Isolatie, karakterisering en therapeutische toepassing van extracellulaire blaasjes uit gekweekte menselijke mesenchymale stamcellen

Deze procedure voorzag in de behoefte aan eenvoudige en betrouwbare mesenchymale stamcel-afgeleide extracellulaire blaasjesverzameling, en van toepassing bij de vertaling van onderzoek. Het verzamelen van extracellulaire blaasjes door differentiële centrifugatie is eenvoudig, gemakkelijk schaalbaar en reproduceerbaar, wat nuttig zal zijn voor het veld. Extracellulaire blaasjes onduidelijk}van onduidelijk}mesenchymale stamcel is een onduidelijke}toepassing in moderne ziektebehandelingen.

Ik zal niet bang zijn voor fouten. Deze bediening is eenvoudig en gemakkelijk te leren. Er zijn veel details in dit eenvoudige programma die beter kunnen worden gepresenteerd via video.

Om te beginnen, kweek de mesenchymale stamcellen tot meer dan 90% samenvloeiing. Vervang het kweekmedium in elk gerecht door 8 ml aangevulde alfa-MEM. Na 48 uur kweek moeten de cellen gelijkmatig worden gegroeid om het kweekmedium volledig te verzamelen in centrifugebuizen van 50 ml.

Centrifugeer vervolgens het kweekmedium op 800 x g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Breng het supernatant over naar 1,5 ml conische buizen om de celfragmenten en cellulair puin te verwijderen. Centrifugeer het supernatant op 16.000 x g gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius.

Gebruik een pipet om de suspensie over te brengen naar ultracentrifugebuizen. Centrifugeer vervolgens op 150.000 x g gedurende twee uur bij vier graden Celsius. Resuspendeer de microvesicle pellet in 50 uL PBS per gerecht.

Gooi het supernatant weg en verzamel het residu, dat exosomen zijn. Resuspendeer de exosomen uit zeven schotels van cellen in 50 uL PBS. Verdun in een buis van 15 ml 1 uL extracellulaire blaasjes in 1.499 uL PBS en meng.

Start vervolgens de compatibele software voor de trackinganalyzer. Vul de monstercel met gedestilleerd water en laat het instrument vervolgens de celcontrole starten. Kalibreer het instrument met een voorbereide standaardoplossing.

Zorg ervoor dat het deeltjesaantal dat wordt weergegeven op de softwaredetectie-interface tussen 50 en 400 ligt, bij voorkeur rond de 200, en klik op OK. Spoel vervolgens de monstercel af met 5 ml gedestilleerd water. Spoel vóór de monsteranalyse het kanaal met 1 ml gedestilleerd water.

Zorg ervoor dat het deeltjesaantal dat wordt weergegeven op de softwaredetectie-interface kleiner is dan 10. In een conische buis van 1,5 ml resuspendeert u de extracellulaire blaasjes met 250 uL PBS. Bereid in een andere conische buis van 1,5 ml de werkoplossing van de PKH26-kleurstof.

Meng de geresuspendeerde extracellulaire blaasjes met de werkoplossing. Laat het vijf minuten op kamertemperatuur staan en voeg vervolgens 500 uL EV-uitgeputte FBS toe om de reactie te stoppen. Voor microvesicles, centrifugeer op 16.000 x g gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius.

Gooi het supernatant weg. Voeg 1 ml PBS toe om het residu af te spoelen. Centrifugeer opnieuw en gooi het supernatant weg om de ongebonden kleurstof te verwijderen.

Voor microvesicles, centrifugeer op 16.000 x g gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Resuspensie van het residu met 200 uL PBS. Laat 20 uL suspensie op de dia vallen en observeer deze onder een fluorescentiemicroscoop.

Resuspendeerde extracellulaire blaasjes in 200 uL PBS en meng vervolgens met heparine-oplossing met een volumeverhouding van 10: 1. Plaats de muis in het beeldvormingssysteem van de caudadale ader. Druk op de schakelaar om de hendel op te tillen.

Voer met behulp van een staartaderillustrator een systematische injectie van de extracellulaire blaasjessuspensie door de staartader uit. Analyse van de deeltjesgrootteverdeling met behulp van NTA toonde aan dat de grootte van exosomen uit menselijke mesenchymale stamcellen varieerde van 40 tot 335 nm, met een piekgrootte van ongeveer 100 nm. Ook varieerde de grootte van microvesicles van 50 tot 445 nm, met een piekgrootte van 150 nm.

Morfologische karakterisering van exosomen toonde aan dat ze een typische bekervorm vertoonden. Extracellulaire blaasjes werden efficiënt gelabeld door PKH26, wat werd waargenomen door de bruto weergave als gelabelde pellets, evenals door fluorescerende microscopie. De operator moet opletten tijdens het verzamelen van bovennatuurlijke middelen, omdat cellen gelijkmatig moeten worden geblazen om de vrijgekomen EV's die in de onduidelijke mesenchymale stamcellen worden vastgehouden, volledig te verzamelen.

Om het succes van de injectie te verifiëren, kan in vivo beeldvorming van biodistributie van fluorescentie-gelabelde EV's of bevroren secties van specifieke weefselplaatsen van transplantatie worden uitgevoerd.