Name: Beeldvorming van CD19+ B-cellen in een experimenteel muismodel met auto-immuun encefalomyelitis met behulp van positronemissietomografie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T12:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Leer PET-beeldvorming van CD19+ B-cellen in het centrale zenuwstelsel met behulp van een muismodel voor experimentele auto-immuun encefalomyelitis. Deze methode biedt nauwkeurige kwantificering van immuuncelgedrag.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn dankbaar voor de steun van de SCi3-beeldvormingsfaciliteit voor kleine dieren in Stanford en Dr. Frezghi Habte voor zijn technische assistentie met de PET/CT. LC-MS wordt uitgevoerd door het kernpersoneel van de Stanford University Mass Spectrometry (SUMS) kernfaciliteit en we waarderen het personeel voor het leveren van deze service. Wij danken Horizon Therapeutics voor het zeer vriendelijk ter beschikking stellen van de hCD19-mAb en Jodi Karnell in het bijzonder voor haar technische begeleiding en ondersteuning. Dit werk werd gefinancierd door de NIH NINDS (1 R01 NS114220-01A1).

<ol><li>Dobson, R., Giovannoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis+-+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis - a review.</a> European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).</li>
<li>Karussis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+of+multiple+sclerosis+and+the+various+related+demyelinating+syndromes%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review.</a> Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).</li>
<li>Hauser, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+depletion+with+Rituximab+in+relapsing-remitting+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">B-cell depletion with Rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis.</a> The New England Journal of Medicine. 358 (7), 676-688 (2008).</li>
<li>Chen, D., Gallagher, S., Monson, N. L., Herbst, R., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inebilizumab%2C+a+B+cell-depleting+anti-CD19+antibody+for+the+treatment+of+autoimmune+neurological+diseases%3A+Insights+from+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inebilizumab, a B cell-depleting anti-CD19 antibody for the treatment of autoimmune neurological diseases: Insights from preclinical studies.</a> Journal of Clinical Medicine. 5 (12), 107(2016).</li>
<li>Stevens, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+CD19+PET+tracer+for+detecting+B+cells+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Development of a CD19 PET tracer for detecting B cells in a mouse model of multiple sclerosis.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 275(2020).</li>
<li>Chaney, A. M., Johnson, E. M., Cropper, H. C., James, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+imaging+of+neuroinflammation+using+%5B11C%5DDPA-713+in+a+mouse+model+of+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">PET imaging of neuroinflammation using [11C]DPA-713 in a mouse model of ischemic stroke.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57243(2018).</li>
<li>Lyons, J. -A., Ramsbottom, M. J., Cross, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+antigen-specific+antibody+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+induced+by+recombinant+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Critical role of antigen-specific antibody in experimental autoimmune encephalomyelitis induced by recombinant myelin oligodendrocyte glycoprotein.</a> European Journal of Immunology. 32 (7), 1905-1913 (2002).</li>
<li>Haugen, M., Frederiksen, J. L., Degn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cell+follicle-like+structures+in+multiple+sclerosis-With+focus+on+the+role+of+B+cell+activating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">cell follicle-like structures in multiple sclerosis-With focus on the role of B cell activating factor.</a> Journal of Neuroimmunology. 273 (1-2), 1-7 (2014).</li>
<li>James, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+B+cells+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis+using+64Cu-Rituximab+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imaging B cells in a mouse model of multiple sclerosis using 64Cu-Rituximab PET.</a> Journal of Nuclear Medicine. 58 (11), 1845-1851 (2017).</li>
<li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-mediated+methodology+for+the+site-specific+radiolabeling+of+antibodies+based+on+catalyst-free+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An enzyme-mediated methodology for the site-specific radiolabeling of antibodies based on catalyst-free click chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 24 (6), 1057-1067 (2013).</li>
<li>Lyons, J. -A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+are+critical+to+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis+by+protein+but+not+by+a+short+encephalitogenic+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">B cells are critical to induction of experimental allergic encephalomyelitis by protein but not by a short encephalitogenic peptide.</a> European Journal of Immunology. 29 (11), 3432-3439 (1999).</li>
</ol>

Het CD19-antilichaam werd geleverd door Horizon Therapeutics.

Dit artikel beschrijft een gestroomlijnde methode voor het afbeelden van humane CD19+ B-cellen in een muismodel van MS met behulp van CD19-PET. Vanwege de heterogene presentatie van MS en de verschillende reacties op behandelingen, kan het beheer ervan in de kliniek een uitdaging zijn en zijn nieuwe benaderingen voor therapieselectie en monitoring hard nodig. PET-beeldvorming zou kunnen dienen als een krachtig hulpmiddel voor het monitoren van ziekteprogressie en individuele respons op B-celafbrekende therapie. Naast MS kan CD19-PET-beeldvorming worden gebruikt om B-celdepletie na behandeling te monitoren bij subtypes van lymfomen en leukemie of andere B-celgemedieerde ziekten. Dit protocol en representatieve gegevens tonen het nut aan van beeldvorming van B-cellen bij neurologische aandoeningen.
Om menselijke CD19+ B-cellen in de context van MS te bestuderen, kozen we voor het B-celafhankelijke MOG1-125 EAE-model 7. Net als andere EAE-modellen vertoont dit model symptomen van progressieve verlamming en infiltratie van immuuncellen in het CZS. Het MOG1-125-model is echter uniek omdat het een B-celgestuurd model is: muizen bevatten verschillende aantallen B-cellen in de subarachnoïdale ruimte in de hersenvliezen, hersenstam, parenchym en ventrikels. Deze lymfocyten kunnen dun verspreid zijn over deze regio's en/of follikelachtige structuren vormen, die ook worden waargenomen bij mensen met MS 8,9. Naast het gebruik van naïeve muizen als controles, kan een complete inductiekit met alleen adjuvans (CFA) van Freund worden gebruikt (d.w.z. een identieke inductie-emulsie als wat wordt gegeven aan EAE-muizen zonder het MOG-eiwit). In het EAE-muismodel is de bloed-hersenbarrière (BBB) disfunctioneel en kunnen grotere entiteiten, zoals antilichamen, passeren. De CD19-mAb radiotracer zal alleen binden en in het CZS blijven als er B-cellen aanwezig zijn; de tracer zal terug in de bloedpool circuleren als er geen B-cellen aanwezig zijn. We hebben dit aangetoond met behulp van gammatelling en ex vivo autoradiografie van CZS-weefsels door perfusie voordat de radioactiviteitsniveaus in de weefsels worden gemeten. We hebben dit ook aangetoond in eerdere publicaties over het gebruik van mAb-gebaseerde PET-radiotracers (d.w.z. immunoPET-beeldvormingsbenaderingen) voor het detecteren van B-cellen in het CZS 1,2.
De DOTA-chelator werd gebruikt omdat deze is gebruikt in klinische PET-beeldvorming met koper-64-gelabelde peptiden en antilichamen, en we streven ernaar de hCD19-mAb te vertalen voor klinische beeldvorming van MS-patiënten. DOTA heeft voldoende bindingsaffiniteit met koper-64 in vivo. De in vivo stabiliteit is erg belangrijk omdat vrij 64Cu naar de lever gaat en het signaal van gebonden radiotracer kan verdoezelen; Het is dus belangrijk om het signaal in de lever te meten om het relatieve signaal ten opzichte van andere organen te berekenen. Spieren worden meestal als controleweefsel beschouwd, maar in het geval van EAE kan er een ontsteking in de spieren aanwezig zijn. De halfwaardetijd van 64Cu is 12,7 uur, wat de DOTA-hCD19-mAb voldoende tijd geeft om zich aan zijn doel te binden en ervoor te zorgen dat het signaal door PET kan worden gemeten. Bij de bereiding van het conjugaat moeten kleinschalige (75-125 μg) testreacties worden uitgevoerd om de hoeveelheid DOTA te bepalen die aan mAb moet worden toegevoegd om de gewenste DOTA/mAb-verhouding te produceren (bijv. een reactie van 6-10-voudig overtollig DOTA-NHS-ester per mol mAb kan een conjugaat van 1-2 DOTA/mAb opleveren). De reactietijd en temperatuur (bijv. 2-4 uur of 's nachts bij 4 °C of kamertemperatuur) hebben ook invloed op de DOTA/mAb-verhouding en moeten worden geoptimaliseerd. Een titratie met niet-radioactief koper kan worden uitgevoerd om het aantal DOTA's per mAb te berekenen; we raden echter aan om MALDI-MS en/of LC-MS uit te voeren voor betrouwbaardere en nauwkeurigere resultaten.
De berekende DOTA/mAb-verhouding is een gemiddelde waarde voor een bepaald monster en er wordt enige variatie verwacht. Voor MALDI worden meerdere shots per monster genomen voor de geconjugeerde en ongeconjugeerde mAbs. Vervolgens berekenen we de verhouding tussen geconjugeerd en ongeconjugeerd om het gemiddelde aantal DOTA/mAb te bepalen. De DOTA/mAb-verhouding is belangrijk omdat te veel chelatoren de binding van antilichamen zullen verstoren en te weinig zal leiden tot inconsistente radiolabeling en een laag signaal. De verhouding tussen batches geconjugeerde batches moet zeer dicht bij elkaar liggen om een consistente signaalintensiteit en bindingskinetiek te behouden; Idealiter zou dezelfde partij conjugaat moeten worden gebruikt voor alle experimenten binnen een bepaald onderzoek. Een veelbelovende techniek om mogelijke effecten op de immunoreactiviteit als gevolg van mogelijke overconjugatie te verminderen, is het gebruik van plaatsspecifieke conjugatie10 waarbij de chelatorconjugatie plaatsselectief is op de zware ketenglycanen van het antilichaam, waardoor de toevoeging van 1 chelator per mAb wordt gegarandeerd.
De reactieomstandigheden voor radioactief labelen moeten worden geoptimaliseerd om de hoogste labelefficiëntie en -opbrengst te garanderen, aangezien verschillen in onder andere antilichaam, DOTA/mAb-ratio en 64Cu-molaire activiteit van invloed zijn op radiolabeling. Door gebruik te maken van de optimale 64Cu tot mAb geconjugeerde verhouding kan de radiotracer zonder zuivering worden gebruikt, waardoor de tijd die nodig is voor radiolabeling en verlies als gevolg van de zwaartekrachtstroomkolom en radioactief verval wordt verkort. Een consistente en betrouwbare molaire activiteit kan ook worden bereikt wanneer dezelfde 64Cu tot mAb-geconjugeerde verhouding wordt gebruikt, wat vooral belangrijk is bij het vergelijken van resultaten tussen meerdere cohorten muizen of beeldvormende onderzoeken. De ITLC-voorwaarden kunnen ook worden aangepast aan elke gebruiker. Indien zuivering noodzakelijk is, moet een aliquot worden opgeslagen voor HPLC- en/of UV/Vis-spectrofotometrie, zodat de molaire activiteit kan worden berekend.
Het is belangrijk op te merken dat het gebruik van radioactief gelabelde antilichamen voor beeldvorming een uitdaging kan zijn. Het is van essentieel belang dat het antilichaam dat voor de radiotracer wordt gebruikt, biologisch inert is om geen fysiologisch effect te hebben. Bovendien, aangezien antilichamen een lange bloedresidentie hebben, moet men lang genoeg wachten op circulatie, binding en klaring van een bepaalde mAb om een geschikt signaal-naar-achtergrond te garanderen zonder afbreuk te doen aan de beeldkwaliteit. Doorgaans is 20-48 uur wachten op een 64 Cu-gelabelde mAb voldoende, maar men moet 2, 4, 6, 12, 24, 48 uur na injectie beelden maken bij het beoordelen van een nieuwe mAb PET-tracer om het beste tijdstip voor beeldvorming in een bepaald knaagdiermodel te bepalen. Hetzelfde geldt voor het verkrijgen van ARG-afbeeldingen met de hoogste signaal-achtergrondverhouding. De representatieve beelden in dit protocol zijn 18-20 uur na injectie genomen, hoewel andere tijdstippen kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de gebruikte radio-isotoop. Verschillende antilichamen die binden aan verschillende epitopen van CD19 zullen verschillende resultaten opleveren en moeten rigoureus worden gekarakteriseerd.
Bij het analyseren van het ruggenmergsignaal is het belangrijk om muizen op hun rug in het scanbed te plaatsen om beweging veroorzaakt door ademhaling te verminderen. Bovendien kan plaatsing op de rug helpen de wervelkolom recht te trekken bij muizen met een verhoogde kromming van de wervelkolom als gevolg van de progressie van EAE-ziekte. Een ander belangrijk aspect waarmee rekening moet worden gehouden bij het detecteren van signalen in de wervelkolom en het ruggenmerg, is het vermijden van het injecteren van MOG1-125 op de flank, aangezien de injectieplaatsen de tracer kunnen binden vanwege de bijbehorende immuunrespons in die gebieden. De nabijheid van de injectieplaats kan de analyse van het ruggenmerg verstoren; Injecties in de borst hebben dus de voorkeur voor de toepassing die hierin wordt beschreven.
De gebruikte beeldanalysetechnieken zijn specifiek voor beeldvorming van het CZS. Een hersenatlastool binnen de beeldanalysesoftware levert reproduceerbare en betrouwbare resultaten op, zolang de registratie van PET en CT nauwkeurig is. Door de semi-geautomatiseerde 3D-hersenatlas te gebruiken en aan te passen aan de schedel van elke muis, kunnen consistente ROI's tussen dieren worden behaald. Aangezien er momenteel geen geautomatiseerde of semi-geautomatiseerde aanpak is voor het analyseren van het signaal in het ruggenmerg, moeten handmatige ROI's worden opgesteld. Met name bij het kwantificeren van CD19+ B-cellen (of elk celtype dat aanwezig is in zowel het beenmerg als het ruggenmerg), is het van cruciaal belang om het signaal dat afkomstig is van de wervelkolom en het beenmerg zoveel mogelijk te elimineren. De reden hiervoor is dat van naïeve muizen bekend is dat ze meer CD19+ B-cellen in hun beenmerg bevatten dan EAE-muizen, waarbij B-cellen de periferie verlaten om het CZS 5,11 te infiltreren. Dit beenmergsignaal kan het ware signaal in het ruggenmerg verdoezelen.
Om het echte ruggenmergsignaal af te bakenen en tegelijkertijd de bijdrage van het signaal van de wervelkolom en het beenmerg te minimaliseren, kan Otsu-drempel van het CT-beeld worden gebruikt om een onveranderlijke ROI voor de wervelkolom te maken. Een aparte ROI van het ruggenmerg kan dan gemakkelijk binnen de wervelkolom worden getrokken. Dezelfde techniek kan ook worden toegepast om het beenmerg in het dijbeen te meten. Dit is een zeer nuttige methode om inzicht te krijgen in de tracerbinding in het ruggenmerg. Vanwege de relatief lage ruimtelijke resolutie van PET en problemen met betrekking tot het gedeeltelijke volume-effect bij het scannen van kleine anatomische gebieden van muizen, maakt het gebruik van aanvullende ex vivo bevestigingstechnieken (bijv. gammatelling, ARG) de validatie van radiotracerbinding in het ruggenmerg mogelijk zonder de aanwezigheid van bloed, hersenvocht of spillover-signaal van de wervelkolom.
Het signaal in het cervicale/thoracale ruggenmerg heeft de neiging om te variëren in de EAE-muizen, afhankelijk van de ernst van de ziekte en het aantal B-cellen dat infiltreert tijdens de adaptieve immuunrespons. Deze variatie in het aantal B-cellen dat infiltreert, evenals de kleine hoeveelheid B-cellen in het CZS in vergelijking met die in het bekken/ruggenmergmerg van naïeve muizen, kan in vivo kwantificering van ruggenmergweefsel bij muizen een uitdaging maken. Gezien de ruimtelijke resolutie van PET in beeldvorming van kleine dieren, kan het signaal van het beenmerg overlopen op het ruggenmergsignaal. Ex vivo biodistributie en autoradiografie die hier zijn voltooid, helpen bij het valideren van het PET-signaal van de wervels versus ruggenmergweefsel. Muizen worden voorafgaand aan dissectie geperfundeerd om eventuele ongebonden tracers in de bloedpool te verwijderen, zodat de resultaten van gammatelling en autoradiografie de tracer weerspiegelen die daadwerkelijk in elk orgaan is gebonden in plaats van de tracer die zich in de bloedpool in dat orgaan bevindt.
Radiotracers circuleren door het bloed, en met name bij antilichaamtracers is er vaak ongebonden radiotracer in het bloed aanwezig gedurende weken na de eerste injectie. Aangezien we de hersenen en het ruggenmerg in beeld brengen, die veel bloedvaten hebben, is het belangrijk om te begrijpen welk deel van het signaal echt te wijten is aan tracerbinding in de hersenen/weefsel van belang versus dat in de bloedpool. Het is dus noodzakelijk om het hersensignaal te delen door het signaal in de hart/bloedpool. In de klinische setting kunnen dezelfde beeldanalysetechnieken van Otsu-drempel van wervels en ROI's van ruggenmergweefsels worden gebruikt voor kwantificering. Gezien de grotere weefselvolumes bij mensen in vergelijking met muizen, zou er aanzienlijk minder impact moeten zijn van gedeeltelijke volume-effecten, wat leidt tot een verbeterde nauwkeurigheid en de noodzaak van ex-vivotechnieken om in-vivobevindingen te bevestigen, teniet doet. Het gebruik van PET in de kliniek stelt clinici in staat om de therapie voor elke patiënt te personaliseren, afhankelijk van hun individuele B-celbelasting.
ARG is met name nuttig voor het verkrijgen van beelden met een hoge resolutie om een nauwkeurigere afbakening mogelijk te maken van de ruimtelijke locatie van tracerbinding in kleine regio's zoals hersenstam en cerebellum. Dezelfde secties en/of aangrenzende secties kunnen worden opgeslagen voor immunohistochemische kleuringen om de aanwezigheid van B-cellen te bevestigen. We hebben eerder CZS-weefsels gekleurd met CD45R/B220 (aanvullende figuur S1) om het aantal B-cellen te correleren met PET- en ARG-signaal 5,9. De kleuring kan vervolgens ruimtelijk worden vergeleken met de ARG-resultaten om te verifiëren dat het radiotracersignaal overeenkomt met het kleuringspatroon. B-cellen kunnen aanwezig zijn in clusters of diffuus door de hersenstam; De PET-gevoeligheid is voldoende hoog om het signaal te meten, wat bemoedigend is voor klinische vertaling. Voor ARG van het ruggenmerg zorgt het verwijderen van het ruggenmerg van de wervels ervoor dat het gemeten signaal het gevolg is van tracerbinding in het ruggenmergweefsel in plaats van het beenmerg en/of bloed, wat PET-beelden kan verdoezelen als gevolg van gedeeltelijke volume-effecten.
Net als ARG maakt ex vivo gammatelling het mogelijk om radioactieve signalen in individuele organen te kwantificeren. Voor deze specifieke techniek is het belangrijk om het natte gewicht van weefsels te meten en ervoor te zorgen dat ze zich op de bodem van hun respectievelijke buizen bevinden voordat de buizen in de gammateller worden geplaatst. De buisjes moeten worden gelabeld met het muisnummer en weefsel, zodat het juiste buisje wordt gebruikt; De buis wordt vervolgens gewogen op een gekalibreerde balans en organen worden ingebracht tot op een tiende van een microgram (0,0001 mg). Sommige weefsels zijn extreem klein en het verschil in de buismassa ervoor en erna zal in de orde van grootte van 0,0001 mg liggen. De weefsels moeten onmiddellijk na dissectie worden gewogen om vochtverlies te voorkomen, wat resulteert in een lagere massa. Na het wegen moeten de hersenen en de ruggenmergbuizen worden gevuld met PBS om te voorkomen dat ze uitdrogen voordat deze weefsels worden ingevroren voor ARG.

MS is een immuungemedieerde neurologische aandoening; De unieke presentatie bij elke patiënt kan de behandeling uitdagend maken voor zowel patiënten als clinici. De ziekte zelf wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van demyeliniserende laesies en infiltratie van immuuncellen in de hersenen en het ruggenmerg, wat resulteert in fysieke en cognitievestoornissen. Het traditionele paradigma dat MS een T-cel-gemedieerde ziekte is, werd voor het eerst uitgedaagd in een baanbrekende fase II klinische studie van rituximab3, een therapie gericht op de CD20+ subset van B-cellen. Sindsdien zijn er aanvullende B-celtherapieën ontwikkeld die zich richten op CD194, een pan-B-celbiomarker die tot expressie wordt gebracht op een breder scala aan B-cellen, wat zowel diagnostisch als therapeutisch voordelig kan zijn. Bovendien bieden bestaande methoden om de werkzaamheid van de behandeling te beoordelen (d.w.z. het monitoren van het aantal recidieven en magnetische resonantiebeeldvorming [MRI]-activiteit) geen vroege metingen van respons, waardoor patiënten een aanzienlijk risico lopen op schade aan het CZS als gevolg van suboptimale therapieselectie en -optimalisatie. Daarom is er een kritieke behoefte aan strategieën om specifieke immuuncellen, zoals CD19+ B-cellen, in realtime te monitoren in het CZS en de periferie van MS-patiënten.
PET-beeldvorming is een robuuste beeldvormingstechniek die in vivo visualisatie van het hele lichaam mogelijk maakt van een bepaald doelwit dat van belang is, zoals CD19. Terwijl bloedafnames, registraties van terugvalpercentages en laesiemonitoring via MRI momentopnamen opleveren van de werkzaamheid van de behandeling, kan PET-beeldvorming onderzoekers en clinici in staat stellen de effectiviteit van een therapie over het hele lichaam te controleren. Deze proactieve benadering van therapeutische monitoring stelt clinici in staat om de effectiviteit van medicatie in realtime te beoordelen, waardoor snelle aanpassingen mogelijk zijn als dat nodig is. Het monitoren van de locatie en dichtheid van celpopulaties die geassocieerd zijn met ziekte maakt het ook mogelijk om de ernst van de ziekte longitudinaal te beoordelen met behulp van patiëntspecifieke anatomische informatie. Het is dus essentieel om reproduceerbare analysemethoden vast te stellen om op betrouwbare wijze het volledige potentieel van PET-beeldvorming in klinische en preklinische omgevingen te benutten.
Dit artikel beschrijft methoden (Figuur 1) voor het uitvoeren van PET-beeldvorming, ex vivo gammatelling en autoradiografie (ARG) van CD19+ B-cellen met een 64 Cu-gelabeld anti-humaan CD19 monoklonaal antilichaam (mAb), bekend als 16C4-TM (64Cu-hCD19-mAb), in het experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) muismodel van MS geïnduceerd in transgene muizen die humaan CD19 (hCD19) tot expressie brengen met behulp van humaan recombinant myeline-oligodendrocytglycoproteïne 1-125 (MOG1-125). We bieden ook methoden om de binding van radiotracers nauwkeurig en reproduceerbaar te beoordelen in de hersenen en het ruggenmerg, beide kritieke plaatsen van pathogenese die vaak ernstig worden aangetast in dit en andere neurodegeneratieve modellen. Deze technieken maken niet-invasief onderzoek naar de rol van B-cellen in ziektepathologie mogelijk en hebben het potentieel om klinisch te worden vertaald om de werkzaamheid van anti-B-celtherapieën bij MS te beoordelen.

<table><tbody><tr><td>0.5 mL 50 kDa MWCO Centrifugal filter</td><td>MiliporeSigma</td><td>UFC505008</td><td>centrifugal filter</td></tr><tr><td>64Cu-CuCl3</td><td>Washington University in St. Louis; University of Wisonsin, Madison; of een andere leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AR-2000 Radio-TLC Imaging Scanner</td><td>Eckert & Ziegler</td><td>AR-2000</td><td></td></tr><tr><td>Autoradiografie cassette</td><td>Cole Palmer</td><td>EW-21700-34</td><td>Aluminium, 8" x 10"</td></tr><tr><td>Autoradiografie film</td><td>&nbsp;GE Life Sciences</td><td>28-9564-78</td><td>Storage Phosphor Screen BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 x 25 cm, alleen scherm</td></tr><tr><td>Butterfly naaldkatheter</td><td>SAI Infusion Technologies</td><td>BLF-24</td><td></td></tr><tr><td>DOTA-NHS-ester</td><td>Macrocyclics</td><td>B-280</td><td></td></tr><tr><td>EAE Inductie Kit</td><td>Hooke Laboratories</td><td>EK-2160</td><td></td></tr><tr><td>Geigerteller</td><td>Ludlum</td><td>14C</td><td></td></tr><tr><td>GNEXT PET/CT Scanner</td><td>Sofie</td><td>GNEXT</td><td></td></tr><tr><td>Hidex automatische Gammateller</td><td>Hidex</td><td>AMG</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Kolom</td><td>Phenomenex</td><td>&nbsp;00H-2146-K0</td><td>5 &mu;m SEC-s3000 400 &Aring;, 300 x 7.8 mm</td></tr><tr><td>Illustra NAP-5 kolom</td><td>Cytiva</td><td>17085301</td><td>DNA zwaartekrachtkolom</td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td>ARG-analysesoftware</td></tr><tr><td>Low Protein Binding Collectiebuizen (1,5 mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI90410</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Lite Spectrofotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>840281400</td><td>UV-Vis micro/nano-spectrofotometer</td></tr><tr><td>PCR buisjes 0,2 mL, voor DNA-kwaliteit</td><td>Eppendorf</td><td>30124707</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon fosforbeeldscherm 9410</td><td>GE Healthcare</td><td>8149-30-9410</td><td></td></tr><tr><td>VivoQuant</td><td>Invicro</td><td>Versie 4 Patch 3</td><td>PET-analysesoftware; moet hersenatlas add-on aanschaffen</td></tr><tr><td>Zeba Spin Desalting Kolommen, 7K MWCO, 0,5 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI89882</td><td>Ontzoutingskolom</td></tr></tbody></table>

beeldvorming van cd19+ b-cellen in een experimenteel muismodel met auto-immuun encefalomyelitis met behulp van positronemissietomografie

Imaging CD19+ B Cells in an Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Mouse Model using Positron Emission Tomography

Multiple sclerose (MS) is de meest voorkomende demyeliniserende ziekte van het centrale zenuwstelsel (CZS) die jonge volwassenen treft, wat vaak resulteert in neurologische stoornissen en invaliditeit naarmate de ziekte vordert. B-lymfocyten spelen een complexe en cruciale rol in de pathologie van MS en zijn het doelwit van verschillende therapieën in klinische onderzoeken. Momenteel is er geen manier om patiënten nauwkeurig te selecteren voor specifieke anti-B-celtherapieën of om de effecten van deze behandelingen op de B-celbelasting in het CZS en perifere organen niet-invasief te kwantificeren. Positronemissietomografie (PET)-beeldvorming heeft een enorm potentieel om zeer specifieke, kwantitatieve informatie te verschaffen over de in vivo spatiotemporele verdeling en belasting van B-cellen bij levende proefpersonen.
Dit artikel rapporteert methoden voor het synthetiseren en gebruiken van een PET-tracer die specifiek is voor menselijke CD19+ B-cellen in een gerenommeerd B-celgestuurd muismodel van MS, experimentele auto-immuunencefalomyelitis (EAE), dat wordt geïnduceerd met humaan recombinant myeline-oligodendrocytglycoproteïne 1-125. Hier worden geoptimaliseerde technieken beschreven om CD19+ B-cellen in de hersenen en het ruggenmerg te detecteren en te kwantificeren met behulp van in vivo PET-beeldvorming. Daarnaast rapporteert dit artikel gestroomlijnde methoden voor ex vivo gammatelling van ziekterelevante organen, waaronder beenmerg, ruggenmerg en milt, samen met autoradiografie met hoge resolutie van CD19-tracerbinding in CZS-weefsels.

De hCD19-mAb was DOTA-geconjugeerd en radioactief gelabeld met 64Cu, zoals weergegeven in figuur 2. EAE en naïeve muizen ondergingen 18-24 uur na injectie een PET/CT-scan (Figuur 3) met 64Cu-DOTA-hCD19-mAb. PET/CT-beelden werden mede geregistreerd met behulp van de PET-analysesoftware en de CZS-weefsels werden geanalyseerd met behulp van handmatige ROI's of een semi-geautomatiseerde 3D-hersenatlas. De binding aan radiotracers in ROI's (figuur 4) was hoger bij EAE-muizen dan bij naïeve muizen. Ex vivo gammatelling en ARG toonden een verhoogde binding in het ruggenmerg (zowel lumbale als cervicale thoracale segmenten) en hersenen (alleen ARG) van EAE-muizen in vergelijking met naïeve muizen (Figuur 5 en Figuur 6). Ex vivo gammatelling van geperfuseerde muizen toonde ook een verminderde radiotracerbinding in perifere organen, waaronder milt, dijbeen en beenmerg (Figuur 5), consistent met B-cellen die de periferie verlaten en het CZS infiltreren in dit EAE-model.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig02.jpg"> Figuur 2: Conjugatie- en radiolabelingschema voor het genereren van 64 Cu-gelabeld mensspecifiek CD19 monoklonaal antilichaam, 16C4-TM mAb (64Cu-DOTA-hCD19-mAb), naast kwaliteitscontrolegegevens. (A) Reactie van DOTA-NHS-ester met hCD19 monoklonaal antilichaam om hCD19-DOTA-conjugaat te produceren (niet op schaal) en radiolabeling met 64 Cu-CuCl3 om 64Cu-DOTA-hCD19-mAb te produceren. (B) Representatieve ITLC-chromatograaf. De piek op 40-60 cm is het radioactief gelabelde antilichaam; ongebonden 64Cu-CuCl3 reist met de mobiele fase mee en zou aanwezig zijn van 200 tot 240 cm. Er is geen detecteerbare vrije 64Cu-CuCl3 in deze chromatograaf. (C) De specificaties voor kwaliteitscontrole van het radioactief gelabelde antilichaam. Afkortingen: DOTA-NHS-ester = 1,4,7,10-tetraazacyclododecaan-1,4,7,10-tetraazijnzuur mono-N-hydroxysuccinimide-ester; ITLC/HPLC = onmiddellijke dunnelaagchromatografie/hoogwaardige vloeistofchromatografie; MALDI/LC-MS = matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie/vloeistofchromatografie-massaspectrometrie; CPM = aantal per minuut. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig03.jpg"> Figuur 3: Foto's die laten zien hoe muizen in een 3D-geprint bed in de PET-scanner kunnen worden vastgezet om hoogwaardige beeldvorming van het ruggenmerg en de hersenen mogelijk te maken en tegelijkertijd beweging te minimaliseren. (A) 3D-geprint scannerbed met vier muizen (ook bekend als "muizenhotel") uitgerust met verwarmingselementen en anesthesieslangen. (B) Verdoofde muizen in rugligging om de rechtheid van de wervelkolom te maximaliseren; De bedpositie van elke muis wordt geregistreerd. (C) Muizen stevig over hun hoofd geplakt om beweging in de hersenen en over de buik te minimaliseren om beweging van de ademhaling te minimaliseren, zonder de ademhaling te beïnvloeden. (D) Muisbed dat in de scanner is geplaatst en op het scanbed is geplakt. De anesthesieslang werd van de scanner naar het bed gebracht en de isofluraan werd op 2% gezet. De ademhaling van de muis werd gecontroleerd om zeker te zijn van het juiste isofluraanniveau voordat de scannerdeur werd gesloten. Afkorting: PET = Positron emissie tomografie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig04.jpg"> Figuur 4: Ruggenmergbeeld en hersenanalyse en resultaten met behulp van PET-analysesoftware . (A) i) ROI's (roze en bruin ) getekend op de wervelkolom om lumbale van de borst- en halswervels te scheiden en het beeld voor te bereiden op Otsu-drempels. ii ) Ruggenwervels (turkoois en rood) werden gesegmenteerd met behulp van Otsu-drempels. iii ) Wervels werden vervolgens onveranderlijk gemaakt in het 3D ROI-menu en het ruggenmerg werd verdeeld in cervicale/thoracale (paarse) en lumbale (marine) ROI's. iv) De vertebrale ROI werd verwijderd, waardoor de ROI's van het ruggenmerg en de representatieve hersenatlas werden toegepast. (B) Representatieve analyse van PET-resultaten van verschillende CZS-regio's weergegeven als %ID/g genormaliseerd naar de ROI van het hart in elk dier. PET-acquisitie was een statische scan van 10 minuten via PET/CT-beeldvorming. Hersengebieden gekwantificeerd met behulp van een semi-geautomatiseerde hersenatlasbenadering, weergegeven in paneel A. iv) Representatieve resultaten tonen een significante of tendens in de richting van een significante toename van tracerbinding in de hersenen en het thoracale ruggenmerg. Statistieken uitgevoerd met behulp van de t-toets van de student (*: p < 0,0332). Afkortingen: PET = Positron emissie tomografie; ROI's = regio's van belang; CZS = centraal zenuwstelsel; CT = computertomografie; %ID/g = percentage geïnjecteerde dosis per gram weefsel; EAE = experimentele auto-immuun encefalomyelitis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig05.jpg"> Figuur 5: Representatieve kwantificering van ex vivo gammatelling in verschillende organen bij EAE en naïeve muizen, uitgedrukt als %ID/g. Na de PET-scan werden muizen geperfundeerd met PBS om de radiotracer in het bloed te verwijderen, vrij of gebonden aan in het bloed levende CD19 + B-cellen, en organen werden snel ontleed en gewogen om een nauwkeurig gewicht van elk orgaan te hebben. Tracerbinding is significant verminderd in de milt en het beenmerg bij EAE-muizen in vergelijking met naïeve muizen. Verhoogde radiotracerbinding wordt waargenomen in zowel de lumbale als de cervicale/thoracale ruggenmergsegmenten van EAE-muizen. De hersenen vertonen geen significante toename van het radiotracersignaal, hoewel het neigt naar een significante toename. Statistieken uitgevoerd met behulp van de t-toets van de student (*: p < 0,0332; ****: p < 0,0001). Afkortingen: PET = Positron emissie tomografie; %ID/g = percentage geïnjecteerde dosis per gram weefsel; EAE = experimentele auto-immuun encefalomyelitis; PBS = fosfaatgebufferde zoutoplossing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig06.jpg"> Figuur 6: Ex vivo ARG-beelden tonen 64Cu-DOTA-hCD19-mAb-binding in sagittale hersensecties en hele ruggenmerg van EAE in vergelijking met naïeve muizen. Digitale fosforopslagfilms werden gescand met behulp van een fosforimager nadat ze waren blootgesteld aan radioactieve weefselmonsters gedurende ongeveer 10 halfwaardetijden (127 uur of 5 dagen). De resulterende beelden onthullen een visueel hoger signaal in de hersenen van EAE-muizen in vergelijking met hersensecties van naïeve muizen, wat te verwachten is vanwege de regio's waarvan bekend is dat ze B-cellen bevatten in dit model5. In het bijzonder is er een verhoogd tracersignaal in de hersenstam, het cerebellum en de ventrikels van de hersensecties van EAE-muizen. Deze toename van het signaal voor EAE-hersensecties van muizen weerspiegelt wat werd gevonden in de hierboven beschreven PET-kwantificering van het hele brein. Evenzo is er een toename van radiotracerbinding in zowel de cervicale/thoracale als lumbale ruggenmergsegmenten in vergelijking met naïeve ruggenmerg, wat een weerspiegeling is van wat werd gevonden met behulp van ex vivo gammatelling. Afkortingen: PET = Positron emissie tomografie; EAE = experimentele auto-immuun encefalomyelitis; Vent = ventrikels; Cb = cerebellum; BS = hersenstam; TSc = thoracale en cervicale ruggenmerg gecombineerd; LSc = lumbaal ruggenmerg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende figuur S1: Kleuring van CZS-weefsels van naïef en EAE-muizenhersenweefsel met CD45R/B220. B-cellen worden waargenomen in hersenstam, hersenvliezen en witte stof van EAE-muizen (n = 7 EAE, n = 5 naïeve muizen, gemiddeld vier plakjes per dier). Dit cijfer is van 5. Schaalbalken = 5 mm (lage vergroting [1x]) in sagittale hersenbeelden, 100 μm (hoge vergroting [20x]) in hersenstam, hersenvliezen en cerebellaire witte stof. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/Suppl%20Fig%201.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Dit artikel beschrijft de methodologie voor het radioactief labelen van een mensspecifiek anti-CD19 monoklonaal antilichaam en hoe het kan worden gebruikt om B-cellen in het centrale zenuwstelsel en perifere weefsels van een muismodel van multiple sclerose te kwantificeren met behulp van in vivo PET-beeldvorming, ex vivo gammatelling en autoradiografiebenaderingen.

Beeldvorming van CD19+ B-cellen in een experimenteel muismodel met auto-immuun encefalomyelitis met behulp van positronemissietomografie

Multiple sclerosis (MS) is the most common demyelinating central nervous system (CNS) disease affecting young adults, often resulting in neurological ...

Deze techniek maakt gebruik van PET-beeldvorming om de in vivo distributie en dynamiek van B-cellen in het centrale zenuwstelsel op te helderen. Onze aanpak is gunstig voor het bestuderen van neurologische aandoeningen, waarbij het aangetaste ruggenmerg de analyse uitdagender maakt. Er zijn dus een paar belangrijke voordelen aan onze techniek.Ten eerste hebben we een nieuwe tool gemaakt om een pan-B-celbiomarker te volgen waarmee we een reeks B-celsubsets kunnen vastleggen en in vivo kunnen visualiseren. Ten tweede maakt onze ruggenmerganalysemethode een zeer nauwkeurige en reproduceerbare kwantificering van PET-signalen in deze regio mogelijk. Het mooie van onze techniek is dat het ziekte-agnostisch is.Het kan worden gebruikt van preklinische tot klinische PET-beeldvorming in elk scenario, waarbij B-cellen en/of het ruggenmerg van belang zijn. 18 tot 24 uur na het radioactief labelen en injecteren van het antilichaam in de muis, bereidt u de muis voor op scannen door ooggel op de ogen aan te brengen. Zorg ervoor dat het scanbed met vier muizen is uitgerust met een verwarmingskussen met isofluraan ingesteld van 1.5 tot 2%Plaats de muis in rugligging op het scanbed en trek voorzichtig aan de muisstaart om de ruggengraat recht te maken.Zodra de muis in rugligging ligt, plakt u hem stevig vast met zachte microscooptape over het hoofd en de buik om de beweging van de ademhaling te minimaliseren. Noteer de scanpositie voor elke muis in een labnotitieboek. Nadat u de eerste groep hebt vastgezet, sluit u het bed en controleert u de plaatsing van het bed door een CT-scan uit te voeren.Klik op CT Center Field of View en zodra het bed op zijn plaats staat, voert u de CT-testscan uit om er zeker van te zijn dat de plaatsing correct is. Herhaal dit totdat de bedpositie bevredigend is. Plak een kleine witte tape op het scannerbed om de juiste plaatsing van het bed voor de rest van het onderzoek te markeren.Open het menu Motion Controller en klik op PET Center Field of View om de muizen in de PET-ring te verplaatsen. Zodra het bed zich in de PET-ring bevindt, start u de scanreeks door op Uitvoeren te klikken en wacht u tot de scanner de PET-scan automatisch voltooit en gaat u van de PET-ring naar de CT voor CT-acquisitie. Aangezien experimentele auto-immuun encefalomyelitis, of EAE, muizen een uitgesproken kromming van de wervelkolom hebben als gevolg van ziekteprogressie, helpt het scannen van hen terwijl ze op hun rug liggen om de wervelkolom recht te trekken.Maak een incisie langs de dorsale zijde van het dier en verwijder de huid en vacht om de wervelkolom bloot te leggen. Snijd langs drie dwarsvlakken door de wervelkolom in de nek, direct onder de ribbenkast en aan de bovenkant van het bekken om de lumbale van de cervicale en thoracale regio's te scheiden. Verwijder voorzichtig de gesegmenteerde wervelkolom om twee stukken te krijgen, lumbale en cervicale thoracale.Isoleer vervolgens de lumbale wervelkolom door de wervelkolom voorzichtig vanaf het bekkenuiteinde af te knippen totdat het lumbale ruggenmerg zichtbaar is. Om het lumbale ruggenmerg te verdrijven, gebruikt u een sliptipspuit gevuld met PBS en maakt u met duim en wijsvinger een afdichting tussen de spuit en de wervelkolom. Duw de PBS voorzichtig door de spuit om het ruggenmerg op een absorberend kussentje te verdrijven en herhaal dit voor het cervicale thoracale ruggenmerg door de spuit vanaf de cervicale zijde in te brengen.Plaats de ruggenmergweefsels in een gammatelbuis. Noteer het drooggewicht en voeg PBS toe om ervoor te zorgen dat het weefsel zich op de bodem van de buis bevindt om uitdroging te voorkomen. Plaats de buis op ijs totdat hij klaar is om te tellen.Als u wilt beginnen met de analyse van interessegebieden in het ruggenmerg, opent u de tool 3D-interessegebied in het navigatiemenu. Gebruik onder de kop Interessegebieden het plusteken onder aan het menu om zes interessegebieden te maken: lumbale interesseregio, cervicale thoracale interesseregio, lumbaal skelet, thoracaal skelet, lumbale ruggenmerg, thoracale ruggenmerg, thoracale ruggenmerg. Om visuele interferentie van het PET-signaal te voorkomen, klikt u op F3 om de PET uit te schakelen.Ga naar de bovenkant van de 3D-operator voor interessegebieden en klik op de effen stip rechts van het cursorsymbool om de 3D-tekenmodus en het menu Erode/Dilate te openen. Selecteer Bol en wijzig de grootte in 20 pixels. Stel op dezelfde manier dilate in op plus vijf.Voordat u verder gaat, gaat u naar de onderkant van het menu en zorgt u ervoor dat het lumbale gebied van belang is geselecteerd. Zoek op de CT de L6-wervel van de wervelkolom. Begin met één wervel boven L6 en teken een ruw lumbaal gebied dat van belang is over de vijf wervels boven de heupen.Schakel vervolgens over naar het cervicale thoracale gebied van belang en traceer de rest van de wervelkolom naar de basis van de schedel. Nadat u de algemene interessegebieden hebt getekend, gaat u naar de bovenkant van de operator en selecteert u het menu Segmentatie-algoritmen. Selecteer in het vervolgkeuzemenu Otsu-drempels, selecteer vervolgens het lumbale gebied dat van belang is voor de invoer en zorg ervoor dat het lumbaal skelet onder aan het menu wordt gekozen.Zorg ervoor dat in het vervolgkeuzemenu naast Afbeelding de CT-scan is geselecteerd, hier aangegeven met het cijfer nul. Klik op Toepassen en herhaal de procedure voor het cervicale thoracale gebied van belang en het thoracale skelet. Nadat u Otsu-drempels hebt gebruikt om de skeletgebieden van belang te maken, keert u terug naar het menu Navigatie en verwijdert u het interessegebied, of vinkt u de H-kolom aan voor zowel de ruwe lumbale als de cervicale thoracale gebieden van belang om ze te verbergen.Vink de I-kolom aan voor beide skeletgebieden die van belang zijn, zodat ze niet kunnen worden bewerkt. Ga ten slotte terug naar de bovenkant van de 3D-operator voor interessegebieden en ga naar het menu 3D Paint om de betreffende dwarsmerggebieden te tekenen. Selecteer het gereedschap Bol opnieuw en traceer het ruggenmerg in het skelet voor zowel de lumbale als de thoracale romp, waarbij u ervoor zorgt dat het juiste interessegebied onder aan het menu wordt geselecteerd.Om een interessegebied te wissen, klikt u op Command/Control en tekent u over het te wissen gedeelte. Controleer het interessegebied van het ruggenmerg vanuit alle drie de vlakken om er zeker van te zijn dat er geen interessegebied buiten de wervelkolom wordt getekend. Als het PET-signaal is uitgeschakeld, drukt u op F3 nadat de betreffende dwarslaesie is getekend om de PET weer in te schakelen, of selecteert u de Visual Controller en klikt u op de PET-balk.Ga terug naar het menu Navigatie. Klik op het rasterpictogram om de tabel weer te geven. Kopieer de tabel naar spreadsheetsoftware en sla het bestand op.PET-beeldvorming toonde verhoogde radiotracerbinding in de hersenen en het thoracale ruggenmerg van EAE-muizen in vergelijking met de naïeve muizen. Ex vivo gammatelling toonde een verhoogde binding in zowel lumbale als cervicale thoracale spinale segmenten en de hersenen van EAE-muizen in vergelijking met naïeve muizen. Ex vivo autoradiografiebeelden toonden een verhoogde radiotracerbinding in sagittale hersensecties, met name in de hersenstam, het cerebellum en de ventrikels van EAE-muizen in vergelijking met naïeve muizen.Evenzo werd een verhoogde radiotracerbinding waargenomen in zowel de cervicale, thoracale als lumbale ruggenmergsegmenten van EAE-muizen in vergelijking met naïeve ruggenmerg. Na PET-beeldvorming en gammatelling kunnen we de relatie tussen PET-signaal en het doelwit van belang onderzoeken door middel van moleculair-biologische technieken, zoals flowcytometrie en immunohistochemie. Onze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers om vragen te stellen over de in vivo rol van B-cellen in meerdere ziektegebieden, waaronder beroerte, multiple sclerose, andere auto-immuunziekten en kanker.

imaging-cd19-b-cells-an-experimental-autoimmune-encephalomyelitis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

The video demonstrates the induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in a mouse model by injecting a combination of myelin oligodendrocyte glycoproteins and inactivated Mycobacterium tuberculosis. The model enables researchers to study disease mechanisms and test therapeutic interventions.

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in a Mouse Model

This video demonstrates the method of inducing experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) by injecting myelin-derived peptides with an adjuvant to activate autoreactive T cells, which migrate to the brain. Pertussis toxin is administered to increase blood-brain barrier permeability, allowing these T cells and other immune cells to enter the brain. These immune cells cause demyelination, leading to impaired nerve transmission and development of EAE.

Generation of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in a Mouse Model

In this video, a mouse model of multiple sclerosis is established using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). The mouse is injected with an emulsion containing a neuronal peptide and an adjuvant, triggering an immune response that activates autoreactive T cells. This is followed by an injection of pertussis toxin (PTX) to increase blood-brain barrier permeability, allowing the autoreactive T-cells to infiltrate the brain. This infiltration initiates a signaling cascade that...

Dit manuscript beschrijft de methoden voor inductie en scoren van het experimentele auto-immuunencefalomyelitis (EAE) model, samen met de beoordeling van immuunceldistributie en mRNA-cytokineniveaus in lymfeklieren, milt, bloed en ruggenmerg met behulp van flowcytometrie en kwantitatieve PCR, respectievelijk, in verschillende fasen van de ziekte.

Inductie van experimentele auto-immune Encefalomyelitis in Muizen en evaluatie van de ziekte-afhankelijke Verdeling van immuuncellen in verschillende weefsels

De getoonde techniek voor in vivo bioluminescentie levende en nabije infrarood beeldvorming van optische neuritis en encefalitis bij de experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE) model voor multiple sclerose in SJL / J muizen.

Bioluminescentie en nabij-infrarood beeldvorming van oogzenuwontsteking en hersenontsteking in de EAE Model van Multiple Sclerose in Muizen

Hier presenteren we protocollen om te onderzoeken op bijzondere waardeverminderingen van de neurovasculaire eenheid tijdens de experimentele autoimmune encefalomyelitis in vivo. Wij ingaan specifiek op het bepalen van de bloed - hersenbarrière permeabiliteit en gelatinase activiteit die betrokken zijn bij migratie van leukocyten in de glia-limitans.

Visualiseren van de waardevermindering van het endotheel en gliale belemmeringen van de neurovasculaire eenheid tijdens de experimentele Autoimmune encefalomyelitis In Vivo

Dit manuscript presenteert een protocol om actieve experimentele auto-immuunenceomyelitis (EAE) bij muizen te induceren. Een methode voor de isolatie en karakterisering van de geïnfiltreerde lymfocyten in het centrale zenuwstelsel (CNS) wordt ook gepresenteerd om te laten zien hoe lymfocyten betrokken zijn bij de ontwikkeling van cns auto-immuunziekte.

Flow Cytometrische Analyse van lymfocyten infiltratie in het centrale zenuwstelsel tijdens experimentele auto-immuunenceomyelitis

Dit protocol heeft tot doel in vivo myelineveranderingen (demyelinatie en remyelinatie) te monitoren door positronemissietomografie (PET) beeldvorming in een diermodel van multiple sclerose.

Positron Emissie Tomography Imaging voor In Vivo Meten van Myeline Inhoud in de Lysolecithine Rat Model van Multiple Sclerose

Dit protocol beschrijft de methodologie voor het niet-invasief volgen van T-cellen die genetisch gemanipuleerd zijn om chimere antigeenreceptoren in vivo tot expressie te brengen met een klinisch beschikbaar platform.

Dynamische beeldvorming van chimere antigeenreceptor T-cellen met [18F]Tetrafluoroboraat positronemissietomografie/computertomografie

Het huidige protocol beschrijft de inductie van experimentele auto-immune encefalomyelitis in een muismodel met behulp van myeline oligodendrocytenglycoproteïne en het monitoren van het ziekteproces met behulp van een klinisch scoresysteem. Experimentele auto-immuun encefalomyelitis-gerelateerde symptomen worden geanalyseerd met behulp van muis femur micro-computertomografie analyse en open veld test om het ziekteproces uitgebreid te beoordelen.

Inductie- en diverse beoordelingsindicatoren van experimentele auto-immuun encefalomyelitis

Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) is een diermodel van multiple sclerose (MS), dat met de menselijke ziekte een robuuste humorale auto-immuunrespons deelt. Hier rapporteren we een eenvoudig en flexibel ELISA-protocol om auto-antilichamen in het serum van EAE-geïmmuniseerde muizen te kwantificeren.

Kwantificering van autoreactieve antilichamen bij muizen bij experimentele auto-immuunencefalomyelitis

Leer PET-beeldvorming van CD19+ B-cellen in het centrale zenuwstelsel met behulp van een muismodel voor experimentele auto-immuun encefalomyelitis. Deze methode biedt nauwkeurige kwantificering van immuuncelgedrag.

Beeldvorming van CD19+ B-cellen in een experimenteel muismodel met auto-immuun encefalomyelitis met behulp van positronemissietomografie (Video) | JoVE Journal

Beeldvorming van CD19⁺ B-cellen in een experimenteel muismodel met auto-immuun encefalomyelitis met behulp van positronemissietomografie

Meer video's verkennen