In vitro selectie van aptameren om infectieuze van niet-infectieuze virussen te onderscheiden

Dit protocol beschrijft hoe DNA-aptameren kunnen worden geselecteerd die infectieuze virussen kunnen onderscheiden van niet-infectieuze virussen om een detectiemolecuul te verkrijgen dat in staat is om de infecteerbaarheid van klinische of omgevingsmonsters te informeren. Deze techniek kan worden toegepast om selectieve aptameren te verkrijgen voor vele andere virussen, waaronder opkomende virussen, omdat het geen voorkennis van de structuren of sequenties van het virus vereist. Deze techniek maakt de ontwikkeling mogelijk van aptamer-sensoren voor klinische diagnose en omgevingsmonitoring van infectieuze virussen om te detecteren of iemand besmettelijk is of dat een omgevingsdesinfectiemethode werkt zoals bedoeld.

Selectie kan een moeilijk proces zijn, vooral voor degenen die er nieuw in zijn. Het is belangrijk om de PCR-condities te optimaliseren en de voortgang van de selectie te monitoren met qPCR. Marcos Gramajo, een afgestudeerde student van mijn lab, demonstreert de procedure.

Ontwerp om te beginnen de initiële enkelstrengs of SS-DNA-bibliotheek en primers. Verkrijg de DNA-oligo's uit commerciële bronnen met standaard ontzoutingszuivering. Zuiver de SS-DNA-bibliotheek en primers op 10% denaturerende polyacrylamidegel-elektroforese gevolgd door ethanolprecipitatie.

Verkrijg vervolgens een stamoplossing van infectieuze en niet-infectieuze virussen of bereid ze voor zoals beschreven in het tekstmanuscript. Voor denaturatie van de SS-DNA-bibliotheek, meng 10 microliter van 100 micromolaire SS-DNA-bibliotheek met 240 microliter SELEX-buffer. Verwarm het mengsel op 95 graden Celsius gedurende 15 minuten in een droog bad en plaats de buis vervolgens gedurende 15 minuten op ijs.

Meng 250 microliter SS-DNA-bibliotheek in SELEX-buffer met 50 microliter infectieus virus voor positieve selectie. Incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 400 microliter van één millimolaire T20-reeks toe aan een filter van 0,5 milliliter om de niet-specifieke locaties te blokkeren.

Incubeer de filters gedurende 30 minuten. Centrifugeer het filter op 14.000 G gedurende 10 minuten om de T20-oplossing te verwijderen. Was het filter vervolgens driemaal met SELEX-buffer om overtollige T20-sequenties te verwijderen.

Voeg vervolgens het SS-DNA-bibliotheekinfectieus virusmengsel toe aan het geblokkeerde 100 kilodaltonfilter en centrifuge om ongebonden sequenties te wassen. Was het filter driemaal door 400 microliter SELEX-buffer en centrifugatie toe te voegen. Houd de fractie in het filter en gooi de doorstroom weg.

Om gebonden sequenties te elueren, vervangt u de opvangbuis van het centrifugefilter en voegt u 300 microliter SELEX-buffer met acht molair ureum toe aan het filter. Verwarm het filter gedurende 15 minuten op 95 graden Celsius en centrifugeer vervolgens om de doorstroming met de geëlueerde sequenties te verzamelen. Als je klaar bent, was je de materialen met 10% bleekmiddel.

Voeg vervolgens de SS-DNA infectieuze virusoplossing die in de eerdere stap is verzameld toe aan een geblokkeerd 10 kilodaltonfilter, centrifugeer gedurende 15 minuten bij 14.000 G en gooi de doorstroom weg. Was het filter driemaal met 300 microliter SELEX-buffer om het ureum te verwijderen door centrifugeren en gooi de doorstroming weg. Recupereer de oplossing in het filter door deze ondersteboven te draaien in een schone opvangbuis en gedurende vijf minuten te centrifugeren.

Meet het uiteindelijke volume van de teruggewonnen oplossing met behulp van een pipet en label het als een rond 1A-monster. Neem 90% van het Round 1A-monster als sjabloon in de eerste ronde en voer de PCR uit met behulp van geoptimaliseerde omstandigheden. Om SS-DNA te herstellen met behulp van streptavidin gemodificeerde magnetische kralen of MB, splitst u het product in 50 microliter aliquots en voegt u ze toe aan microcentrifugebuizen met 50 microliter MB. Incubeer de buis gedurende 30 minuten met milde agitatie bij kamertemperatuur.

Plaats vervolgens de buis op het magnetische rek om de MB te isoleren en verwijder het supernatant door pipetteren. Was de MB twee keer door 200 microliter bind- en wasbuffer aan de buis toe te voegen. Verwijder vervolgens de buis uit het magnetische rek en tik erop voordat u de MB opnieuw in een homogene oplossing brengt door pipetteren.

Plaats de buis opnieuw op het magnetische rek en verwijder het supernatant. Na de tweede wasbeurt, resuspensie van de MB in 100 microliter SELEX buffer en verwarm de oplossing op 95 graden Celsius gedurende 10 minuten. Plaats de buis onmiddellijk in het magnetische rek en verzamel het supernatant met de SS-DNA-pool.

Herhaal deze herstelstap door 50 microliter SELEX-buffer toe te voegen. Meet het uiteindelijke volume van de teruggewonnen fractie en label het als Round 1X. Neem voor denaturatie van de SS-DNA-pool 60% van het Round 1X-monster en meng het met 50 microliter SELEX-buffer.

Verwarm het monster in een droog bad en plaats de buis vervolgens gedurende 15 minuten op ijs. Meng vervolgens de gedenatureerde SS-DNA-pool in SELEX-buffer met 50 microliter van elk virus als tegenselectiestap en incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur. Na het blokkeren van de niet-specifieke locaties in centrifugefilters, voegt u het mengsel gedenatureerde SS-DNA-pool geïncubeerd met een virusoplossing toe aan een geblokkeerd 100 kilodaltonfilter.

Centrifugeer het filter gedurende 10 minuten op 14.000 G en vang de doorstroming op. Neem 300 microliter fractie en meng met 50 microliter infectieus virus met 100 miljoen kopieën per milliliter. Incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur.

Bereid een standaard qPCR-mastermix en verdunningen van gezuiverde SS-DNA-bibliotheek voor zoals beschreven in de tekst. Voer de qPCR uit om de drempelcyclus te bepalen. Gebruik na de run een standaardcurve om de hoeveelheid SS-DNA in ronde 1A en ronde 1X te kwantificeren.

Bereken vervolgens de elutieopbrengst als de gebonden DNA-hoeveelheid gedeeld door de initiële DNA-hoeveelheid en plot de elutieopbrengst versus het ronde getal. Zet ten slotte de smeltcurves voor verschillende rondes uit. Voor high throughput sequencing selecteert u een geschikte in de handel verkrijgbare kit.

Bereid meerdere pools van selectierondes voor die hoge, gemiddelde en lage verrijking vertegenwoordigen, evenals de uiteindelijke pool met behulp van een ander paar indexen in de adapters voor elke pool. Stuur vervolgens de voorbereide definitieve bibliotheek naar de sequencingfaciliteit. Voor sequencinganalyse zijn sequenties gedemultiplext door de sequencingfaciliteit.

Verwijder de sequencingadapters en selectieprimers met het opdrachtregelprogramma Cutadapt. Gebruik vervolgens het FASTX-Toolkit-programma om sequenties van lage kwaliteit te verwijderen. Voeg vervolgens de sequentiebestanden in de omgekeerde richting samen met die in de voorwaartse richting met behulp van de FASTX-Toolkit FASTX_reverse_ complementfunctie op de bestanden in omgekeerde richting.

Gebruik vervolgens het ingebouwde CAT-programma om de bestanden samen te voegen tot één bestand. Gebruik de FASTAptamer-analysetoolkit om de verrijking van sequenties in verschillende selectiepools te analyseren. Ten eerste om de clusterfuncties FASTAptamer count en FASTAptamer te gebruiken om vergelijkbare sequenties in clusters te groeperen.

Gebruik vervolgens de FASTAptamer-verrijkingsfunctie om informatie te krijgen over de verrijking van sequenties en clusters. Identificeer de kandidaat-aptamersequenties op basis van de verrijkingsinformatie die is verkregen door middel van sequentieanalyse. Selecteer verschillende aptamersequenties en voer een eerste screening uit met behulp van een bindingstest.

In deze analyse werd qPCR gebruikt om de voortgang van SELEX van infectieuze SARS-CoV-2 specifieke aptameren te volgen. De elutieopbrengst nam aanvankelijk toe met elke ronde van SELEX en nivelleerde in ronde acht en negen. Door de smeltcurves te vergelijken, werd een verschuiving van de piek bij een hoge smelttemperatuur van 77 naar 79 graden Celsius waargenomen.

Bovendien werd in de laatste twee rondes een piek bij een lage smelttemperatuur waargenomen. De relatieve abundantie in reads per miljoen voor de gesequentieerde SARS2 AR10 verkregen over opeenvolgende selectierondes wordt getoond. De voorspelde structuur van SARS2 AR10 toonde een gestructureerde secundaire structuur met daarin een stamlusgebied dat mogelijk betrokken is bij het herkennen van het virus.

Zodra aptameren zijn verkregen, kunnen ze worden opgenomen in elektrische opticals, een ander type sensoren, om een portaal en een snelle virusdetectietest te ontwikkelen die de infectiviteit van het virus kan informeren. We voorzien dat aptamer specifiek voor verschillende varianten of stereotypen van het virus kan worden verkregen, waardoor het mogelijk wordt om varianten die de grootste bedreiging voor de samenleving vormen snel te monitoren.