Karakterisering van neuronale lysosoom interactoom met proximity labeling proteomics

Lysosomen zijn de afvalverwijderingssystemen van de cel. De lysosomale activiteiten zijn zeer dynamisch en zeer moeilijk vast te leggen. In deze studie ontwikkelden we een proximity labeling proteomics-benadering om de lysosomale micro-omgeving in levende menselijke neuronen te ontcijferen.

Deze benadering vangt de lysosoommembraaneiwitten en de stabiele en voorbijgaande interacties met de lysosoom- en iPSC-afgeleide neuronen. Lysosomale disfunctie is sterk betrokken bij verschillende hersenziekten. Deze techniek kan worden toegepast om verschillende hersenziekten te begrijpen en potentiële moleculaire doelen te bieden om nieuwe therapieën te ontwerpen.

Om de procedure voor nabijheidsetikettering te starten, observeer je de neuronen onder een microscoop om ervoor te zorgen dat ze levend en gezond zijn. Neem een half volume medium uit de cultuur om te mengen met biotinefenol en voeg het terug toe aan de neuronen in een uiteindelijke concentratie van 500 micromolair gedurende 30 minuten in een incubator van 37 graden Celsius. Initieer de etiketteringsreactie door vers bereide waterstofperoxide-oplossing toe te voegen aan de neuroncultuur in een millimolaire eindconcentratie.

Na een incubatie van één minuut, aspirateer het medium en spoel de cultuur drie keer met blusbuffer. Kantel de plaat om alle resterende buffer aan te zuigen. Na het toevoegen van ijskoude lysisbuffer schraapt u de cellysaten in koude buizen van 1,5 milliliter.

Soniceer de buizen in een ijskoud waterbad op meer dan 100 watt gedurende 15 minuten met afwisselende cycli van 40 seconden aan en 20 seconden uit. Voeg na cellyse koude aceton bij min 20 graden Celsius toe aan het monster op een viervoudig volume van de cellysaatoplossing. Vortex kort en incubeer bij min 20 graden Celsius gedurende drie uur om eiwitten neer te slaan en residubiotinefenol te verwijderen.

Centrifugeer de cellysaatbuis op 16, 500 maal G gedurende 10 minuten bij twee graden Celsius en verwijder het supernatant voorzichtig zonder de eiwitkorrel te verstoren. Was de pellet vervolgens twee keer met één milliliter aceton bij min 20 graden Celsius, gevolgd door centrifugatie en verwijdering van het supernatant. Droog vervolgens de eiwitpellet met een vacuümconcentrator gedurende één minuut.

Voeg cellysisbuffer toe om de pellet volledig op te lossen met vortex of ultrasoonapparaat. Neem 20 microliter aliquot om de totale eiwitconcentratie te bepalen door de DCA-test. Bewaar de resterende celoplossing bij min 80 graden Celsius.

Neem het eiwitlysaatmonster uit de vriezer van min 80 graden Celsius en soniceer de monsterbuis gedurende 30 seconden voor snel ontdooien. Vortex, centrifugeer kort met een benchtop minicentrifuge en plaats de monsterbuis op ijs. Breng vervolgens 250 microliter streptavidin magnetische kraal slurry over naar elke buis van 1,5 milliliter.

Plaats deze buisjes een minuut op een magnetisch rek, was de kralen drie keer met één milliliter 2% natriumdodecylsulfaatoplossing en verwijder de restbuffer. Op basis van de totale eiwitconcentratie van de cellysaten en de resultaten van de kraaltitratietest, voegt u de berekende hoeveelheid eiwitmonster toe die nodig is voor 250 microliter van de streptavidin magnetische kraal slurry. Voeg vervolgens de cellysebuffer toe aan het magnetische kraallysaatmengsel tot het totale volume van één microliter en draai de buis 's nachts op vier graden Celsius.

De volgende dag centrifugeer je de monsterbuis kort op een microcentrifuge en plaats je de buis gedurende één minuut op een magnetisch rek om het supernatant te verwijderen. Was de kralen vervolgens twee keer met één milliliter wasbuffer A met vijf minuten rotatie bij kamertemperatuur. Herhaal het proces met elke wasbuffer tweemaal, opeenvolgend, met buffer B, buffer C en buffer D bij vier graden Celsius.

Plaats de buis gedurende één minuut op een magnetisch rek en verwijder het supernatant. Resuspendeer vervolgens de kralen in 100 microliter vijf millimol TCEP in 50-millilar Tris-buffer om gedurende 30 minuten op een thermomixer bij 37 graden Celsius te incuberen, gevolgd door 15-millimol IAZ-toevoeging gedurende 30 minuten in het donker en vijf millimolaire TCEP-toevoeging gedurende vijf minuten om residu-IAZ te doven. Centrifugeer de monsterbuis kort op een microcentrifuge en plaats de buis gedurende één minuut op een magnetisch rek om supernatant te verwijderen.

Voeg 200 microliter tcep van vijf millimol toe in 50-millimol Tris-buffer om de kralen te resuspenderen. Voeg gedurende 14 uur een microgram trypsine/Lys-C mix toe aan 1, 200 RPM en 37 graden Celsius. Voeg na 14 uur gedurende drie uur nog eens 0,2 microgram trypsine/Lys-C-mix toe, draai de monsterbuizen af en leg ze gedurende één minuut op een magnetisch rek.

Breng vervolgens het peptide-supernatant over naar de schone buizen. Was vervolgens de kralen met 50 microliter 50-millimol Tris-buffer met schudden gedurende vijf minuten, combineer de peptide-supernatanten en voeg 30 microliter 10% trifluorazijnzuur toe aan de buis om de pH te verlagen tot minder dan drie. Na het ontzouten en drogen van peptiden.

resuspend de peptidemonsters in LC-buffer voor LC-MS-analyse. Breng het supernatant over naar de injectieflacon met LC-monster om te analyseren met nano-LC-MS. Voeg in het LC-MS-methodebestand een aangepaste LC-MS-uitsluitingslijst toe met specifieke massa's en retentietijdbereiken voor zeer overvloedige peptidepieken van verontreinigingen, zoals streptavidin, trypsine en Lys-C.

Analyseer de ruwe LC-MC-gegevens met proteomics-software voor gegevensanalyse. Neem twee FASTA-bibliotheken op, een Swiss-Prot Homo sapiens-referentiedatabase en een nieuw gebouwde universal contaminant FASTA-bibliotheek met een contaminant-voorvoegsel in de UniProt ID.Stel de data-analyseparameters in met een 1% false discovery rate voor eiwit- en peptidespectrale matchingidentificaties. Selecteer trypsinevertering met drie gemiste splitsingen, een vaste modificatie van cystine carbamidylmethylatie, een variabele modificatie van methionine-oxidatie en eiwiteindterminale acetylering.

Voor labelvrije kwantificering normaliseert u de piekintensiteiten van het peptide MS-I naar de endogene gebiotinyleerde carboxylase PCCA en vermindert u de variaties in experimenten met nabijheidsetikettering. Exporteer eiwitniveauresultaten van de proteomics-software als een Excel-bestand. Verwijder vóór de statistische analyse contaminanteiwitten en eiwitten met slechts één PSM of geen kwantificeringsresultaat.

Celmorfologieën op verschillende tijdstippen van de iPSC-neuronen illustreerden de neurietuitgroei tijdens de driedaagse differentiatieperiode. Na het overschakelen naar poly-L-ornithine-gecoate platen in het neuronmedium, vormden de neurieten een netwerk tussen neuronen en axonale extensies werden zichtbaarder na rijping in twee weken. In de fluorescentiebeeldvorming werd LAMP1-topactiviteit van gebiotinyleerde eiwitten gekleurd door streptavidin en gelijktijdig gelokaliseerd met LAMP1-kleuring in neuronen.

De resultaten van de kraaltitratietest toonden een afname van niet-gevangen gebiotinyleerde eiwitsignalen bij het verhogen van de hoeveelheid streptavidin-kralen. Vijf microliter streptavidinkorrels waren optimaal voor 50 microgram inputeiwitten uit endogene LAMP1-topmonsters. De on-beads vertering met trypsine/Lys-C mix resulteerde in meer eiwit- en peptide-identificaties en minder gemiste splitsingen in vergelijking met trypsine alleen.

Bovendien bleek 1 tot 1,5 microgram trypsine/Lys-C optimaal te zijn voor de vertering van on-beads om het hoogste aantal geïdentificeerde eiwitten en het laagste percentage gemiste splitsingen te verkrijgen. Bekende lysosomale membraaneiwitten waren verhoogd in LAMP1 apex versus geen apex controle. Endogene biotinylide eiwitten zijn zeer overvloedig, maar blijven onveranderd.

De GO-term en eiwitnetwerkanalyse suggereerden dat stabiele lysosomale membraaneiwitten en voorbijgaande lysosomale interactoren gerelateerd aan endolysosomale handel en transport werden verrijkt met LAMP1 apex proteomics. Apex proximity labeling moet op precies één minuut worden geblust om oxidatieve stress en experimentele variaties te verminderen. We hebben onlangs een splijtbare biotinemethode ontwikkeld waarmee we gebiotinyleerde eiwitten kunnen verrijken.

Deze methode, in combinatie met onze huidige methode, zal ons in staat stellen om de interferenties van streptavidin en endogene gebiotinyleerde eiwitten te verminderen. We kunnen deze methode toepassen op zowel wild-type als mutante neuronen met genetische varianten die hersenziekten veroorzaken. Dit kan ons helpen begrijpen hoe en waarom genetische mutaties de lysosomale micro-omgeving in menselijke neuronen beïnvloeden.