Isolatie van voorwaardelijk vereeuwigde glomerulaire endotheelcellen van de muis met fluorescerende mitochondriën

Onsterfelijk gemaakte glomerulaire endotheelcellen met stabiele fluorescerende mitochondriën zijn een geweldig hulpmiddel om het effect van verschillende stimuli op de mitochondriale structuur in vitro te onderzoeken. De beschreven methode in het huidige artikel levert een hoog aantal glomerulaire endotheelcellen op. Door kleine moleculen op een GEC te testen, konden we screenen op monotherapie voor diabetische nierziekte waarbij de GEC's worden aangetast.

De beschreven methode is eenvoudig uit te voeren en vereist geen specifieke apparatuur. Het is echter belangrijk om de beschreven stappen te volgen en de apparatuur te steriliseren om besmetting te voorkomen. Plaats om te beginnen de perfusie- en isolatiematerialen die nodig zijn om nierglomerulaire cellen op een werkruimte te isoleren.

Filter de vers bereide Hanks'Balanced Salt Solution, of HBSS, met een filter van 0,2 micron en bewaar deze onder de motorkap om besmetting te voorkomen. Meng vervolgens 200 microliter magnetische kralen met 20 milliliter HBSS. Prewarm de RPMI met 10% FCS en endotheelcelkweekmedium in een waterbad bij 37 graden Celsius.

Vervolgens, pre-coat twee putten van een zes-well plaat met twee milliliter van 10 microgram per milliliter collageen IV gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Was de plaat twee keer met PBS om het azijnzuur te verwijderen dat wordt gebruikt om het collageen te verdunnen. Gebruik de gecoate platen onmiddellijk, of bewaar ze bij twee tot acht graden Celsius gedurende maximaal vier weken.

Reinig de chirurgische instrumenten en werkruimte met 70% ethanol. Autoclaaf vervolgens de chirurgische instrumenten gedurende 30 minuten. Na het openen van de buik van een verdoofde muis, steekt u een vlindernaald in de linker ventrikel.

Om 100 microliter van de kraaloplossing te injecteren om de bloedcirculatie uit te breiden, breekt u voorzichtig de inferieure vena cava onder de nieren met een naald van 19 gauge en zet u de perfusie van de kraaloplossing voort. Verwijder vervolgens voorzichtig het vetweefsel met een pincet, snijd beide nieren weg met een dunne chirurgische schaar C en leg ze op een bord met één milliliter HBSS op ijs. Gehakt de nier met een steriel scalpel in kleine stukjes van een millimeter.

Incubeer de gehakte nier met een millimeter vers bereid collagenase type II gedurende 35 minuten bij 37 graden Celsius met zacht kantelen op een horizontale shaker. Voeg na de spijsvertering vier milliliter RPMI toe met 10% FBS om het collagenase te neutraliseren. Filter het verteerde weefsel door een steriele 100-micron celzeef in een buis van 50 milliliter.

Gebruik de bodem van een steriele buis van 1,5 milliliter om het verteerde weefsel tegen de zeef te roeren, zodat de glomeruli erdoorheen kunnen. Spoel de celzeef af met 15 milliliter HBSS. Centrifugeer vervolgens de doorstroom op 200 XG gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

In dit stadium bevat de buis drie lagen. De bovenste laag bevat kleinere structuren zoals buisjes, de middelste laag is kralen met glomeruli en de onderste laag bevat puin. Zuig het supernatant en de bovenste witte laag voorzichtig aan.

Resuspendeer vervolgens de pellet met kralen die de glomeruli en het puin dragen in 1,5 milliliter HBSS en breng het over in een buis van twee milliliter. Plaats de buis in een magnetische concentrator en aspirateer het supernatant voordat u de kralen twee keer wast met één milliliter HBSS. Plaats 20 microliter celsuspensie op een dia.

Observeer vervolgens de dia onder een microscoop voor de aanwezigheid van glomeruli. Resuspendeer vervolgens de pellet in een endotheelcelgroeimedium en breng de suspensie over naar een buis van twee milliliter. Voeg één microliter interferon gamma toe voor elke drie milliliter medium en plaats de cellen in een zes-well plaat voor incubatie bij 33 graden Celsius.

Vervang na drie dagen kweken voorzichtig het ene millilitermedium door een vers medium. In dit stadium zijn de cellen heterogeen met een mengsel van glomerulaire cellen. Vervang na zeven dagen het medium door twee milliliter vers endotheelcelgroeimedium, aangevuld met interferon gamma om de proliferatie van cellen te starten.

Na 10 dagen, wanneer de cellen 80% confluency bereiken, passeer ze met behulp van trypsine en breng ze over in een T-25-kolf bedekt met collageen IV.Na 21 dagen cultuur, breng cellen over naar een T-75 kolf. Voeg drie milliliter van 0,25% trypsine toe aan een T-75 kolf en incubeer de cellen bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Neutraliseer vervolgens het trypsine met drie milliliter endotheelgroeimedium en breng de suspensie over naar een buis van 15 milliliter voor centrifugatie bij 200 XG gedurende vijf minuten.

Aspirateer het supernatant en was de cellen in één milliliter PBS met 1% BSA, twee millimolaire EDTA, 1% penicilline / streptomycine. Nogmaals, centrifugeer en resuspendeer de pellet in 200 microliter CD31 antilichaam gecoate kralen en 800 microliter PBS. Incubeer de cellen gedurende 45 minuten met continu schudden bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Plaats vervolgens de buis in de magnetische concentrator en was de cellen vier keer met PBS die BSA, EDTA en penicilline / streptomycine bevatten. Na de laatste wasbeurt resuspenseren de cellen in drie milliliter endotheelgroeimedium, aangevuld met interferon gamma. Plaat 1,5 milliliter cellen per put in collageen IV gecoate putten op een zes-well plaat en cultuur onder permissieve omstandigheden bij 33 graden Celsius.

Vervang na vier dagen 750 microliter van het medium door een vers endotheelgroeimedium, aangevuld met interferon gamma. Na 10 tot 14 dagen cultuur, met behulp van een epifluorescentiemicroscoop met een filter van 488 nanometer, observeer voor het kweken van CD31-positieve glomerulaire endotheelcel, of GEC's, kolonies die fluorescerende mitochondriën tot expressie brengen. Na 21 dagen, of wanneer de cellen 80 tot 90% samenvloeiing hebben bereikt, breng ze over in een T-25 kolf.

Onderhoud de cultuur met een RPMI-groeimedium dat 10% FCS bevat. Als alternatief kunnen cellen worden gecryopreserveerd. Passagecellen met trypsine, zoals eerder aangetoond.

Centrifugeer vervolgens de cellen en resuspeneer de pellet in drie milliliter vriesmedium. Aliquot de cellen in cryobuizen en sla ze op in vloeibare stikstof, damptemperatuur. Dit protocol beschreef een methode voor de isolatie van glomerulaire endotheelcellen.

Uit de geïsoleerde glomeruli begonnen cellen langzaam te groeien na drie dagen kweken. Na zeven dagen leken cellen heterogeen en vertoonden andere glomerulaire celtypen, zoals podocyten, pariëtale, epitheliale en mesangiale cellen. Na het bereiken van 70 tot 80% confluency werden andere glomerulaire cellen verwijderd met behulp van een positieve selectie van endotheelcellen.

De MitoDendra2 GEC's brachten CD31 tot expressie en waren negatief voor podocytmarker, zoals blijkt uit synaptopodine negatieve kleuring. Het effect van glucoseconcentratie op de mitochondriale structuur werd onderzocht. Vergeleken met de langwerpige mitochondriën die zichtbaar zijn in cellen onder normale glucose, veroorzaakte hoge glucose fragmentatie of splijting van mitochondriën, zoals waargenomen door prominente sferoïde gevormde mitochondriën.

Bovendien werd een laser van 405 nanometer gebruikt om een geselecteerde subpopulatie van mitochondriën in een enkele levende MitoDendra2 GEC te fotoconverteren. Een succesvolle fotoswitching van mitochondriën van groen naar rood in het geselecteerde gebied voor met normale en hoge glucoseconcentratie behandelde cellen wordt getoond. Deze omschakeling maakte het mogelijk om getuige te zijn van de fusiegebeurtenissen in MitoDendra2 GEC's.

Onder normale glucose werden geel samengevoegde groene en rode fluorescentie waargenomen als gevolg van mitochondriale matrixfusie. In de met hoge glucose behandelde GEC's daarentegen waren de mitochondriën voornamelijk gefragmenteerd. Het plaatsen van de cellen in een put van zes putten plaat met een klein volume groeimedium is essentieel om de cellen aan het gerecht te laten hechten.

De geïsoleerde endotheelcellen kunnen worden gebruikt om mitochondriale functie- en structurele studies uit te voeren. Het gebruik van vereeuwigde endotheelcellen met fluorescerende mitochondriën zal de weg vrijmaken voor het ontdekken van geneesmiddelen. De kleine moleculen kunnen op de cellen worden getest en live beeldvorming wordt uitgevoerd om hun effect op de mitochondriale functie te onderzoeken.