Een gestandaardiseerd preanalytisch protocol voor vloeibare biopsie voor downstream circulerende DNA-toepassingen

Dit is een standaardprotocol voor de verwerking en opslag van bloedmonsters voor downstream vloeibare biopsietoepassingen op basis van circulerend vrij DNA. Dit is het eerste standaardprotocol dat wordt gepubliceerd, hoewel de techniek al enkele jaren in gebruik is. Het is gemakkelijk te volgen met standaardapparatuur die beschikbaar is in de meeste translationele of wetenschappelijke laboratoria.

Het protocol kan door alle laboratoriummedewerkers worden uitgevoerd. Het protocol helpt bij het standaardiseren van de manier waarop we monsters verzamelen en opslaan, wat uiteindelijk van invloed zal zijn op de kliniek en de variabiliteit zal verminderen tussen verschillende centra die dezelfde of vergelijkbare downstream-analyse uitvoeren, waarbij precisie van het grootste belang is. Deze methode is vooral nuttig in oncologisch onderzoek en ook in klinische toepassingen.

Het kan echter ook worden toegepast bij andere niet-kankerziekten waarbij de vloeibare biopsie ook wordt gebruikt. Nadat het bloedmonster is gecentrifugeerd, kan het moeilijk zijn om te weten hoeveel plasma of serum moet worden verwijderd, maar het volgen van deze specifieke richtlijnen zal hierbij helpen. De rest van het protocol is zeer eenvoudig te volgen met beperkte ervaring in het laboratorium.

Jorge, een technicus van ons laboratorium, demonstreert de procedure. Om te beginnen, centrifugeer de buis met vers bloed bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten bij 1600 keer g, met de maximale pauze toegepast. Verwijder de buis voorzichtig uit de centrifuge.

De bovenste fase van het serumsupernatant ziet er helder en gelig uit. Controleer of het monster tekenen van hemolyse vertoont en noteer indien nodig de aanwezigheid van hemolyse. Breng het serum in een bioveiligheidskast van klasse II over naar verzamelbuizen als aliquots van 250 microliter.

De aliquots moeten correct worden geëtiketteerd. Vries het serum onmiddellijk rechtop in de bewaardoos bij min 80 graden Celsius en noteer de tijd van opslag van het monster. Controleer of de monsters binnen de vereiste periode van vier uur zijn verwerkt.

Centrifugeer de EDTA-buis bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten bij 1600 maal g, met de maximale pauze toegepast. Na centrifugatie zal het plasma-supernatant helder en geelachtig lijken. Controleer of het monster tekenen van hemolyse vertoont en breng het plasma over naar een centrifugebuis van 15 milliliter zonder de cellaag te verstoren met behulp van een wegwerp serologische pipet.

Laat een klein restvolume plasma boven de cellaag achter op ongeveer vijf millimeter. Als hemolyse wordt waargenomen, gooit u het monster weg voor verdere analyse. Centrifugeer het plasma en een centrifugebuis van 15 milliliter om eventuele resterende intacte bloedcellen te verwijderen die zijn overgedragen van de eerste centrifugatiestap.

Verwijder voorzichtig de buis uit de centrifuge, niet de celpellet aan de onderkant van de buis, en breng één tot vier milliliter plasma over naar één tot vier milliliter polypropyleen cryogene bios of Eppendorfs met behulp van een wegwerp serologische pipet. Een restvolume plasma moet aan de onderkant van de buis worden achtergelaten om besmetting van het plasma met bloedcellen te voorkomen. Vries het plasma onmiddellijk rechtop in de opslagdoos bij min 80 graden Celsius en noteer de tijd van monsteropslag.

Controleer of de monsters correct zijn gelabeld en binnen de vereiste periode van vier uur zijn verwerkt. Verzamel de cellaag met behulp van een P1000 en gefilterde punt en breng deze over naar een buis van twee milliliter. Onmiddellijk invriezen en bewaren bij min 80 graden Celsius.

Een voorbeeld van een hoogwaardige cfDNA-extractie die kan worden gebruikt voor downstream-toepassingen wordt hier getoond, terwijl dit grafische beeld een voorbeeld is van een ongeschikt monster met een hoog niveau van genomische verontreiniging. Het plasma of de serumfractie moet een gele kleur hebben. Dit kan variëren afhankelijk van de individuele steekproef.

Monsters met hemolyse moeten worden weggegooid. Zorg ervoor dat u geen celpellet verwijdert bij het verwijderen van de plasmafractie. Dit protocol kan ook worden gebruikt voor andere op nucleïnezuur gebaseerde en eiwittoepassingen, zoals de detectie van niet-coderende RNA's of eiwitten in serum- en plasmamonsters met behulp van immunodetectietechnieken.

Dit is een zeer standaard techniek die in veel laboratoria wordt gebruikt. Dit protocol helpt onderzoekers om te standaardiseren hoe we onze analyse uitvoeren, omdat dit een cruciaal aspect is, noodzakelijk voor toekomstige klinische toepassingen.