Embryo-injectietechniek voor genbewerking in de zwartpootteek, Ixodes scapularis

Dit is het eerste embryo-injectieprotocol voor een Chelicerata-soort. De mogelijkheid om tekenembryo's te injecteren zal veel onderzoekslijnen openen, met name studies naar de functie van tekengenen en interacties tussen tekenpathogenen. Deze techniek maakt toekomstig werk aan functionele studies van tekengenen mogelijk en biedt een basis voor tekenpopulatiecontrole door gebruik te maken van gene drive-systemen.

Deze methode zal het begrip van de interactie tussen teken en de pathogenen die ze herbergen op moleculair niveau vergemakkelijken. Dit zal ons in staat stellen om eiwitten te identificeren die kunnen worden gebruikt voor de ontwikkeling van vaccins voor de ziekte van Lyme en andere pathogenen. Hoewel verschillende onderzoeksgebieden zoals interacties tussen tekenpathogenen en pathogene overdracht naar gastheren door teken tijdens het voeren van dit werk zullen profiteren.

Meer fundamentele vragen zoals hoe teken de immuunrespons van de gastheer ontwijken, en verschillen in DNA-reparatiemechanismen kunnen nu ook worden begrepen. Er zijn een paar aspecten van tekenbiologie die moeten worden begrepen voordat deze procedure wordt uitgevoerd. De hoge interne druk van het embryo leidt tot barsten wanneer het wordt aangeraakt door een naald.

Het is erg belangrijk om embryo's voor te bereiden op injectie. Om te beginnen, breng vrouwtjes over van vier graden Celsius naar een incubator van 27 graden Celsius voor het starten van het leggen van eieren een week vóór injecties. Na drie tot vier dagen wanneer de vrouwtjes eieren beginnen te leggen, verwijdert u alle eieren met een fijne getipte verfkwast terwijl u de vrouwtjes voorbereidt op de orgaanablatie van Gene.

Om de klier te legen, rangschikt u de gravid-teek op een glazen dia onder een microscoop op een manier dat monddelen zichtbaar zijn aan zowel ventrale als dorsale zijden. Prik vervolgens voorzichtig het gebied achter de monddelen aan de dorsale kant door en oefen druk uit op de ventrale kant met behulp van een tang. Plaats de rand van een pluisvrij doekje en verwijder de vloeibare was die uit de punctieplaats komt.

Als alternatief, in plaats van de klier te legen door dissectie, kunnen lijmen zoals weefsellijm worden gebruikt rond de delen van de tekenmond. Wanneer de vrouwtjes weer eieren beginnen te leggen, gebruik dan een fijne verfkwast om vers gedeponeerde eieren te verzamelen en plaats ze in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg ongeveer 200 microliter 5% benzalkoniumchloridewater toe aan de buis met eieren van nul tot 18 uur oud.

Draai de eieren voorzichtig met de kwast gedurende vijf minuten om te voorkomen dat de eieren zich in de bodem van de buis nestelen en verwijder het supernatant met een micropipet, waarbij de eieren in de buis achterblijven. Voeg ongeveer 200 microliter gedestilleerd water toe aan de buis met eieren. Draai met een kwast en verwijder het water uit de microcentrifugebuis met behulp van een micropipet.

Voeg na het wassen met gedestilleerd water ongeveer 200 microliter 5% natriumchloride toe en draai voorzichtig met een penseel gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens de oplossing na vijf minuten uit de buis en was de eieren twee keer met gedestilleerd water. Voeg vervolgens ongeveer 100 microliter 1% natriumchlorideoplossing toe in de microcentrifugebuis met eieren.

Plak eerst twee glazen microscoopglaasjes aan elkaar, laat een opening van ongeveer 0,5 centimeter over om het uitlijnen van eieren te ondersteunen met behulp van een dubbelzijdige tape en breng een stuk transparant filmverband aan op de dubbelzijdige tape in de opening tussen de dia's. Lijn vervolgens acht tot 10 eieren tegelijk uit op de dia-opstelling met behulp van een penseel. Plaats vervolgens de dia met uitgelijnde eieren op het podium van een samengestelde microscoop en verwijder de 1% natriumchloride-oplossing met behulp van een stukje pluisvrij doekje waarin ze zijn opgeslagen.

Bevestig de gevulde injectienaald aan een micro-injector die is aangesloten op een micromanipulator. Open vervolgens de naald door deze voorzichtig tegen het eioppervlak te wrijven met behulp van een hogedrukinstelling op de micro-injector. Nadat de naald is geopend, verlaagt u de druk van de micro-injector, afhankelijk van de opening van de naald.

Injecteer vervolgens zo snel mogelijk alle eieren op de glijbaan in een hoek van 10 tot 15 graden, druk snel op het voetpedaal en verplaats de glijbaan onmiddellijk naar omstandigheden met een hoge luchtvochtigheid in een petrischaal met een vochtige papieren handdoek. Na vijf tot zes uur de dia met geïnjecteerde embryo's in een grote petrischaal bekleed met vochtig filterpapier te hebben geplaatst, voegt u een kleine druppel gedestilleerd water toe aan het transparante filmverband met geïnjecteerde embryo's eraan. Verplaats vervolgens de eieren voorzichtig met een penseel.

Breng vervolgens de eieren over in een kleine petrischaal en dompel ze onder in gedestilleerd water. Houd de eieren ondergedompeld in water, plaats de petrischaal in een plastic doos van zes kwart in een incubator bij 27 graden Celsius bij meer dan 90% relatieve vochtigheid. Wanneer de larve 21 tot 25 dagen na injectie uit de geïnjecteerde embryo's begint te komen, controleert u ze dagelijks en brengt u eventuele uitgekomen larven over naar glazen injectieflacons met een scherm erop.

De resultaten toonden aan dat het injecteren van de eieren vroeg in de embryogenese 12 tot 18 uur oud, en het uitlijnen van de langere as van het ei loodrecht op de rand van de dia resulteert in een hogere overlevingskans van de geïnjecteerde eieren. Van alle geïnjecteerde eieren overleefde tot 8,5% en kwam de larve uit. Voordat u met deze procedure begint, is het belangrijk om stappen 2.4, verwijdering van de was van de moedertik en stappen 3.1 tot en met 3.4, verzachting van het chorion van het embryo met benzalkoniumchloride en uitdroging van het embryo met natriumchlorideoplossingen te onthouden om succesvolle embryo-injectie mogelijk te maken.

Deze methode is voornamelijk ontwikkeld voor het bewerken van tekengenen, en dit zal ons in staat stellen knock-outs en knock-ins te doen die ons zullen helpen de functie van het tekengen te begrijpen. Deze techniek zal het mogelijk maken om genbewerkingstools die beschikbaar zijn voor veel andere organismen toe te passen op tekenonderzoek. En dit zal het onderzoek naar de moleculaire biologie versnellen.