Name: Zachte isolatie van kernen uit het hersenweefsel van volwassen Afrikaanse turquoise killivissen, een natuurlijk kortlevend model voor verouderingsonderzoek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Leer een zachte isolatiemethode voor kernen uit hersenweefsel van Nothobranchius furzeri, een kortlevend model voor verouderingsonderzoek. Dit protocol maakt single-nucleus RNA-sequencing en ATAC-seq mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Sommige panelen werden gegenereerd met BioRender.com. Dit werk in ons laboratorium werd ondersteund door de NIA T32 AG052374 Postdoctoral Training Grant to B.T., een subsidie van de Simons Foundation als onderdeel van de Simons Collaboration for Plasticity in the Aging Brain, een pilotbeurs van de Navigage Foundation en een Hanson-Thorell Family award aan B.A.B.

<ol><li>Yankner, B. A., Lu, T., Loerch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aging+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">The aging brain.</a> Annual Review of Pathology. 3 (1), 41-66 (2008).</li>
<li>Hu, C. K., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+African+turquoise+killifish%3A+A+research+organism+to+study+vertebrate+aging+and+diapause%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The African turquoise killifish: A research organism to study vertebrate aging and diapause.</a> Aging Cell. 17 (3), 12757(2018).</li>
<li>McKay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+feeding+system+for+the+African+killifish+reveals+effects+of+dietary+restriction+on+lifespan+and+allows+scalable+assessment+of+associative+learning%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">An automated feeding system for the African killifish reveals effects of dietary restriction on lifespan and allows scalable assessment of associative learning.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Valenzano, D. R., Terzibasi, E., Cattaneo, A., Domenici, L., Cellerino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+affects+longevity+and+age-related+locomotor+and+cognitive+decay+in+the+short-lived+fish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Temperature affects longevity and age-related locomotor and cognitive decay in the short-lived fish Nothobranchius furzeri.</a> Aging Cell. 5 (3), 275-278 (2006).</li>
<li>Vanhunsel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+killifish+visual+system+as+an+in+vivo+model+to+study+brain+aging+and+rejuvenation%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Aging+and+Mechanisms+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The killifish visual system as an in vivo model to study brain aging and rejuvenation.</a> NPJ Aging and Mechanisms of Disease. 7 (1), 22(2021).</li>
<li>Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+of+brain+cell+transcriptomes+and+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes.</a> Neuron. 109 (1), 11-26 (2021).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PLoS One. 13 (12), 0209648(2018).</li>
<li>Ziffra, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+epigenomics+reveals+mechanisms+of+human+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell epigenomics reveals mechanisms of human cortical development.</a> Nature. 598 (7879), 205-213 (2021).</li>
<li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-sequencing+from+single+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li>
<li>Kalish, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+RNA+sequencing+of+mouse+auditory+cortex+reveals+critical+period+triggers+and+brakes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus RNA sequencing of mouse auditory cortex reveals critical period triggers and brakes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (21), 11744-11752 (2020).</li>
<li>Slyper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+and+single-nucleus+RNA-Seq+toolbox+for+fresh+and+frozen+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors.</a> Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).</li>
<li>Ayhan, F., Douglas, C., Lega, B. C., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+isolation+from+surgically+resected+human+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Nuclei isolation from surgically resected human hippocampus.</a> STAR Protocols. 2 (4), 100844(2021).</li>
<li>Gaublomme, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+multiplexing+with+barcoded+antibodies+for+single-nucleus+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics.</a> Nature Communications. 10 (1), 2907(2019).</li>
<li>Narayanan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+isolation+from+fresh+frozen+brain+tumors+for+single-nucleus+RNA-seq+and+ATAC-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Nuclei isolation from fresh frozen brain tumors for single-nucleus RNA-seq and ATAC-seq.</a> Journal of Visualized Experiments. (162), e61542(2020).</li>
<li>Saunders, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+diversity+and+specializations+among+the+cells+of+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular diversity and specializations among the cells of the adult mouse brain.</a> Cell. 174 (4), 1015-1030 (2018).</li>
<li>Genomics, X. Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing & Tissues for Single Cell RNA Sequencing. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/permalink/1dlB6Z91VqClgUmSC2OM8k">https://support.10xgenomics.com/permalink/1dlB6Z91VqClgUmSC2OM8k</a> (2021).</li>
<li>Martin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+tissue+nuclei+extraction+%28for+10xV3+snSEQ%29+V.2%5BTitle%5D)+AND+%22protocols.io%22%5BJournal%5D)">Frozen tissue nuclei extraction (for 10xV3 snSEQ) V.2.</a> protocols.io. , (2020).</li>
<li>Nuclei Isolation from Adult Mouse Brain Tissue for Single Cell RNA Sequencing. 10xGenomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-adult-mouse-brain-tissue-for-single-cell-ma-sequencing">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-adult-mouse-brain-tissue-for-single-cell-ma-sequencing</a> (2022).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biology. 21 (1), 130(2020).</li>
<li>What are the best practices for working with nuclei samples for 3' single-cell gene expression. 10xGenomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360050780051-What-are-the-best-practices-for-working-with-nuclei-samples-for-3-single-cell-gene-expression-">https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360050780051-What-are-the-best-practices-for-working-with-nuclei-samples-for-3-single-cell-gene-expression-</a> (2022).</li>
<li>Rocks, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+chromatin+accessibility+analysis+in+the+mouse+and+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific chromatin accessibility analysis in the mouse and human brain.</a> Epigenetics. 17 (2), 202-219 (2022).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het hier gepresenteerde protocol kan worden gebruikt om reproductief hoogwaardige kernen te genereren uit killifishhersenen. Dit protocol moest specifiek worden ontworpen voor de killifish-hersenen, omdat typische op zoogdieren gebaseerde hersenkernisolatieprotocollen toegepast op killifish-hersenen consequent resulteerden in een slechte kernkwaliteit in onze handen. We vermoeden dat dit te wijten is aan het lagere relatieve myelinegehalte van de killifish-hersenen in vergelijking met hun zoogdierachtige tegenhangers, die zouden lyseren en klonteren als reactie op de barre omstandigheden die nodig zijn voor hersencellysis van zoogdieren. Dit protocol is een vooruitgang in de verouderings- en killifish-velden omdat het de verkenning van hersenveroudering op eencellig niveau vergemakkelijkt in een kosten- en tijdeffectief model van gewervelde hersenveroudering. 
Dit protocol is robuust voor verse of bevroren monsters, hoewel men rekening moet houden met de downstream-toepassingen bij het gebruik van vers of bevroren weefsel. Bevroren weefsel is vaak handig omdat het maandenlang kan worden verzameld en bewaard terwijl monsters worden verzameld. Dergelijke monsters kunnen veilig worden gebruikt voor toepassingen zoals snRNA-seq. Het bevriezen van monsters kan echter de nucleaire structuur verstoren en dus het vermogen om het chromatinelandschap nauwkeurig te meten door ATAC-seq21. Voor downstream-toepassingen zoals bulk ATAC-seq of snATAC-seq wordt het dus aanbevolen om vers ontleedde hersenen te gebruiken in plaats van bevroren hersenen. Bovendien, omdat alle stappen na hersenhomogenisatie parallel kunnen worden uitgevoerd, is dit protocol vatbaar voor het uitvoeren van meerdere monsters in een redelijk tijdsbestek, waardoor RNA-afbraak veroorzaakt door langdurige incubatie op ijs wordt beperkt.
Bovendien is het noodzakelijk om buffers vers (binnen enkele uren) na het uitvoeren van kernextractie te bereiden. We ontdekten dat detergentia en BSA onmiddellijk voorafgaand aan het begin van het protocol aan buffers moeten worden toegevoegd. Buffers die alleen zouten bevatten (PBS, NaCl, enz.) mogen als concentraten worden gemaakt, filter gesteriliseerd (0,22 μm) en voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur worden bewaard. BSA-stamoplossingen kunnen binnen enkele dagen na de kernextractie (indien bereid uit een poeder) worden bereid, gesteriliseerd en bij 4 °C worden bewaard, maar moeten altijd onmiddellijk aan de in dit protocol gebruikte buffers worden toegevoegd voordat het protocol wordt uitgevoerd. We raden echter aan om BSA-oplossingen voor te bereiden op de dag van het protocol. Als u vooraf gemaakte BSA-oplossingen van een derde partij gebruikt, wordt geadviseerd om verse, ongeopende flessen te gebruiken. Het gebruik van verse BSA leidt over het algemeen tot een lager puingehalte in kernvoorbereiding.
Of verse of bevroren monsters nu als input worden gebruikt, het is belangrijk om de kwaliteit van kernen na kernisolatie te beoordelen. Hoewel dit protocol specifiek is ontworpen om overlyse te voorkomen, is dit de meest voorkomende oorzaak van kwaliteitsverlies in kernen. Overlyse kan het gevolg zijn van te veel tijd doorgebracht in de lysisbuffer, te ruwe behandeling van de kernen zoals overmatig pipetteren met een standaard boringpipetpunt, of een overmatige hoeveelheid tijd doorgebracht tussen kernisolatie en downstream-toepassingen (>1 uur). Overdreven kernen hebben vaak beschadigde nucleaire periferie, die DNA lekken en klontering veroorzaken (figuur 2B). Dit zal leiden tot een verhoogd aantal multipletten en bijdragen achtergrondnucleïnezuren die zullen interfereren met downstream-toepassingen, met name snRNA-seq. Beide kwaliteiten kunnen worden beoordeeld door microscopie na kernisolatie. Als overmatige nucleaire klontering wordt waargenomen, raden we aan om te proberen de lysisstap incubatie te verkorten om de kans op overlyse te verminderen. Als alternatieve methode voor het verhogen van singlets van kernen, kan fluorescentie-assisted cell sorting (FACS) worden gebruikt om te verrijken voor singlets stroomafwaarts van dit protocol. We merken echter op dat, bij het werken met reeds fragiele kernen uit bevroren weefsel, de schuifspanning die optreedt tijdens het sorteren kan leiden tot verhoogde nucleaire breuk en dus verhoogd omgevings-RNA / DNA. Bovendien merken we op dat de tijd die nodig is om een FACS-opbrengstsortering voor kernen uit te voeren bij het verwerken van meerdere monsters, vereist dat alle kernmonsters urenlang op ijs blijven, terwijl andere monsters worden gesorteerd. Verhoogde wachttijden bij het verwerken van meerdere monsters parallel met de FACS-aanpak kunnen dus waarschijnlijk ook leiden tot een algehele verminderde kernkwaliteit en het risico op RNA-afbraak verhogen. Dus als FACS gewenst is voor een verlaagde doubletsnelheid, raden we aan dat het puingehalte opnieuw wordt gecontroleerd na de opbrengstsortering en dat mogelijk verminderde RNA-kwaliteit in aanmerking wordt genomen voor single cell RNA-seq-toepassingen als een potentieel voorbehoud. 
Een nauwkeurige schatting van het aantal kernen en de singletverhouding is essentieel voor bijna alle downstream "omics" -toepassingen en is van het grootste belang. Vanwege het vermogen om kernen gemakkelijk op grootte te sluiten en te tellen, is flowcytometrie de meest nauwkeurige methode voor het tellen van kernen die we hebben beoordeeld. Als alternatief kan men kernen kwantificeren met behulp van celtellers zoals Invitrogen's Countess 2 FL Automated Cell Counter of de DeNovix CellDrop Automated Cell Counter. Om op te merken, heeft invitrogen's Countess 2 FL Automated Cell Counter, en in veel mindere mate de DeNovix, de neiging om kerntellingen te overschatten door puin als kernen te tellen, wat betekent dat handmatige gating van de grootte nodig kan zijn. Bovendien kan men met de flowcytometer eenvoudig de zuiverheid van de kernen beoordelen. Men kan de relatieve verhouding van singlet versus multipletkernen onderscheiden op een kwantitatieve manier die moeilijk is door microscopie. Dit is van vitaal belang voor snRNA-seq en snATAC-seq, omdat die protocollen zullen lijden onder een overschot aan multipletmonsters, die moeten worden uitgesloten van downstream-analyses. Naast multipletten kan het relatieve aandeel "puin" (gefragmenteerde kernen, cellulair puin) worden gekwantificeerd door flowcytometrie en moet relatief laag zijn, omdat dit materiaal vaak verontreinigende nucleïnezuren bevat die een achtergrondsignaal kunnen bijdragen en "omics" -gegevens met één kern kunnen beschadigen. 
Net als bij eerder beschreven kernisolatieprotocollen, mogen de verhoudingen van celtypen in het oorspronkelijke weefsel niet getrouw worden samengevat in de kernvoorbereiding19 en moeten daarom met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. Om op te merken, zoals alle teleosts, hebben Afrikaanse turquoise killifish kernvormige erytrocyten, die naar verwachting ook vertegenwoordigd zullen zijn in de kernvoorbereiding. Deze kernen kunnen worden geïdentificeerd in snRNA-seq en snATAC-seq datasets door de hogere expressie / toegankelijkheid van hemoglobinegenen en kunnen indien gewenst computationeel worden uitgesloten.

Het begrijpen van de mechanismen van gewervelde hersenveroudering is van cruciaal belang voor het aanpakken van leeftijdsgerelateerde neurodegeneratieve ziekten zoals Alzheimer en dementie1. De Afrikaanse turquoise killifish (Nothobranchus furzeri) is het kortstlevende gewervelde dier dat in gevangenschap kan worden gefokt, en vanwege zijn korte levensduur en leeftijdsgebonden cognitieve stoornissen is het een uitstekend hersenverouderingsmodel 2,3,4,5. Onlangs heeft de komst van single-cell "omics" -technologieën, zoals single nuclei RNA-seq (snRNA-seq) en single nuclei assay voor transposase-toegankelijk chromatine met sequencing (snATAC-seq), onderzoekers in staat gesteld om de ouder wordende hersenen te ondervragen met een ongekende resolutievan 6,7,8. Deze methoden zijn afhankelijk van kernisolatie, omdat het herstel van hersencellen zoals neuronen vaak te uitdagend is om 6,7,8,9,10 te isoleren. De meeste gepubliceerde kernisolatieprotocollen zijn echter geoptimaliseerd voor zoogdiermodelorganismen 11,12,13,14,15. Aangezien er momenteel dus een onvervulde behoefte is aan het isoleren van hersenkernen in de killifish als een opkomend nieuw modelorganisme op het gebied van verouderingsonderzoek2, is het doel van dit protocol om een methode vast te stellen voor het isoleren van hoogwaardige kernen uit bevroren hersendodendvisweefsel.
Hier wordt een gestroomlijnde en robuuste workflow opgezet die algemeen beschikbare materialen gebruikt om hoogwaardige kernen uit killifishhersenen te isoleren. Dit protocol is aangepast van een 10x Genomics-protocol voor muizenhersenen om tegemoet te komen aan de hersenen met een lager myelinegehalte van Afrikaanse turquoise killifish, de kwetsbaarheid van bevroren weefsel en de noodzaak om het omgevingsafvalgehalte te verminderen voor sequencing-gerelateerde toepassingen16. Inderdaad, eerder geoptimaliseerde protocollen voor hersenweefsel van zoogdieren 17,18 leiden tot een slechte kernkwaliteit (d.w.z. overlyse) en / of een hoog puingehalte bij gebruik op bevroren killifishhersenen, waardoor ze ongeschikt zijn voor gebruik met snRNA-seq volgens aanbevelingen voor enkele kernen RNA-seq met behulp van microfluïdica (aanvullende figuur 1).
Naast kernisolatie laten we zien hoe we de kwaliteit en opbrengst van kernen kunnen beoordelen door middel van microscopie en flowcytometrie. Dit artikel geeft voorbeelden van zowel optimale als suboptimale resultaten en bespreekt het oplossen van problemen. Dit protocol is ontworpen en geoptimaliseerd voor bevroren killifish-hersenen, maar kan ook zonder grote wijzigingen worden gebruikt op vers ontleedde killifish-monsters. Killifish hersenkernen geïsoleerd met behulp van deze methode zijn geoptimaliseerd voor gebruik in single nucleus RNA-seq (snRNA-seq) als een downstream-toepassing, maar moeten ook geschikt zijn voor gebruik in snATAC-seq en bulk ATAC-seq.

<table><tbody><tr><td>0.4% Trypan Blue solution</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Bioland</td><td>PBS01-03</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conicle Centrifuge Tube</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Tissue Grinder</td><td>Kimble</td><td>885300-0002</td><td>Dounce Homogenizer</td></tr><tr><td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>5M Sodium Chloride, Molecular Biology Grade</td><td>Promega</td><td>V4221</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Rinsing Solution</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>Dit komt overeen met 1x PBS pH 7,2, 2 mM EDTA (gebruikt voor flowcytometrie)</td></tr><tr><td>Debris Removal Solution</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-109-398</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBInd Tube</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Echo Revolve microscoop (uitgerust met 60x objectief)</td><td>Echo</td><td>NA</td><td>Geen catalogusnummer; Gebruikt om kernen visueel te inspecteren.</td></tr><tr><td>Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td>FACS-buis</td></tr><tr><td>FLOWMI Cell Strainers, 40 &mu;M</td><td>SP Bel-Art</td><td>136800040</td><td>Aangeduid als on-tip filters in Protocol</td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258146-500 mL</td><td>Gebruikt om de TRIS pH van 8,0 naar 7,4 te verlagen</td></tr><tr><td>Leica EZ4 dissectiescoop</td><td>Leica</td><td>NA</td><td>Geen catalogusnummer</td></tr><tr><td>MACS BSA stock solution</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130091376</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (70 &mu;M)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-916</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>NA</td><td>Geen catalogusnummer</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade (Poeder)</td><td>Millipore</td><td>442611</td><td></td></tr><tr><td>Megafuge 16R Centrifuge</td><td>ThermoScientific</td><td>75003629</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover Glass</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td></td></tr><tr><td>Micro Slides Superfrost Plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 Substitute</td><td>Roche</td><td>(Roche) 11332473001/ Catalog: 983739 P Code: -102368106 (Sigma Aldrich)</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution</td><td>ThermoFisher</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free HyPure Molecular Biology Grade Water</td><td>HyClone</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>NxGen RNase Inhibitor (50.000 U)</td><td>Lucigen</td><td>30281-2</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide solution</td><td>MBL</td><td>FP00010020</td><td></td></tr><tr><td>PureBlu DAPI Nuclear Staining Dye</td><td>Biorad</td><td>1351303</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT Pipette Tips (Ultra low retention, gefilterd) in 10 &micro;L, 20 &micro;L, 200 &micro;L, en 1000 &micro;L maten</td><td>USA Scientific</td><td>#1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S (MS 222)</td><td>Syndel</td><td>Tricaine10G</td><td>Syndel is een FDA-goedgekeurde leverancier voor farmaceutische kwaliteit Tricaine</td></tr><tr><td>TRIS, 1 M, pH 8,0</td><td>VWR</td><td>E199-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Wide Bore Pipet Tips</td><td>Axygen</td><td>T-1005-WB-C</td><td></td></tr></tbody></table>

zachte isolatie van kernen uit het hersenweefsel van volwassen afrikaanse turquoise killivissen, een natuurlijk kortlevend model voor verouderingsonderzoek

Gentle Isolation of Nuclei from the Brain Tissue of Adult African Turquoise Killifish, a Naturally Short-Lived Model for Aging Research

Het bestuderen van hersenveroudering met eencellige resolutie in gewervelde systemen blijft een uitdaging vanwege kosten, tijd en technische beperkingen. Hier demonstreren we een protocol om single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) bibliotheken te genereren uit de hersenen van de van nature kortlevende gewervelde Afrikaanse turquoise killifish Nothobranchius furzeri. De Afrikaanse turquoise killifish heeft een levensduur van 4-6 maanden en kan op een kosteneffectieve manier worden gehuisvest, waardoor kosten- en tijdsbarrières worden verminderd om gewervelde hersenveroudering te bestuderen. Er zijn echter op maat gemaakte protocollen nodig om kernen van voldoende kwaliteit voor downstream eencellige experimenten te isoleren uit de hersenen van jonge en oude vissen. Hier demonstreren we een empirisch geoptimaliseerd protocol voor de isolatie van hoogwaardige kernen uit de hersenen van volwassen Afrikaanse turquoise killifish, een cruciale stap in de generatie van hoogwaardige single nuclei omic bibliotheken. Verder laten we zien dat de stappen om vervuilend achtergrond-RNA te verminderen belangrijk zijn om celtypen duidelijk te onderscheiden. Samenvattend toont dit protocol de haalbaarheid aan van het bestuderen van hersenveroudering in niet-traditionele gewervelde modelorganismen.

Het hier beschreven killifish hersenkern isolatieprotocol is specifiek geoptimaliseerd voor de killifish en is samengevat in figuur 1. Naast kernextractie beschrijft het protocol verschillende methoden voor het beoordelen van de kwaliteit en kwantiteit van geïsoleerde kernen. Figuur 2 toont voorbeelden van zowel gezonde (figuur 2A) als ongezonde (figuur 2B) kernen zoals beoordeeld met lichtmicroscopie. Gezonde kernen die geschikt zijn voor downstream-analyse (figuur 2A) presenteren zich als singletkernen met intacte membranen. Zoals te zien is in figuur 2B, is de meest voorkomende faalmodus van dit protocol (en andere kernisolatieprotocollen) het genereren van overdreven kernen, die worden gekenmerkt door beschadigde kernmembranen. Dit leidt vaak tot klonteren van kernen en kan bijdragen aan achtergrondsignalen in downstream-toepassingen als gevolg van het lekken van nucleïnezuren uit de gescheurde kernen. Als overmatige klontering wordt waargenomen, raden we aan om voorzichtiger te zijn tijdens de verdubbelingsstappen en / of de incubatietijden in lysisbuffer te verkorten.
Dit protocol maakt gebruik van flowcytometrie om het aantal geïsoleerde kernen te kwantificeren en het relatieve aandeel van multipletkernen in een monster te bepalen. Bovendien kan flowcytometrie worden gebruikt om het relatieve gehalte aan verontreinigend puin, vaak gescheurde kernfragmenten en ander cellulair puin te beoordelen dat de stroomafwaartse testen in het kernmonster nadelig kan beïnvloeden. Representatieve stroomgegevens zijn te zien in figuur 3. Een hoogwaardige kernisolatieprocedure zal produceren: 1) een kleine puinfractie en 2) een hoge fractie singlet versus multipletkernen (> 80% van de kernfractie). Het gebruik van PI-kleuring, die nucleïnezuren kleurt, maakt het mogelijk om singletkernen te scheiden van puin en multipletkernen. Figuur 3A is een voorbeeld van een preparaat dat besmet is met puin, terwijl figuur 3B een voorbeeld is van een experiment van hoge kwaliteit.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64165/64165fig01.jpg"> Figuur 1: Killifish hersenkernen isolatie workflow. Experimentele workflow voor kernisolatie van bevroren of verse killifishhersenen. Eenmaal geïsoleerd en beoordeeld, kunnen kernen worden gebruikt voor verschillende downstream "omics" -analyses. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/64165fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64165/64165fig02.jpg"> Figuur 2: Beoordeling van de kwaliteit van kernen door microscopie. Kernen werden 1:1 gemengd in een oplossing van 0,4% Trypan Blue en gevisualiseerd op een Echo Revolve microscoop door brightfield imaging op 60x. (A) Een voorbeeld van een hoogwaardige kern. De kern is aanwezig als een singlet en het kernmembraan is intact. (B) Een voorbeeld van kernen van slechte kwaliteit. De nucleaire membranen zijn beschadigd en kernen klonteren in een doublet, waarschijnlijk als gevolg van lekkage van kleverig DNA, dat kan worden gezien lekkend vanaf de bovenkant van de bovenste kern. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/64165fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64165/64165fig03.jpg"> Figuur 3: Kernkwantificering en zuiverheidsbeoordeling door flowcytometrie. Kernmonsters werden gekleurd met een 1:100 verdunning van PI en uitgevoerd op een flowcytometer. Kernen zijn aanwezig in singlet- en multipletvormen in het kwadrant rechtsboven (A,B) met singlets als de laagste wolk van gebeurtenissen gevolgd door doubletten, drielingen, enz. in oplopende volgorde. Puin wordt gekenmerkt door de gebeurtenissen in de meest linkse twee kwadranten. (A) Een voorbeeld van een kernvoorbereiding van lage kwaliteit, waarbij de stap voor het verwijderen van puin werd weggelaten en puin > 40% van de gebeurtenissen uitmaakt. (B) Een voorbeeld van een hoogwaardig kernmonster, met de meegeleverde stap voor het verwijderen van puin. In dit voorbeeld vormt puin < 10% van alle gebeurtenissen die door de flowcytometer worden geregistreerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/64165fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Type monster (2 hersenen)</td>
			<td>Gemiddelde opbrengst (4 onafhankelijke preps)</td>
		</tr><tr><td>5-weekse mannelijke hersenen</td>
			<td>3,59 ± 1,76 x 105</td>
		</tr><tr><td>10-weekse mannelijke hersenen</td>
			<td>6,41 ± 1,33 x 105</td>
		</tr><tr><td>15-weekse mannelijke hersenen</td>
			<td>14,59 ± 2,05 x 105</td>
		</tr><tr><td>5-weekse vrouwelijke hersenen</td>
			<td>2,54 ± 0,75 x 105</td>
		</tr><tr><td>10-weekse vrouwelijke hersenen</td>
			<td>4,66 ± 1,29 x 105</td>
		</tr><tr><td>15-weekse vrouwelijke hersenen</td>
			<td>7,95 ± 3,51 x 105</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Gemiddelde verwachte opbrengsten van twee hersenen van Afrikaanse turquoise killifish over geslacht en leeftijd. Gemiddelde opbrengsten uitgedrukt als 105 kernen ± standaardfout van het gemiddelde over vier onafhankelijke kernpreparaten in elke categorie.
Aanvullende figuur 1: Vergelijking van de isolatiekwaliteit van kernen met behulp van standaardprotocollen en ons geoptimaliseerde protocol voor bevroren killifishhersenen. (A) Beoordeling van de kwaliteit van kernen door middel van microscopie. Kernen werden 1:1 gemengd in een oplossing van 0,4% Trypan Blue en gevisualiseerd op een microscoop door brightfield imaging bij 60x. (B) Kernen en debris load kwantificering door flowcytometrie. Kernmonsters werden gekleurd met een 1:100 verdunning van PI en uitgevoerd op een flowcytometer. (C) Samenvatting van kwaliteitsbeoordelingsmaatstaven door middel van microscopie en flowcytometrie met de verschillende gebenchmarkte protocollen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/2022-07-06_FIgure_S1_v3.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende figuur 2: Schematische weergave van de stappen voor het verwijderen van puin. (A) Schema van puinverwijdering gelaagdheid vóór centrifugatie. (B) Schema voor de verwijdering van supernatanten na centrifugatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/2022-07-06_Figure_S2_JOVE_Revision.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Hier presenteren we een protocol om kernen te isoleren uit de hersenen van het kortlevende gewervelde model Nothobranchius furzeri voor downstream toepassingen zoals single-nucleus RNA sequencing of single-nucleus assay voor transposase-toegankelijk chromatine met sequencing (ATAC-seq).

Zachte isolatie van kernen uit het hersenweefsel van volwassen Afrikaanse turquoise killivissen, een natuurlijk kortlevend model voor verouderingsonderzoek

Studying brain aging at single-cell resolution in vertebrate systems remains challenging due to cost, time, and technical constraints. Here, we ...

Dit is het eerste geoptimaliseerde protocol voor het isoleren van hoogwaardige kernen voor single-nuclei sequencing experimenten met behulp van bevroren hersenen van Afrikaanse turquoise killifish, een opkomend gewerveld model voor verouderingsonderzoek. Dit protocol isoleert kernen heel voorzichtig, wat het onderscheidt van hardere protocollen die zijn geoptimaliseerd voor andere organismen met meer gemyeliniseerde hersenen, wat resulteert in afgebroken kernen bij gebruik in de killifish. Deze methode zal ons helpen hersenveroudering op eencellig niveau te begrijpen.Het zou zich goed moeten vertalen naar andere weefsels die meer zachte kernisolatie vereisen. Dit protocol is gebruiksvriendelijk. De meest veeleisende taak is de gradiëntcentrifugatie voor het verwijderen van puin, waarbij het beter is om langzaam en nauwkeurig te zijn dan snel en rommelig.Ari Adler en Brian Teefy, een onderzoekslaboratoriumtechnicus en een postdoctoraal geleerde van het Benayoun-laboratorium, zullen de procedure demonstreren. Na het ontleden van de killifish, ontdooi het bevroren hersenweefsel op ijs gedurende 10 minuten en verdubbel de hersenen in één milliliter ijskoude kernenlysisbuffer in een twee milliliter dounce homogenisator. Houd tijdens het lozen van het monster de homogenisator op ijs en vermijd het genereren van bubbels.Verdubbel het weefsel zoals beschreven in het manuscript en laat het monster twee minuten op ijs rusten in de dounce homogenisator. Zeef vervolgens het monster door een celfilter van 70 micrometer in een conische buis van 15 milliliter, vooraf gecoat met 5% BSA. Voeg vier milliliter kernenwasbuffer toe aan het monster door de wasbuffer over het celfilter van 70 micrometer te pipetteren en meng door de buis vijf keer voorzichtig om te keren.Gebruik een zwenkbakrotor om het monster gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius op 500 G te centrifugeren. Gooi het supernatant weg door het voorzichtig in een vloeibaar afvalrecipiënt te gieten. Houd het monster rechtop en verwijder de resterende wasbuffer met een P1000-pipet.Reuspendeer de kernen onmiddellijk in één milliliter kernwasbuffer met een P1000-pipetpunt met brede boring. Breng vervolgens het monster op vijf milliliter door vier milliliter kernenwasbuffer toe te voegen en te mengen zoals eerder aangetoond. Pellet de cel door centrifugatie.Gooi het supernatant weg en resuspenseer de kernen in één milliliter kernenwasbuffer met een pipetpunt met brede boring. Breng nu de kernen over naar een flowcytometriebuis. Voeg 300 microliter puinverwijderingsoplossing toe aan de celsuspensie en meng deze grondig door te pipetteren met een punt met brede boring totdat het mengsel homogeen is.Houd de buis in een lichte hoek en leg voorzichtig een milliliter kernwasbuffer op de kernoplossing met behulp van een P1000-pipet. Centrifugeer het monster in een zwenkbakrotor bij 3000 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Gooi de bovenste twee fasen volledig weg met een P1000-pipet.Breng de onderste laag over op een conische buis van 15 milliliter, voorgecoat met 5% BSA. Breng vervolgens het volume op 15 milliliter met kernenwasbuffer en meng door de buis driemaal om te keren. Centrifugeer de buis op 1000G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius in een zwenkende emmerrotor.Verwijder het supernatant voorzichtig en resuspenseer de pellet onmiddellijk in 150 microliter kernen wasbuffer met behulp van een pipetpunt met brede boring. Schakel over naar een standaard pipetpuntset met boring op 300 microliter. Pipetteer het hele monster en bevestig vervolgens een 40-micrometer on-tip filter aan het einde van de pipetpunt.Filtreer het monster door het monster krachtig door het filter te verdrijven in een lage DNA-bindende microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Resuspendeer in een FACS-buis 10 microliter van het gefilterde kernmonster in 90 microliter van de aanbevolen flowcytometriebuffer. Kleur de monsters met propidiumjodide in een eindconcentratie van één microgram per milliliter.Nadat u de werkruimte hebt ingesteld zoals beschreven in het manuscript, start u de stroom door op het afspeelpictogram in de rechterbenedenhoek te drukken. Controleer op luchtbellen of klonten in het monster met behulp van het zijverstrooiingsgebied versus HDRT. Controleer ook de zijverstrooiing versus voorwaartse spreidingsplot om te controleren of de gebeurtenissen zich binnen de grenzen van het venster ophopen.Voor een vergrote weergave dubbelklikt u op het zijspreidingsgebied versus de perCP-Vio700-A-plot. Klik op de knop op de werkbalk linksboven met een loodrechte lijn om een kwadrantpoort te selecteren. Klik vervolgens ergens in het zijverstrooiingsgebied versus PerCP-Vio700-A-plot en er verschijnen kwadranten in het plot.Klik ergens op de kwadrantscheidingslijnen en schuif met de cursor om de plaatsing van het kwadrant te wijzigen. Plaats de kwadranten zodanig dat het kwadrant linksboven puin bevat en het kwadrant rechtsboven kernen. Klik op het vierkant, grijs, ik pictogram om het eigenschappenvenster te openen.Ga naar het tabblad regiofuncties en zorg voor een groen vinkje naast het bovenste item, dat aangeeft dat het hele perceel is geselecteerd. Klik onder de lijst met functies op telling per microliter om een groen vinkje te maken. Klik op OK en elk kwadrant geeft een telling per microliter-statistiek weer.Selecteer aantal en procenttotaal op het tabblad regiofuncties om desgewenst onbewerkte tellingen en percentages weer te geven. Teken een veelhoekige poort rond deze populatie door op de veelhoekknop op de werkbalk linksboven te klikken. Klik vervolgens op een enkele keer en schuif met de muis om een lineair segment van de poort te tekenen.Klik nogmaals om de volgende te voltooien en te beginnen, gevolgd door een dubbelklik om de poort te voltooien. Klik op de rand van de poort en schuif met de muis om de poort te verplaatsen. Klik op de hoekpunten van de poort om de vorm te wijzigen en er verschijnen tellingen per microliter van de gated populatie.Gezonde kernen die verschenen als singletkernen met intacte membranen zijn geschikt voor stroomafwaartse analyse. Ongezonde kernen worden echter gekenmerkt door beschadigde kernmembranen, wat leidt tot klonteren van kernen en kan bijdragen aan achtergrondsignalen in downstream-toepassingen. Kernen zijn in singlet- en multipletvormen in het kwadrant rechtsboven, met singlets als de laagste wolk van gebeurtenissen gevolgd door doubletten en drielingen in oplopende volgorde.Puin wordt gekenmerkt door gebeurtenissen in de twee meest linkse kwadranten in een kernpreparaat van lage kwaliteit waarbij de stap voor het verwijderen van puin werd weggelaten. Puin maakt meer dan 40% van de gebeurtenissen uit. In een hoogwaardig experiment maakt puin echter minder dan 15% van alle gebeurtenissen uit.Het is absoluut noodzakelijk om de middelste laag volledig te verwijderen na de centrifugatiestap voor het verwijderen van puin om het vervuilen van achtergrond-RNA te verminderen Nuclei geïsoleerd met behulp van dit protocol kunnen worden gebruikt voor single-nuclei RNA-sequencing of ATAC-sequencing om transcriptomische en epigenetische informatie op eencellig niveau te verkrijgen. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om hersengenregulatie op eencellig niveau te onderzoeken in de Afrikaanse turquoise killifish, een van nature kortlevend gewerveld modelorganisme voor verouderingsonderzoek.

gentle-isolation-nuclei-from-brain-tissue-adult-african-turquoise

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This protocol describes the technique of isolating fluorescently labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) tumor cells from an adult zebrafish and quantifying them using trypan blue dye.

Fluorescently Labeled T-ALL Cells Isolation: A Method to Isolate T-ALL Cells from Adult Zebrafish

This video describes a protocol to isolate neurons, macrophages, and microglia from larval zebrafish brains by mechanically disrupting the brain tissue. The purified cell populations can further be used for genomic analysis.

Brain Cell Isolation from Zebrafish Larvae: A Technique to Obtain Intact Neurons, Macrophages, and Microglia from Zebrafish Brain Tissue

Om licht te werpen op de cellulaire en moleculaire mechanismen van neurogenese en regeneratie bij volwassen zebravissen, ontwikkelden we een protocol voor invasieve chirurgie dat mechanische verwondingen veroorzaakt in het volwassen telencephalon van de zebravis en daaropvolgend bewaken van veranderingen in de 'gestoken' hemisfeer door middel van immunohistochemie of in situ hybridisatie.

Steekwond Letsel van de zebravis Adult Telencephalon: Een methode om Onderzoek gewervelde Brain Neurogenese and Regeneration

Hier hebben wij een reproduceerbare werkwijze voor volwassenen neurogenese onderzocht onder toepassing van een assay neurosphere afgeleid van de gehele hersenen of van ofwel de telencephalic, tectal of cerebellaire gebieden van de volwassen hersenen zebravis. Daarnaast beschrijven we de procedure om genexpressie te manipuleren in zebravis neurosferen.

Isolatie en cultuur van de Adult zebravis Brain-afgeleide Neurosferen

Dit protocol beschrijft de synthese, karakterisering en injectie van monomeer amyloid-β42 peptiden voor het genereren van amyloïde toxiciteit in volwassen zebrafish om een model van de ziekte van Alzheimer, gevolgd door histologische analyses en detectie van samenvoegingen.

Modelleren van Amyloid-β42 toxiciteit en neurodegeneratie in volwassen Zebrafish hersenen

Het belangrijkste doel van deze studie was aan te passen de naald ondergedompeld verglazing (NIV) procedure om te cryopreserve hele zebrafish teelballen. Daarnaast is de herhaalbaarheid van de methode in vijf verschillende zebrafish stammen was getest.

Cryopreservatie van zebravis testis van hele Testes Needle ondergedompeld Ultra snelle koeling

Laboratorium behuizing van turkoois poolfish kan worden opgeschaald naar huis en duizenden afzonderlijke vissen efficiënt te verhogen in een gecentraliseerde water filtratie-systeem, met dezelfde infrastructuur gebruikt voor standaard zebrafish faciliteiten. Hier detail we een aantal gestandaardiseerde procedures waarmee efficiënte poolfish onderhoud.

Een Protocol voor het laboratorium huisvesting van Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

We presenteren een protocol om te isoleren van neuronen, macrofagen en microglia van larvale zebrafish hersenen onder fysiologische en pathologische omstandigheden. Op isolatie, wordt RNA gewonnen uit deze cellen te analyseren hun genexpressie profiel. Dit protocol voorziet voor de verzameling van kwalitatief hoogwaardige RNA downstream analyse zoals qPCR en transcriptomics uitvoeren.

Isolatie en RNA extractie van neuronen, macrofagen en Microglia van larvale Zebrafish hersenen

Hier presenteren we een protocol voor eenvoudige isolatie van specifieke groepen van levende neuronale cellen die groen fluorescerende eiwitten uit transgene Caenorhabditis elegans lijnen uitdrukken. Deze methode maakt een verscheidenheid van ex vivo studies gericht op specifieke neuronen en heeft de capaciteit om cellen te isoleren voor verdere korte termijn culturing.

Isolatie van specifieke neuron populaties van Roundworm Caenorhabditis elegans

Enkele kernisolatie is afhankelijk van dissociatie en detergent-gebaseerde permeabilisatie van het celmembraan, stappen die optimalisatie nodig hebben en gevoelig zijn voor de invoering van technische artefacten. We demonstreren een wasmiddel- en enzymvrij protocol voor snelle isolatie van intacte kernen rechtstreeks uit hele weefsel, wat kernen oplevert die geschikt zijn voor single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) of ATAC-seq.

Nuclei isolatie van hele weefsel met behulp van een wasmiddel en enzym-vrije methode

Hier presenteren we een methode om de zebravis embryonale hersenen in vivo tot larvale en juveniele stadia in beeld te brengen. Deze microinvasieve procedure, aangepast aan elektrofysiologische benaderingen, biedt toegang tot cellulaire en subcellulaire details van volwassen neuronen en kan worden gecombineerd met optogenetica en neurofarmacologische studies voor het karakteriseren van hersenfunctie en medicamenteuze interventie.

In vivo beeldvorming van volledig actief hersenweefsel in wakkere zebravislarven en juvenielen door schedel- en huidverwijdering

Leer een zachte isolatiemethode voor kernen uit hersenweefsel van Nothobranchius furzeri, een kortlevend model voor verouderingsonderzoek. Dit protocol maakt single-nucleus RNA-sequencing en ATAC-seq mogelijk.

Zachte isolatie van kernen uit het hersenweefsel van volwassen Afrikaanse turquoise killivissen, een natuurlijk kortlevend model voor verouderingsonderzoek (Video) | JoVE Journal

Zachte isolatie van kernen uit het hersenweefsel van volwassen Afrikaanse turquoise killivissen, een natuurlijk kortlevend model voor verouderingsonderzoek

Meer video's verkennen