg na het isoleren van zirkonium uit yttrium 0,5 milliliter van één molair oxaalzuur toe aan de kolom en laat het een minuut op de kolom zitten om zirkonium in de vorm van zirkonium-89-oxalaat te elueren.

Voeg nog eens 2,5 milliliter van één molair oxaalzuur toe aan de kolom. Om zirkonium-89-oxalaat om te zetten in zirkonium-89-chloride, wast u de anionenuitwisselingskolom met zes milliliter acetonitril, gevolgd door een spoeling met vijf tot zes milliliter lucht. Was vervolgens de kolom met 10 milliliter zoutoplossing, gevolgd door nog een luchtspoeling.

Laad de oplossing met zirkonium-89-oxalaat langzaam op de geactiveerde anionenuitwisselingskolom voordat u deze opnieuw met lucht wast. Was vervolgens de kolom met 50 milliliter gedeïoniseerd water om het ongebonden oxalaation te verwijderen. Om zirkonium in de vorm van zirkonium-89-chloride te ontwijken, voegt u 0,1 milliliter van een normaal zoutzuur toe aan de kolom en laat u het een minuut op de kolom zitten.

Elute het zirkonium uit de kolom met nog eens 0,4 milliliter van een normaal zoutzuur. Droog het ontweken zirkonium-89-chloride in een V-vormige injectieflacon door het gedurende 10 tot 30 minuten in een verwarmingsblok bij 65 graden Celsius onder een constante stroom stikstofgas te plaatsen en reconstitueer vervolgens het gedroogde zirkonium-89-chloride in water. Bereid 500 microliter celsuspensie met ongeveer 6 miljoen cellen in 500 microliter HEPES-gebufferde HBSS in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en voeg ongeveer 100 microliter van het geformuleerde zirkonium-89-DBN toe.

Meng de zirkonium-89-DBN en de celsuspensie door de oplossing voorzichtig op en neer te pipetteren met een micropipet. Incubeer de cellen en het zirkonium-89-DBN-mengsel op een shaker bij ongeveer 550 RPM bij 25 tot 37 graden Celsius gedurende 30 tot 45 minuten voor cellabeling. Voer radioactieve TLC uit op de radioactieve labelreactie van de cel met behulp van vers bereid radioactief TLC-oplosmiddel.

Bereken het percentage radioactiviteit bij Rf gelijk aan 0,01 tot 0,02 met behulp van de vergelijking die op het scherm wordt weergegeven. Meng in een aparte microcentrifugebuis van 1,5 milliliter ongeveer 100 microliter van het geformuleerde zirkonium-89-DBN met ongeveer 500 microliter HEPES-gebufferde HBSS om het te gebruiken als een no-cell controle voor achtergrondcorrectie. Bereken het percentage radioactiviteit bij Rf gelijk aan 0,01 tot 0,02 met behulp van de vergelijking op het scherm en bereken vervolgens de effectieve celradiolabeling door de twee berekende radioactiviteitspercentages af te trekken.

Nadat u de voltooiing van de radiolabeling hebt bevestigd, voegt u 600 microliter gekoeld celgeschikt compleet medium toe om de radioactieve labelreactie uit te voeren. Centrifugeer de cellen bij 96G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. En gooi het supernatant weg.

Resuspendeer de gepelleteerde cellen voorzichtig in 500 microliter van het gekoelde medium door het medium op en neer te pipetteren met een micropipet. Centrifugeer de cellen bij 96G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg. Bereken vervolgens de uiteindelijke efficiëntie van radioactieve labeling na alle wasbeurten met behulp van de vergelijking die op het scherm wordt weergegeven.

Om de kwaliteit van de radioactief gelabelde cellen te waarborgen, inspecteert u de uiteindelijke suspensie van radioactief gelabelde cellen visueel en voert u, als er geen klonten aanwezig zijn, een trypanblauwe uitsluitingslevensvatbaarheidstest uit met 0,4% trypanblauwe oplossing bereid in PBS binnen een uur na radioactieve labeling en de wasstappen. De chelatie-efficiëntie van DFO-Bn-NCS voor zirkonium-89 met behulp van zirkonium-89-waterstoffosfaat en zirkonium-89-chloride is verschillend zoals gemeten door radioactieve TLC. De stabiliteit van verschillende cellen die gedurende zeven dagen radioactief zijn gelabeld met zirkonium-89 wordt hier getoond.

De retentie van zirkonium-89-radioactiviteit door radioactief gelabelde cellen bleek stabiel te zijn in alle bestudeerde cellen, met een verwaarloosbare uitstroom waargenomen gedurende zeven dagen na labeling. De efficiëntie van radioactieve cellabeling in verschillende celtypen met zirkonium-89-DBN wordt weergegeven in deze tabel. De efficiëntie van de radioactieve labeling van cellen varieert van 20 tot 50% als een niet-gecorrigeerde opbrengst die wordt waargenomen in de radioactief gelabelde celpellet na het wassen.

De meest kritische stap van dit protocol is de toevoeging van DFO-Bn-NCS aan het chelatiemengsel en de kwaliteitsbeoordeling van radioactief gelabelde cellen. De toepassing van deze techniek zal helpen om de farmacokinetiek van celgebaseerde therapieën te begrijpen. Het zou ook vragen oproepen over de klinische noodzaak om het klaringsprofiel van celtherapieën te wijzigen.