Fosfolipide mediator geïnduceerde transformatie in driedimensionale culturen

Onze gemodificeerde 3D-testculturen kunnen worden gebruikt om de rol van verschillende componenten in een micro-omgeving van kanker te onderzoeken, wat leidt tot de identificatie van nieuwe biomarkers en medicijndoelen. Deze methode stelt iemand in staat om veranderingen in het cellulaire fenotype en moleculaire signalering te bestuderen die sterk lijken op het immuunsysteem. Het kan ook worden aangepast om te voldoen aan specifieke vereisten van een studie.

Deze methode kan helpen bij het identificeren van nieuwe biomarkers die kunnen helpen bij het vroegtijdig opsporen van borstkanker. Ook kunnen moleculaire inzichten worden gebruikt voor het identificeren van nieuwe medicijndoelen. Deze methode kan worden gebruikt om zowel tumorigenese als morfogenese na verstoring van gen of genen te bestuderen die inzicht kunnen geven in de rol van het gen of de genen.

Om te beginnen, trypsinize de cellen door het medium aan te zuigen en te wassen met 2 milliliter PBS. Voeg 900 microliter 0,05% Trypsine-EDTA toe en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende ongeveer 15 minuten of totdat de cellen volledig trypsinized zijn. Bereid een bed lrECM voor in acht putten van een glazen schuif met kamer door elke put te coaten met 60 microliter lrECM.

Plaats het in een kooldioxide-incubator van 37 graden Celsius gedurende maximaal 15 minuten. Om de celsuspensie voor te bereiden, voegt u 5 milliliter re-suspensiemedium toe om de trypsine-activiteit te doven en de cellen gedurende 10 minuten op 25 graden Celsius op 112 keer g te laten draaien. Aspirateer het gebruikte medium en suspensieer de cellen opnieuw in 2 milliliter assay medium.

Meng de suspensie goed om de vorming van een eencellige suspensie te garanderen. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en bereken het volume van de celsuspensie dat nodig is om 6.000 cellen in elke put te zaaien. Afhankelijk van het aantal benodigde putten, verdunt u de celsuspensie in het overlay-medium.

Voeg 400 microliter van de verdunde celsuspensie toe aan de voorbereide lrECM-bedden en zorg er zorgvuldig voor dat het lrECM-bed niet wordt verstoord. Incubeer bij 37 graden Celsius in een bevochtigde 5% kooldioxide-incubator. Voeg na 3 uur 200 nanomol PAF toe aan elk putje.

Voeg dezelfde concentratie PAF toe tijdens elke mediaverandering en vul de cellen elke 4 dagen aan met vers medium. Na 20 dagen kweken, pipetteer voorzichtig het medium uit elke put en was de putten met 400 microliter voorverwarmde PBS. Fixeer de acinarstructuren door 400 microliter vers bereide 4% paraformaldehyde toe te voegen en gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur te broeden.

Spoel de putjes eenmaal af met ijskoude PBS en permeabiliseer met PBS met 0,5% Triton X-100 gedurende 10 minuten bij 4 graden Celsius. Pipetteer na 10 minuten de Triton X-100-oplossing zorgvuldig en spoel af met 400 microliter vers bereide PBS-glycine. Voeg 400 microliter van de primaire blokoplossing bestaande uit 10% geitenserum toe aan immunofluorescentiebuffer en incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder de primaire blokkeringsoplossing, voeg 200 microliter 2% secundair blokkerend antilichaam toe dat in de primaire blokkerende oplossing is bereid en laat het 45 tot 60 minuten op kamertemperatuur staan. Bereid het primaire antilichaam in een 1:100 verdunning in een secundair blokkerende antilichaamoplossing met 2%. Verwijder de secundaire blokkeeroplossing, voeg het vers bereide antilichaam toe en incubeer een nacht bij 4 graden Celsius.

Pipetteer voorzichtig de primaire antilichaamoplossing en was deze driemaal met 400 microliter immunofluorescentiebuffer. Bereid vervolgens een 1:200 verdunning van het fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichaam in de primaire blokkerende oplossing en incubeer de dia's in de secundaire antilichaamoplossing gedurende 40 tot 60 minuten bij kamertemperatuur. Spoel de dia's gedurende 20 minuten met 400 microliter immunofluorescentiebuffer, gevolgd door twee wasbeurten met PBS gedurende elk 10 minuten.

Bevlek de kernen met PBS met 0,5 nanogram per milliliter kernvlek gedurende 5 tot 6 minuten bij kamertemperatuur. Was de dia's driemaal met 400 microliter PBS om de overtollige vlek te verwijderen. Pipetteer voorzichtig de gehele PBS en zorg voor verwijdering van de restoplossing.

Voeg vervolgens een druppel montagereagens toe aan elke put en laat het een nacht op kamertemperatuur staan. Ten slotte, beeld de dia's onder 40x of 63x vergroting op een confocale microscoop, waarbij optische Z-secties van 0,6 millimeter stapgrootte worden genomen. De afbeeldingen stellen de kernen van cellen in acini gekleurd met een nucleaire vlek voor.

De 3D-constructie van de acini en het fasecontrastbeeld van MCF10A acini gekweekt op lrECM gedurende 20 dagen worden hier getoond. Het middelste gedeelte toont de aanwezigheid van een hol lumen. PAF verstoort de polariteit en induceert EMT-achtige veranderingen in MCF10A borst-acini.

MCF10A-cellen werden gekweekt als 3D-on-topculturen in lrECM. De culturen werden behandeld met PAF op dag 0, 4, 8, 12 en 16. De culturen werden gedurende 20 dagen gehandhaafd en vervolgens immunostained voor alfa6-integrine en nucleaire kleuring, GM130, een marker voor apicale polariteit, en Vimentin, een EMT-marker.

De middelste stapel van de respectievelijke acini is hier getoond. De representatieve gegevens zijn voor 40-50 acini uit drie biologisch onafhankelijke experimenten. Het lrECM-bed moet zorgvuldig zo worden gemaakt dat het gelijkmatig wordt verdeeld zonder luchtbellen.

Ook moet de celsuspensie gelijkmatig worden gemengd en langzaam worden toegevoegd om klonteren te voorkomen. Men kan eiwit en RNA verkrijgen uit de 3D-culturen die vervolgens kunnen worden gebruikt om de verschillende moleculaire routes te onderzoeken.